張清安，張馨允，馮郁藺，史芳芳

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甜杏仁分離蛋白的組成及部分理化特性

張清安，張馨允，馮郁藺，史芳芳

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

【目的】明確甜杏仁分離蛋白的相關(guān)理化性質(zhì)，研究蛋白質(zhì)性質(zhì)變化與產(chǎn)品加工特性間的關(guān)系，開發(fā)高質(zhì)量的甜杏仁產(chǎn)品?！痉椒ā客ㄟ^堿溶酸沉法制得甜杏仁粗蛋白，經(jīng)Osborne分級(jí)法制備分離蛋白—清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，利用全自動(dòng)氨基酸分析儀、環(huán)境電子掃描顯微鏡（ESEM）、圓二色光譜（CD）、差示掃描量熱法（DSC）、熱重法（TGA）及流變儀等，研究甜杏仁分離蛋白的氨基酸組成、表面形態(tài)特征、二級(jí)結(jié)構(gòu)、熱性質(zhì)及流變性，并擬合出溫度與分離蛋白黏度間的線性方程，計(jì)算其活化能a及頻率因子0?！窘Y(jié)果】甜杏仁4種分離蛋白的氨基酸組成豐富，含有17種人體所需的氨基酸，包括8種必需氨基酸（含組氨酸），谷氨酸含量最多；清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白表觀結(jié)構(gòu)較為緊密，呈聚集態(tài)，而谷蛋白則表現(xiàn)為松散、多孔的片狀；分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分子構(gòu)象中，α-螺旋及無規(guī)則卷曲占主要部分。由DSC結(jié)果可知清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的熱變性溫度分別為62.84、72.98、78.33和45.70℃，熱穩(wěn)定性關(guān)系為：醇溶蛋白＞球蛋白＞清蛋白＞谷蛋白，結(jié)合DSC與ESEM可知聚集程度為：清蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白＞谷蛋白。4種甜杏仁分離蛋白的溶液均屬于非牛頓流體，其黏度與溫度符合阿累尼烏斯（Arrhenius）指數(shù)方程，能夠很好地對(duì)實(shí)際情況進(jìn)行擬合，可運(yùn)用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)?！窘Y(jié)論】甜杏仁分離蛋白可作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白來源，本研究結(jié)果對(duì)甜杏仁蛋白質(zhì)產(chǎn)品的開發(fā)具有參考意義，有利于在產(chǎn)品開發(fā)及生產(chǎn)加工過程中對(duì)含蛋白產(chǎn)品的功能及品質(zhì)進(jìn)行控制，提高其附加值進(jìn)而促進(jìn)甜杏仁產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

