陶興林，侯棟，朱惠霞，劉明霞，張金文，胡立敏

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花椰菜溫敏雄性不育系GS-19花藥敗育的細(xì)胞學(xué)及轉(zhuǎn)錄組分析

陶興林1,2，侯棟1，朱惠霞1，劉明霞1，張金文2，胡立敏1

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測實驗站，蘭州 730070；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州 730070）

【目的】對花椰菜溫敏雄性不育系的花器形態(tài)、花藥敗育時期和敗育分子機(jī)理進(jìn)行研究，明確其不育特性發(fā)生的細(xì)胞學(xué)和分子機(jī)理，為進(jìn)一步研究其雄性不育奠定理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳曰ㄒ藴孛粜坌圆挥礕S-19為試驗材料，不同溫度（15℃和20℃）處理，采用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)方法及高通量測序技術(shù)（Illumina HiSeq 2500），研究其形態(tài)特征、花藥敗育的細(xì)胞學(xué)及分子機(jī)理?！窘Y(jié)果】花椰菜溫敏雄性不育系GS-19的育性轉(zhuǎn)換受溫度控制，高溫（20℃）不育，低溫（15℃）育性恢復(fù)。GS-19不育株與可育株花器差異顯著，不育株花器顯著小于可育株?；ㄋ幖?xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)GS-19的花藥發(fā)育過程有花粉母細(xì)胞的分化，形成正?；ǚ勰?，不產(chǎn)生花粉?；蛘弋a(chǎn)生微量的無生活力的花粉粒，花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時期，形成了花粉粒外壁發(fā)育異常的擬“四分體孢子”，逐漸降解，剩下花粉空殼，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型。GS-19不育株和可育株花蕾轉(zhuǎn)錄組分析共獲得67 930個Unigene，其中Nt數(shù)據(jù)庫比對到相似序列數(shù)最多（52 191個），Nr數(shù)據(jù)庫比對到相似序列次之（46 447個），KOG數(shù)據(jù)庫比對相似序列最少（13 198個）；GO注釋到25 336個Unigene；KOG注釋到13 198個Unigene；KEGG注釋到14 778個Unigene?；虿町惐磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)GS-19不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170個基因差異表達(dá)，1 078個基因上調(diào)表達(dá)和1 092個基因下調(diào)表達(dá)。【結(jié)論】花椰菜溫敏雄性不育系GS-19為高溫不育類型，不育株花器顯著小于可育株，花絲顯著縮短，花藥萎縮、干癟，花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時期，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型。轉(zhuǎn)錄組測序獲得了67 930個Unigene，差異表達(dá)基因2 170個。