甜杏仁；分離蛋白；氨基酸；熱性質(zhì)；流變性

0 引言

【研究意義】杏仁（）是薔薇科李屬植物—杏的種子[1]，在中國西北、華北、東北一帶均有大面積種植，栽培歷史悠久。杏仁是一種具有高營養(yǎng)價(jià)值的特色作物，作為一種健康食品，已被證實(shí)能夠有效預(yù)防心血管疾病、促進(jìn)人體新陳代謝[2]。杏仁中油脂含量約為50.0%[3]，富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸[4]，蛋白質(zhì)含量為22.4%—29.3%[5]，杏仁中約15%的能量來源于高質(zhì)量的蛋白質(zhì)[6]，可作為日常飲食中蛋白質(zhì)的良好來源[7]。根據(jù)杏仁中苦杏仁苷的含量，可將其分為苦杏仁和甜杏仁兩種；苦杏仁多用于提取香味物質(zhì)、制備蛋白飲料和止咳口服液；而甜杏仁由于苦杏仁苷含量較低，因此一直被當(dāng)做原料或輔料用于食品中，是很多傳統(tǒng)飲食的營養(yǎng)來源[1]。根據(jù)王淑英等[8]的研究，甜杏仁中的蛋白質(zhì)含量（30.1%）高于瓜籽仁（19.1%）、松仁（12.6%）、核桃仁（22.0%）及花生仁（27.1%）中的蛋白質(zhì)含量，且氨基酸種類齊全，其中8種必需氨基酸（不包括色氨酸）占總氨基酸的32.0%—34.0%[9]，接近FAO/WHO在1973年修正的標(biāo)準(zhǔn)模式譜。另外，甜杏仁中微量元素硒的含量也較為豐富，高達(dá)27.6 μg/100 g，具有護(hù)肝、提高機(jī)體免疫力等作用[8]。甜杏仁已成為中國出口創(chuàng)匯率較高的土特產(chǎn)品之一[10]，中國“三北”地區(qū)所種植的‘龍王帽’‘白玉扁’‘一窩蜂’等品種均屬于甜杏仁，也稱大扁杏，產(chǎn)量不斷增加，但在深加工方面鮮有報(bào)道。在食品開發(fā)及加工過程中，蛋白質(zhì)的功能特性會(huì)對(duì)產(chǎn)品最終品質(zhì)產(chǎn)生較大影響[11]，因此，有必要對(duì)甜杏仁分離蛋白理化特性——尤其是二級(jí)結(jié)構(gòu)、熱性質(zhì)及流變性等作深入研究，從而科學(xué)地了解其加工特性，合理優(yōu)化加工工藝參數(shù)、減少營養(yǎng)品質(zhì)損失以及提升其附加值。同時(shí)，也為拓寬甜杏仁深加工產(chǎn)業(yè)、開發(fā)蛋白質(zhì)資源等方面提供技術(shù)支撐和參考。【前人研究進(jìn)展】甜杏仁蛋白質(zhì)由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成，其中以清蛋白為主，含量高達(dá)45.76%，球蛋白約占40.32%，其余為谷蛋白與醇溶蛋白[12-13]。目前，對(duì)分離蛋白的研究集中于大豆分離蛋白，主要是對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)[14]及改性生物膜[15]等方面的研究，張逸婧等[16]還研究了CMC-Na對(duì)大豆分離蛋白的零切黏度、圓二色性及表面疏水性的影響，而對(duì)杏仁分離蛋白的報(bào)道很少，且主要集中于對(duì)其提取工藝的優(yōu)化[17]及其功能性質(zhì)的研究[11-18]。與大豆分離蛋白相比，甜杏仁分離蛋白不僅吸油性、吸水性優(yōu)于大豆分離蛋白，且因其表面疏水性指數(shù)（S0=164.86）高于大豆分離蛋白（S0=5.57），從而使其具有良好的乳化性，且在高濃度下仍能保持較低的黏度[15]，比較有利于高蛋白制品的穩(wěn)定性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甜杏仁分離蛋白具有與大豆分離蛋白同等重要的開發(fā)及應(yīng)用前景，但目前對(duì)甜杏仁分離蛋白理化特性，特別是其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成、熱性質(zhì)及流變性等與加工密切相關(guān)的特性，未見研究報(bào)道，極大制約了甜杏仁產(chǎn)品的開發(fā)及其生產(chǎn)加工過程中品質(zhì)的有效控制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以甜杏仁為研究對(duì)象，采用現(xiàn)代食品分析技術(shù)，全面、系統(tǒng)地對(duì)4種甜杏仁分離蛋白的理化特性進(jìn)行研究與分析，加深對(duì)甜杏仁產(chǎn)品的組分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分子形態(tài)的認(rèn)識(shí)，為產(chǎn)品在加工及儲(chǔ)藏過程中的品質(zhì)變化與控制提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年7月至2016年5月在陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 主要的試劑與儀器 氫氧化鈉（天津市化學(xué)試劑六廠）、無水乙醇（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）、石油醚（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）、鹽酸（西安化學(xué)試劑廠）、三羥甲基氨基甲烷（上海山浦化工有限公司）、氯化鈉（天津市博迪化工有限公司）均為分析純。

JA2003N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FZ102微型植物粉粹機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；3k30超高速低溫離心機(jī)，美國Sigma公司；DL-4C低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-18C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITACHI公司；Quanta 200環(huán)境電子掃描顯微鏡，Philips-FEI Company，Amsterdam，Netherlands；Chirascan圓二色光譜儀，英國應(yīng)用光物理公司；Q1000DSC+LNCS+ FACS Q600SDT熱分析系統(tǒng)，美國TA公司；AR-G2型流變儀，美國TA公司。

1.1.2 樣品 甜杏仁分離蛋白制備見圖1。

甜杏仁購自陜西省榆林市榆陽區(qū)，杏仁品種為‘龍王帽’。將杏仁洗凈去雜質(zhì)，料液比1﹕4（g?mL-1）于100℃水中放置4 min去皮，用清水沖洗干凈后[19]，于40℃烘箱烘干，粉碎至60目；石油醚脫脂，脫出有機(jī)溶劑后取脫脂粉末，甜杏仁粗蛋白的提取參考Zheng等[20]的方法并略作改動(dòng)，樣品于4℃保存?zhèn)溆谩＠肙sborne分級(jí)法[13]制備甜杏仁分離蛋白，具體如圖1所示。將上清液I、II、III和IV分別用去離子水在4℃透析72 h（透析袋相對(duì)分子質(zhì)量截留量：8 000—14 000），再分別于4℃、8 000 r/min離心，收集沉淀，冷凍干燥，依次制得甜杏仁的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，采用半微量凱式定氮法[13]測(cè)定出4種分離蛋白的含量：清蛋白55.0%、球蛋白37.4%、醇溶蛋白1.6%和谷蛋白6.0%。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸組成測(cè)定 參照GB/T 5009.124—2003，分別對(duì)4種樣品進(jìn)行處理，用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)樣品液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 表面形態(tài)特征觀測(cè) 取樣品適量，平鋪較薄一層于已貼好靜電紙的座臺(tái)上，以保證視野清晰，在電壓20 kV、15 Pa低真空模式下，用環(huán)境電子掃描顯微鏡（ESEM）觀察分離蛋白在500倍、1 000倍及2 500倍下的表面形態(tài)特征。

圖1 Osborne分級(jí)法制備甜杏仁分離蛋白

1.2.3 分子構(gòu)象的圓二色光譜（CD）測(cè)定 分別配制0.08 mol?L-1的樣品溶液，用光徑為0.1 cm的比色皿，在遠(yuǎn)紫外區(qū)190—260 nm范圍內(nèi)測(cè)定分離蛋白的圓二色性，研究其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 熱性質(zhì)研究 用差示掃描量熱儀（DSC）研究分離蛋白的熱性質(zhì)，使樣品在20℃時(shí)保持1 min，在20—140℃掃描樣品，升溫速率10℃?min-1，氮?dú)饬魉?0 mL?min-1，測(cè)定分離蛋白的熱變性溫度。熱重法（TGA）：將冷凍干燥的樣品從0℃加熱至700℃，升溫速率10℃?min-1，氮?dú)饬魉?0 mL?min-1，研究分離蛋白的質(zhì)量與溫度間的關(guān)系。

1.2.5 流變特性研究 配制0.5 mg?mL-1的樣品溶液，采用AR-G2流變儀的同心圓筒裝置進(jìn)行流變特性測(cè)定，分別在10、20、30、40、50、60℃下測(cè)定剪切速度對(duì)分離蛋白剪切應(yīng)力的影響；再于20℃下測(cè)定蛋白質(zhì)在剪切速率為0.1—1 000 s-1范圍內(nèi)的黏度；研究溫度與黏度的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸組成

由表1可知，4種分離蛋白的氨基酸含量豐富，種類齊全，均含有17種人體所需氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸（含組氨酸）。所含的氨基酸中谷氨酸的含量最高，其次為天冬氨酸和精氨酸，尤其在球蛋白中這3種氨基酸的含量均高于其余3種分離蛋白中所含有的量。其中，谷氨酸與天冬氨酸為鮮味氨基酸[21]，且谷氨酸的鮮味很強(qiáng)，這也是甜杏仁口感及風(fēng)味良好、深受消費(fèi)者青睞的原因之一；而蛋氨酸在4種分離蛋白中的含量均為最低，需要指出的是，雖然甜杏仁分離蛋白中蛋氨酸的含量較低，但可由蛋氨酸轉(zhuǎn)變而成的半胱氨酸的含量相對(duì)較高，因此，可在一定程度上節(jié)省蛋氨酸在轉(zhuǎn)化過程中的消耗，更多地供人體吸收利用。