花椰菜；溫敏雄性不育系；花藥敗育；細(xì)胞學(xué)；轉(zhuǎn)錄組分析

0 引言

【研究意義】溫敏雄性不育系GS-19作為花椰菜育種中一種新型的雄性不育系，在兩系法花椰菜雜交育種中有十分重要的作用。明確花椰菜溫敏雄性不育系GS-19育性轉(zhuǎn)換過程中的花器形態(tài)特征、花藥發(fā)育的敗育時期、特點和基因表達(dá)差異，不僅為闡明該花椰菜溫敏雄性不育系的遺傳及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且為花椰菜溫敏不育系的利用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花椰菜（）是一種非常重要的十字花科蔬菜作物，被公認(rèn)為是最有營養(yǎng)的作物之一，特別是鈣、抗氧化劑、維生素A、維生素K、胡蘿卜素、核黃素及鐵的含量很豐富[1-3]，是雜種優(yōu)勢利用潛力很大的一類作物，而雄性不育途徑是培育花椰菜新品種的主要途徑之一。雄性不育主要特征是雄蕊發(fā)育受阻不能產(chǎn)生正常功能的花粉，是雜種優(yōu)勢利用中的重要材料和工具。首個水稻光敏核不育系農(nóng)墾58S的發(fā)現(xiàn)促使兩系法雜交水稻育種取得突破性進(jìn)展[4]。自此以后，小麥[5]、玉米[6]、大豆[7]、水稻[8]、油菜[9]等作物中都發(fā)現(xiàn)了光（溫）敏雄性不育材料，許多學(xué)者對其敗育時期和方式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同作物或者同一作物不同的雄性不育系之間也有差異。對水稻[10-11]、小麥[12]、油菜[13-15]、玉米[16]、茄子[17]、辣椒[18]、甘藍(lán)[19]等作物的雄性不育系細(xì)胞學(xué)研究較多，主要有無花粉囊型、花粉母細(xì)胞敗育型和單核敗育型3種。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)以其速度快、測序長、通量高、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)[20]、醫(yī)學(xué)[21]、農(nóng)學(xué)[22-24]等研究領(lǐng)域。在雄性不育相關(guān)研究中，高通量測序技術(shù)應(yīng)用主要集中在水稻、小麥、玉米、棉花、菊花等20多個物種中，包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育[25-26]、細(xì)胞核雄性不育[27-28]、化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育[29]、光溫敏雄性不育[30-31]等多種敗育類型，這對于雄性不育敗育機(jī)理的深入研究具有重要意義，也為相關(guān)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)信息?！颈狙芯壳腥朦c】2005年，筆者課題組從花椰菜種質(zhì)資源圃里發(fā)現(xiàn)了幾株溫度敏感的不育株，后經(jīng)多代自交選育成育性穩(wěn)定的溫敏不育系GS-19[32]，屬高溫不育類型，該雄性不育系已經(jīng)在生產(chǎn)中進(jìn)行了應(yīng)用[33]，但導(dǎo)致其花藥敗育的細(xì)胞學(xué)和轉(zhuǎn)錄組水平上的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以花椰菜溫敏雄性不育系GS-19為試驗材料，不同溫度（15℃和20℃）處理，采用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)方法及高通量測序技術(shù)，研究花椰菜溫敏雄性不育系花器形態(tài)特征、花藥敗育的細(xì)胞學(xué)特點及轉(zhuǎn)錄組水平上的基因差異，明確不育系GS-19的花器敗育特征、花藥敗育時期、細(xì)胞學(xué)特征及差異基因表達(dá)特點，為花椰菜溫敏雄性不育進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2012—2016年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測實驗站進(jìn)行。

1.1 試驗材料

試驗選取的花椰菜溫敏雄性不育系GS-19由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育和提供。育性表現(xiàn)與溫度有關(guān)，溫度高于18℃表現(xiàn)為不育，溫度低于16℃時表現(xiàn)為育性完全恢復(fù)。

1.2 育性轉(zhuǎn)換觀察

2014年3月，在智能玻璃溫室中花盆直播不育系GS-19，共播種25盆直徑為38 cm的花盆，顯球后分別移入20℃（16 h光照/8 h黑暗）和15℃（16 h光照/8 h黑暗）的人工智能氣候箱中，開花期觀察統(tǒng)計育性情況。

1.3 花器特征觀察

在盛花期，采集在不同溫度處理下不育系GS-19開花前3—4 d的花蕾和當(dāng)天完全開放的花各20朵，用游標(biāo)卡尺測量7個指標(biāo)，即花蕾長、花蕾寬、花冠開度、花柱長、花藥長、花絲長和花藥總長各部分大小，進(jìn)行比較方差分析。

1.4 掃描電鏡觀察

取不育系GS-19的不育和可育株不同大小花蕾（0.25、0.5、0.75和1.0 cm），用手術(shù)刀橫切（或剝出花藥），確保切面整齊，將導(dǎo)電膠帶粘在樣品托盤上，再將試驗樣品切面向上按已標(biāo)記的順序粘在膠帶上，并用鑷子進(jìn)行固定，粘貼面必須保持平整，確保樣品粘貼牢固，直接放入樣品臺，用HitachiS-3400N型掃描電鏡觀察并照相。

1.5 透射電鏡觀察

選取不育系GS-19不育和可育株不同發(fā)育時期（孢原細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、單核花粉粒和花粉粒成熟期）的花蕾，快速剝開花蕾，取出花藥。采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定法，先用2.5%戊二醛固定6 h，再用1%四氧化鋨固定2 h，丙酮進(jìn)行梯度（70%、80%、90%、100%）脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切成厚度為5 μm的切片，載玻片上粘片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，TEM-1230透射電鏡觀察并照相。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析