表1 蛋白質(zhì)氨基酸組成

*表示必需氨基酸 * Essential amino acids

2.2 表面形態(tài)特征

鑒于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)會(huì)受其聚集狀態(tài)的影響，因此對(duì)甜杏仁4種分離蛋白的表觀形態(tài)進(jìn)行環(huán)境電鏡掃描，分別在500、1 000及2 500三種不同的倍數(shù)下進(jìn)行，結(jié)果如圖2所示。由圖2可看出不同分離蛋白的聚集形態(tài)存在較大差異，由500倍下的掃描圖不易判斷出各分離蛋白的聚集形態(tài)；通過1 000倍下的掃描圖可知，清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白顯示為較緊密的結(jié)構(gòu)，而谷蛋白的結(jié)構(gòu)較為松散；再由2 500倍掃描圖可清晰地看出，清蛋白與球蛋白的表觀形態(tài)特征比較相似，均表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)較為緊密，類似球狀聚集態(tài)，但大小不夠均一，構(gòu)象也無規(guī)則，醇溶蛋白表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)致密的纖維狀結(jié)構(gòu)，而谷蛋白則表現(xiàn)為多孔的片狀結(jié)構(gòu)。

2.3 圓二色譜

甜杏仁4種分離蛋白的圓二色譜圖如圖3所示，利用CD Pro軟件對(duì)圖譜進(jìn)行計(jì)算，得出分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量（表2）。雖然4種分離蛋白的分子構(gòu)象存在一定的差異，但可看出α-螺旋與無規(guī)則卷曲是甜杏仁分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要構(gòu)成部分，4種分離蛋白中有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角）所占的比例分別為：清蛋白67.80%，球蛋白66.80%，醇溶蛋白69.00%，谷蛋白67.50%?？芍?，分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性為：醇溶蛋白＞清蛋白＞谷蛋白＞球蛋白。

圖2 甜杏仁分離蛋白的環(huán)境掃描電鏡圖

圖3 4種分離蛋白的圓二色圖譜

2.4 分離蛋白熱性質(zhì)分析

2.4.1 差示掃描量熱曲線（DSC） 蛋白質(zhì)從天然狀態(tài)到變性狀態(tài)往往伴隨著焓變，DSC通過測(cè)量蛋白質(zhì)在變性過程中能量的變化來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的熱力學(xué)性質(zhì)。由圖4中4種DSC曲線最大峰值所對(duì)應(yīng)的溫度及峰面積可知，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的熱變性溫度（Td）分別為62.84℃、72.98℃、78.33℃和45.70℃，焓變值（ΔH）分別為122.3、80.54、124.1和35.31 J?g-1。根據(jù)TANG等[22]的研究，Td能夠反映出分離蛋白的熱穩(wěn)定性，ΔH則表示蛋白質(zhì)變性所需的熱量，能夠反映出樣品中變性蛋白的比例，ΔH越大，有序結(jié)構(gòu)的含量越多，變性程度越小，分離蛋白的聚集程度就越高。因此，4種分離蛋白的熱穩(wěn)定性為：醇溶蛋白＞球蛋白＞清蛋白＞谷蛋白；聚集程度：清蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白＞谷蛋白。

表2 甜杏仁分離蛋白的分子構(gòu)象

2.4.2 熱重分析法（TGA） TGA是在程序升溫的條件下，測(cè)量物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度變化的一種熱分析方法，提供了待測(cè)樣品的水分含量、水化程度、分解溫度及樣品的熱信息及組成[23]。由圖5可知，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白與谷蛋白的TGA曲線均可分為3個(gè)主要的階段，第一和第三階段的質(zhì)量損失較小，第二階段分離蛋白的失重明顯，尤其是清蛋白，其在該階段的重量損失最大，熱解最為充分。一般來說，第一階段主要是少量自由水蒸發(fā)及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，構(gòu)象發(fā)生變化；第二階段是熱分解階段，蛋白質(zhì)晶體中的水也開始損失，且羥基基團(tuán)被破壞，是樣品質(zhì)量損失最多的一個(gè)階段；第三階段是一些其他雜質(zhì)發(fā)生降解[24]。除了醇溶蛋白熱分解的過程還可細(xì)化為兩個(gè)小的階段外，其作3種分離蛋白質(zhì)的TGA曲線趨勢(shì)大致相同，由于各分離蛋白的組成不同，導(dǎo)致其熱損失的速率也不同，一般來說，蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化還與蛋白質(zhì)的含水量、分子間的相互作用力以及聚集態(tài)有很大關(guān)系[25]。

圖4 分離蛋白的DSC曲線

圖5 分離蛋白的TGA曲線

2.5 流變性

2.5.1 剪切速率對(duì)剪切應(yīng)力的影響 圖6所示為10、20、30、40、50和60℃下分離蛋白剪切應(yīng)力與剪切速率間的關(guān)系。對(duì)比4種分離蛋白的流變特性可知，在相同的溫度及剪切速率下，醇溶蛋白的剪切應(yīng)力明顯大于其他3種分離蛋白的，且在10℃和20℃的溫度條件下，醇溶蛋白的剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化表現(xiàn)出更加迅速的增長(zhǎng)趨勢(shì)?？傮w上看，當(dāng)溫度相同時(shí)，4種分離蛋白的剪切應(yīng)力均隨著剪切速率的增加而增大；而隨著溫度的上升，相同剪切速率下分離蛋白的剪切應(yīng)力逐漸減小。另外，剪切速率與剪切應(yīng)力呈非線性關(guān)系，據(jù)此可判定甜杏仁分離蛋白溶液為非牛頓流體[26]，且在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)（10—60℃），分離蛋白的流體類型沒有發(fā)生改變。

圖6 不同溫度下分離蛋白的流變特性

2.5.2 剪切速率對(duì)分離蛋白黏度的影響 由圖7可知，當(dāng)剪切速率在0.1—1 s-1范圍內(nèi)變化時(shí)，隨剪切速率的增加，4種分離蛋白的黏度均呈先升高后緩慢降低的變化趨勢(shì)，因?yàn)樵诩羟兴俾瘦^小時(shí)，分離蛋白的剪切應(yīng)力也較小，溶液中分離蛋白與水分子間的相互作用以及蛋白質(zhì)間的相互作用使得黏度較大，之后隨著剪切速率變大，剪切應(yīng)力也逐漸增大，剪切應(yīng)力破壞了分子間的作用力，從而使黏度降低[27]。當(dāng)剪切速率在0.1—10 s-1范圍內(nèi)變化時(shí)，分離蛋白的黏度在經(jīng)過初始階段的波折變化后越來越趨于平穩(wěn)，不再隨著剪切速率的變化而發(fā)生大的改變，且在相同的剪切速率下，醇溶蛋白的黏度很明顯地高于其他3種分離蛋白的黏度，可能與醇溶蛋白的致密結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。當(dāng)剪切速率大于10 s-1后，4種分離蛋白的黏度均不再有大的波動(dòng)變化，說明分離蛋白的溶液正逐漸趨于一個(gè)均勻、穩(wěn)定的體系。

圖7 甜杏仁分離蛋白的黏度與剪切速率關(guān)系

2.5.3 溫度對(duì)分離蛋白黏度的影響 圖8以溫度的倒數(shù)1/T作為橫坐標(biāo)，以黏度的對(duì)數(shù)ln(η)作為縱坐標(biāo)，研究溫度與分離蛋白黏度間的關(guān)系，由圖8可知，4種分離蛋白的黏度均隨著溫度的升高而降低，因?yàn)闇囟鹊纳呒铀倭朔肿娱g的熱運(yùn)動(dòng)，同時(shí)，溶液的體積膨脹，蛋白質(zhì)分子的平均動(dòng)能增大，從而使分離蛋白溶液的黏度降低。在相同溫度條件下，醇溶蛋白的黏度始終大于其余3種分離蛋白溶液的黏度，但其黏度隨溫度變化的規(guī)律與其他3種分離蛋白的一致。圖8中1/T與ln(η)呈線性關(guān)系，可分別得出4種分離蛋白黏度與溫度間的線性方程，列于表3，可知各方程的相關(guān)系數(shù)2均在0.99左右，表明本研究的實(shí)測(cè)值與理論值有較好的一致性。可知甜杏仁分離蛋白黏度隨溫度的變化符合阿累尼烏斯（Arrhenius）指數(shù)方程[28]：