RNA提?。涸诓挥礕S-19的盛花期，分別取10株待測不育株和可育株開花前發(fā)育成熟的花蕾，采用Trizol法分別提取不育和可育株花蕾總RNA，每個樣本取等量混合組成1個RNA池，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，將得到的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成dsDNA，對其末端修復(fù)，加poly(A)并連接測序接頭，制備測序文庫，PCR富集測序樣本。

功能注釋：通過Illumina HiSeq 2500 的測序平臺，采用PE125的測序方法，構(gòu)建GS-19不育和可育株花蕾轉(zhuǎn)錄組文庫后進(jìn)行測序并獲取相關(guān)數(shù)據(jù)。通過Blastx比對工具，將不育系GS-19與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)基因的相似性進(jìn)行功能注釋，得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白及功能注釋信息。數(shù)據(jù)庫包括Nr（Non-redundant protein database，非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫）、Nt（NCBI non-redundant nucleotide database，非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫）；SwissProt（SwissProt protein database，蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫）、COG（Cluster of Orthologous Groups，蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫）、Pfam（Protein families database，蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫）、GO（Gene Ontology，基因本體論數(shù)據(jù)庫）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，東京基因與基金組百科全書）。

差異基因分析：采用TMM對read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再用DEG seq進(jìn)行差異分析，篩選閾值為qvalue＜0.005 & |log2FoldChange|＞1；對于差異基因，如果基因的log2Foldchange＞0，則認(rèn)為該差異基因是上調(diào)；反之，若log2Foldchange＜0，認(rèn)為該差異基因是下調(diào)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、標(biāo)準(zhǔn)偏差計算及圖表的繪制，差異顯著性用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 溫敏雄性不育系GS-19的育性轉(zhuǎn)換分析

育性統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個溫度處理后的溫敏不育系GS-19的育性變化存在顯著差異。溫敏雄性不育系GS-19在2個溫度條件下可育率發(fā)生了顯著的變化，在15℃條件下，完全可育，可育率為100%，20℃條件下完全不育，可育率為0，說明溫敏不育系GS-19育性轉(zhuǎn)換受溫度控制，屬于高溫不育類型。

2.2 雄性不育系GS-19的花器特征分析

花椰菜溫敏雄性不育系GS-19的不育株和可育株的花器有顯著差異，不育株花器明顯小于可育株。方差分析表明（圖1），除雄蕊數(shù)量沒有變化外，不育和可育株的花蕾長、花蕾寬、花冠開度、花絲長、花藥總長（花絲+花藥）及花柱長都存在顯著差異，不育株花明顯小于可育株，且雄蕊很短，在開花期看不到雄蕊，雄蕊萎縮在基部，只有柱頭明顯外露（圖2），而且雄蕊也不產(chǎn)生花粉，但可育株的雄蕊基本與雌蕊高度一致，產(chǎn)生大量花粉，能完成正常的授粉。

2.3 雄性不育系GS-19的電鏡掃描觀察

2.3.1 不育和可育株花藥外部形態(tài)觀察 通過對不育系GS-19不育和可育的花藥進(jìn)行電鏡掃描觀察，不育和可育株花藥外部形態(tài)存在顯著差異（圖3）。花蕾長度為0.25 cm時，不育和可育株花藥外部形態(tài)無差異，棒狀形，光滑飽滿；花蕾長度為0.5 cm時，不育和可育株花藥變成了錐形，不育株的花藥壁出現(xiàn)輕微萎縮現(xiàn)象，表面變得不光滑，可育株花藥發(fā)育正常，仍然飽滿光滑；花蕾長度為0.75 cm時，不育株花藥變成干癟狀，明顯萎縮，表面變得粗糙不平整，中空明顯，表現(xiàn)為完全不育，可育株的花藥增大明顯，發(fā)育正常，飽滿光滑；開花期（花蕾長度為1.0 cm）不育株花藥發(fā)育只剩下開裂的空殼花藥壁，無花粉粒，可育株的花藥開裂，裂口處能看到大量飽滿的花粉粒。