式中，—黏度（Pa?s），—流動(dòng)活化能（kJ?mol-1），—?dú)怏w常數(shù)（8.315 J?K-1?mol-1），—溫度值（K），0—頻率因子。

根據(jù)表3中線性方程的斜率及截距，通過線性擬合Arrhenius方程的斜率（-a/）及截距（ln0），即可計(jì)算出分離蛋白的活化能a及頻率因子0，結(jié)果如表4所示，可看出4種分離蛋白的活化能均處于較低水平，且與頻率因子相互補(bǔ)償。其中醇溶蛋白的活化能最大，為15.46 kJ?mol-1，表明醇溶蛋白的黏度對(duì)溫度變化的敏感程度高于清蛋白、球蛋白和谷蛋白對(duì)溫度的敏感程度[29]，但從總體上來看，甜杏仁分離蛋白的黏度對(duì)溫度的變化較不敏感，即在溫度發(fā)生變化時(shí)，甜杏仁蛋白質(zhì)的黏度不會(huì)發(fā)生劇烈變化。

表3 溫度與黏度的線性方程

表4 分離蛋白的活化能和頻率因子

3 討論

甜杏仁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白經(jīng)Osborne分級(jí)法制備而得，4種分離蛋白相對(duì)比例分別為：55.0%、37.4%、1.6%和6.0%，與El-Aal等[12]和李新華等[13]的研究結(jié)果基本一致，雖然受到杏仁品種間差異的影響，使得每種分離蛋白所占的相對(duì)比例在數(shù)值上不能達(dá)到完全一致，但結(jié)果均顯示為清蛋白所占的相對(duì)比例最大，其次是球蛋白和谷蛋白，而醇溶蛋白所占的相對(duì)比例最小。

本研究所得甜杏仁分離蛋白氨基酸的組成結(jié)果稍微低于Femenia等[9]的研究結(jié)果，因?yàn)椴煌墨I(xiàn)中所用杏仁的品種不同，導(dǎo)致所得結(jié)果具有一定的差異；但甜杏仁中谷氨酸的含量最豐富而蛋氨酸含量最低的結(jié)果與Femenia等[9]、李翠芹等[30]的研究相一致。同時(shí)，需要強(qiáng)調(diào)的是，本文是采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)氨基酸進(jìn)行的測(cè)定，故表1中未列出各分離蛋白中色氨酸的含量，但Adu等[31]的研究顯示，印度杏仁中色氨酸的含量為0.16 g/100g。根據(jù)本文對(duì)甜杏仁氨基酸的研究，不能判斷出色氨酸在4種分離蛋白中的具體含量。但不可否認(rèn)的是，甜杏仁分離蛋白中的氨基酸含量豐富，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中8種必需氨基酸（包括組氨酸）依次占總氨基酸的27.90%、30.30%、32.32%和29.19%，與Femenia等[9]的研究結(jié)果比較接近。在制備ESEM樣品的過程中，涉及了超聲波、脫水干燥以及酸堿處理等步驟，這些處理方式可能會(huì)在一定程度上對(duì)分離蛋白形態(tài)及構(gòu)象造成影響，且在不同倍數(shù)下進(jìn)行ESEM掃描時(shí)，隨機(jī)選取的掃描部位也會(huì)影響蛋白質(zhì)的表面形態(tài)特征，因此很難通過ESEM圖像準(zhǔn)確地判斷出各分離蛋白的聚集程度。ESEM圖像顯示甜杏仁清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白的聚集程度較高，而谷蛋白呈現(xiàn)為多孔的松散狀。因此，通過ESEM圖像僅能確定谷蛋白的聚集程度最低，而不能判斷出清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白的聚集程度，通過DSC對(duì)分離蛋白熱性質(zhì)進(jìn)行的研究，可根據(jù)焓變值（ΔH）明確地判斷出分離蛋白的聚集程度。4種甜杏仁分離蛋白圓二色圖譜的變化規(guī)律基本一致，在190 nm附近的正峰表示β-折疊結(jié)構(gòu)，205—220 nm的負(fù)槽是α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型表征，220 nm后出現(xiàn)的微弱正峰表示無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，符合蛋白質(zhì)的圓二色性[32-33]。王辰等[34]對(duì)大豆分離蛋白的研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性與其二級(jí)結(jié)構(gòu)分子構(gòu)象中α-螺旋結(jié)構(gòu)所占的比例呈負(fù)相關(guān)，與β-折疊及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占的比例呈正相關(guān)，而表面疏水性與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)如黏度、凝膠性等均有很大關(guān)聯(lián)[35-36]，通過本文對(duì)甜杏仁分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，有助于對(duì)其相關(guān)性質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

通過對(duì)圓二色性的研究可知，4種分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序程度為：醇溶蛋白＞清蛋白＞谷蛋白＞球蛋白，可見該結(jié)果與DSC得出的分離蛋白熱穩(wěn)定性的結(jié)果并未達(dá)到完全一致。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是其各結(jié)合力發(fā)生綜合效應(yīng)的一個(gè)體現(xiàn)，除了受α-螺旋結(jié)構(gòu)的影響，還與蛋白質(zhì)的氫鍵、鹽鍵、共價(jià)鍵的穩(wěn)定以及疏水作用等有很大的關(guān)聯(lián)性[37]。因此，圓二色性作為二級(jí)結(jié)構(gòu)的表觀，其結(jié)果與熱穩(wěn)定性結(jié)果未能達(dá)到完全一致屬于正?，F(xiàn)象，且從大體上看，除球蛋白的排序存在差異外，其余3種分離蛋白的熱穩(wěn)定性排序均與二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性一致。由DSC結(jié)果還可看出，分離蛋白的聚集程度與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性也不一致。雖然二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性在一定程度上決定蛋白質(zhì)的聚集程度，但分離蛋白的聚集程度還受其三級(jí)結(jié)構(gòu)與四級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，尤其是二硫鍵，它對(duì)杏仁分離蛋白熱聚集的影響大于氫鍵和離子鍵[38]。DSC結(jié)果還表明了谷蛋白的變性溫度最低，為45.70℃，即對(duì)甜杏仁蛋白質(zhì)進(jìn)行熱處理的過程中，只要溫度達(dá)到45.70℃，則谷蛋白開始變性，而當(dāng)加工溫度大于78.33℃時(shí)，4種分離蛋白均發(fā)生變性。因此，在生產(chǎn)加工的過程中應(yīng)有效控制加工溫度，以達(dá)到產(chǎn)品品質(zhì)所需的要求。根據(jù)TGA結(jié)果可知，分離蛋白在熱分解階段的失重最為明顯，因?yàn)樵撾A段主要是分離蛋白晶體中的水開始損失，且羥基基團(tuán)也被破壞，而醇溶蛋白熱解的第二階段還可細(xì)化為兩個(gè)小的階段，可能是因其具有較為緊密的聚集狀態(tài)。當(dāng)剪切速率在10—100 s-1范圍內(nèi)時(shí)，分離蛋白的黏度均呈現(xiàn)出較平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，因此，在與甜杏仁蛋白相關(guān)的流體產(chǎn)品的加工過程中，可將剪切速率控制在10—100 s-1范圍內(nèi)，使蛋白質(zhì)的整體黏度處于較低且較平穩(wěn)的水平，進(jìn)而增加體系的流動(dòng)性和穩(wěn)定性。通過對(duì)甜杏仁分離蛋白流變性的研究可發(fā)現(xiàn)，無論是不同溫度下剪切速率對(duì)分離蛋白剪切應(yīng)力的影響、相同溫度下剪切應(yīng)力對(duì)分離蛋白黏度的影響，還是溫度對(duì)分離蛋白黏度的影響，結(jié)果均顯示為清蛋白、球蛋白和谷蛋白的流變性具有高度的相似性，而醇溶蛋白總是顯現(xiàn)出較特殊的流變特性，如在相同溫度及剪切速率下具有高的剪切應(yīng)力和黏度，這些現(xiàn)象均已通過分離蛋白a值的結(jié)果得到合理的解釋，因?yàn)樵谔鹦尤实姆蛛x蛋白中，醇溶蛋白的活化能最高，因而導(dǎo)致其黏度對(duì)溫度的敏感程度最大，在相同的溫度和剪切速率下?lián)碛休^高的黏度。