2.3.2 不育和可育株花藥橫切面觀察 通過對不育系GS-19不育和可育株花蕾橫切面電鏡掃描觀察，不育和可育株花蕾發(fā)育橫切面存在顯著差異（圖4）?；ɡ匍L度為0.25 cm時，不育和可育株花藥橫切面差異不明顯，都被早期發(fā)育的小孢子填充；花蕾長度為0.5 cm時，不育株花藥發(fā)生了敗育，花藥橫切面有變空現(xiàn)象，能清楚地看到花藥壁，但可育株花藥內(nèi)部仍然被小孢子填充，沒有出現(xiàn)變空現(xiàn)象；花蕾長度為0.75 cm時，不育株花藥橫切面中空明顯，花藥壁變薄，完全不育，而可育株花藥橫切面變化不明顯，明顯看到花藥里被發(fā)育的小孢子填充，沒有中空現(xiàn)象；開花期（花蕾長度為1.0 cm左右）不育株花藥橫切電鏡掃描發(fā)現(xiàn)花藥就剩下薄薄的一層花藥壁，沒有花粉粒，但可育株的花藥被成熟花粉粒填充。

2.3.3 不育和可育株花粉粒的觀察 開花期取不育和可育株進(jìn)行花藥掃描電鏡觀察（圖5），發(fā)現(xiàn)不育株（20℃）花藥干癟變形，從表面看不到花粉粒，但是剝開花藥，發(fā)現(xiàn)極少數(shù)敗育的花粉粒，敗育花粉粒為不規(guī)則形，凹陷明顯?？捎辏?℃）花藥飽滿，明顯看到大量的花粉粒，花粉粒呈橢圓形，表面光滑，飽滿。

2.4 GS-19的透射電鏡觀察

通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)不育系GS-19的花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時期，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型?；ㄋ幇l(fā)育早期，不育系GS-19不育和可育株在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上沒有差異，花藥發(fā)育完全正常，分化形成了表皮、藥室內(nèi)壁、中層等結(jié)構(gòu)，絨氈層和造孢細(xì)胞之間沒有明顯的分界線，形成不規(guī)則多邊形的造孢細(xì)胞，能看到細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)濃厚，看不到明顯的液泡（圖6-A、E）。隨著造孢細(xì)胞分化，形成了花粉母細(xì)胞，此時可育株的花藥能明顯看到一圈排列整齊的長方形絨氈層，絨氈層細(xì)胞核較大，核仁染色深?；ǚ勰讣?xì)胞被絨氈層包裹，其細(xì)胞大，形狀不規(guī)則，核大且染色較深（圖6-B）。不育株花藥也能形成絨氈層和花粉母細(xì)胞，部分花粉母細(xì)胞沒有細(xì)胞核（圖6-F）。小孢子分化形成了被著色深的絨氈層包裹的四分體孢子，可育株的四分體孢子外壁能明顯看到深色密點狀包裹帶，其上出現(xiàn)大量的發(fā)狀物質(zhì)。四分體孢子中含有大量的細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)含物逐漸增多至布滿整個細(xì)胞，染色深且均勻（圖6-C）。不育株只能形成擬“四分體孢子”，和可育株一樣，外側(cè)同樣出現(xiàn)了深色密點狀包裹帶，包裹帶上出現(xiàn)了大量的深色發(fā)狀物質(zhì)，但是四分體孢子的細(xì)胞器顯著減少，內(nèi)含物降解，出現(xiàn)液泡吞噬現(xiàn)象，導(dǎo)致花藥敗育（圖6-G）。四分體孢子繼續(xù)發(fā)育，可育株能形成成熟花粉粒，花粉粒近圓形，內(nèi)壁物質(zhì)顯著增厚，形成了萌發(fā)孔，內(nèi)含物豐富且染色深，絨氈層細(xì)胞完全降解消失（圖6-D）。但是不育株的擬“四分體孢子”不能正常發(fā)育，液泡解體，只剩下壁外側(cè)有發(fā)狀電子致密帶，出現(xiàn)沒有活力的“空腔”花粉?，F(xiàn)象（圖6-H）。