4 結(jié)論

甜杏仁分離蛋白的氨基酸種類豐富，鮮味氨基酸所占比重大；清蛋白與球蛋白作為甜杏仁蛋白質(zhì)的主要成分，顯示為緊密的聚集態(tài)；在分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，球蛋白的無序結(jié)構(gòu)（無規(guī)則卷曲）所占的比例最大，為33.80%；谷蛋白的熱變性溫度最低，為45.70℃；甜杏仁分離蛋白的剪切應(yīng)力隨剪切速率的增加而增加，當(dāng)剪切速率在10—100 s-1范圍內(nèi)時(shí)，黏度幾乎不發(fā)生變化；4種分離蛋白的a值較低，與其變性溫度較低的現(xiàn)象相呼應(yīng)。綜上所述，甜杏仁分離蛋白可作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源，只要對(duì)其加工、貯藏及運(yùn)輸?shù)冗^程中的條件進(jìn)行優(yōu)化控制，則可減少資源的浪費(fèi)，促進(jìn)甜杏仁產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Compositions and Physicochemical Properties of Sweet Almond Isolate Proteins

ZHANG QingAn, ZHANG XinYun, FENG YuLin, SHI FangFang

(School of Food Engineering and Nutrition Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119)

【Objective】The aim of this study is to investigate the physical and chemical properties of sweet almond albumin, globulin, gliadin and glutelin. The relationship between the change of protein’s properties and product processing features was also studied to promote the development of high-quality sweet almond products. 【Method】Alkali-solution and Acid-isolation was employed upon the skimmed sweet almond to extract crude protein, and, subsequently, Osborne classification method was adopted to extract the albumin, globulin, gliadin and glutelin. The amino acid composition was determined by Automatic Amino Acid Analyzer. ESEM was used to observe the morphological characteristics of above mentioned proteins; CD spectra scanning was utilized to measure its secondary structure; thermal properties were determined by using DSC and TGA; Rheometer was applied to determine the influence of shear rate, moreover, the linear equation between temperature and viscosity of proteins was determined, and, therefore, the value ofa and0could be calculated.【Result】Various amino acids were detected in isolated proteins derived from sweet almond, containing 17 kinds of amino acids which the human need. It should be noticed that eight kinds of essential amino acids (including histidine) are completely embraced, among which the content of glutamic acid is the highest. Albumin, globulin and gliadin show a state of close aggregation structure, while glutelin shows a state of loose and porous plate. As for the constitution of the secondary structure, alpha helix and random curl are dominant in the isolated proteins compared with other forms of secondary structures. The denaturation temperatures for albumin, globulin, gliadin and glutelin are 62.84, 72.98, 78.33 and 45.70℃, respectively. Therefore, the thermal stability should coincide with the following order: gliadin ＞ globulin ＞ albumin ＞ glutelin. Combined DSC with ESEM, the aggregation degree should conform to the following order: albumin ＞ gliadin ＞globulin ＞ glutelin protein. The aqueous solution of the four kinds of isolated proteins derived from sweet almond are non-newtonian fluid and, furthermore, the relationship between temperature and viscosity is conform to the Arrhenius index equation, and the linear equation matches the parameters in processing well.【Conclusion】Sweet almond isolated protein can be regarded as a high-quality source for plant protein. Results of this study will make greater contributions to the development of sweet almond protein products. Besides, this study definitely do contribution to the function and property control of the protein products derived from sweet almond both in development and processing of the products, which could enhance the additional value and promote the development of sweet almond industry.

sweet almond; isolate protein; amino acid; thermal properties; rheological properties

2016-12-05；接受日期：2017-04-28

國家自然科學(xué)基金青年基金（31101324）、陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015JM3097）、西安市科技局技術(shù)轉(zhuǎn)移促進(jìn)工程項(xiàng)目（CXY1434（5））、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（GK201602005）

張清安，E-mail：qinganzhang@snnu.edu.cn