2.5 轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 Unigene 的功能注釋相關(guān)結(jié)果分析 通過BLAST程序，對所組裝獲得不育系GS-19的Unigene進(jìn)行7大數(shù)據(jù)庫的比對（表1）。結(jié)果表明，功能數(shù)據(jù)庫共注釋到67 930個Unigene，7大數(shù)據(jù)庫比對到相似序列數(shù)目存在明顯差異，比對到的相似序列數(shù)從13 198—52 191個，其中Nt數(shù)據(jù)庫比對到相似序列數(shù)最多，為52 191個，Nr數(shù)據(jù)庫比對到相似序列次之，為46 447個，KOG數(shù)據(jù)庫比對相似序列最少，為13 198個。Nr功能注釋到的匹配物種中，油菜Unigene最多（33 108），然后依次為蕪菁（8 841）、擬南芥（643）、芥藍(lán)（634）、山崳菜（626）等。從匹配物種中發(fā)現(xiàn)，不育系GS-19屬于十字花科作物，匹配率最高的也是十字花科的油菜和蕪菁，從親緣關(guān)系遠(yuǎn)近也可以證明這一點。

表1 花椰菜溫敏雄性不育系GS-19的Unigenes功能注釋

GO注釋到25 336個Unigene（表2），分為細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程3個本體共55個功能組；KOG注釋到13 198個Unigene（表3），分為26類，注釋到最多的是基因功能預(yù)測，共2 264個，其次為翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶（1 835個），最少的是未知蛋白（1個）；KEGG注釋到14 778個Unigene（表4），分細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝及有機(jī)系統(tǒng)5大類共19個代謝途徑，其中涉及較多的有碳水化合物（1 350個），翻譯（1 275個），折疊、分類和降解（1 016個）等，較少的為多糖生物合成與代謝（161個），膜輸送、膜轉(zhuǎn)運（60個）。

2.5.2 差異表達(dá)分析 本試驗中發(fā)現(xiàn)不育系GS-19不育株的上調(diào)表達(dá)基因表達(dá)水平高于可育株的基因表達(dá)水平。如圖7所示，在TMS（GS-19不育株花蕾）和TMF（GS-19可育株花蕾）之間發(fā)現(xiàn)的67 931 Unigenes中有2 170個基因差異表達(dá)，其中1 078個基因上調(diào)表達(dá)和1 092個基因下調(diào)表達(dá)。每個比較組合都會得到一個差異基因集，將所有比較組合的差異基因集的并集在每個試驗組/樣品中的的FPKM（Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值，就得到了TMS和TMF的聚類分析結(jié)果（圖8）。

表2 花椰菜溫敏雄性不育系GS-19 Unigene的GO分類

表3 花椰菜溫敏雄性不育系GS-19 Unigene的KOG系統(tǒng)分類

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)花椰菜溫敏雄性不育系GS-19的育性受溫度控制，高溫（20℃）條件下表現(xiàn)為不育，低溫（15℃）條件下完全可育，與前人在甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系SP2S[14]、TE5A[15]、細(xì)胞質(zhì)雄性不育系392A[13]的育性轉(zhuǎn)換研究結(jié)果相同，都表現(xiàn)為高溫不育、低溫育性恢復(fù)。但在油菜溫敏雄性不育系Huiyou50S的育性轉(zhuǎn)換研究結(jié)果正好與本研究結(jié)果相反，表現(xiàn)出低溫不育、高溫可育的現(xiàn)象[34]。為進(jìn)一步對溫敏雄性不育系GS-19利用，在制種過程中要找到適宜區(qū)域，注意監(jiān)控溫度條件，避免影響雜種種子的純度。

花器形態(tài)特征是雄性不育和可育區(qū)別的直接表型，大部分研究表明雄性不育的花明顯小于可育株的花，不育花器形態(tài)有花冠退化型、雄蕊萎縮型、花粉敗育型3種[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件下溫敏不育系GS-19的花器顯著小于低溫下溫敏核不育系GS-19，尤其是花的發(fā)育后期，不育株花器的雄蕊都萎縮于雌蕊基部，柱頭外露，花藥干癟，與前人研究中的雄蕊萎縮型表型一致。童旭宏等[37]觀察了陸地棉的G22A、H109A和1793A 3個不育系，均表現(xiàn)花瓣小、花絲短，柱頭明顯外露，敗育徹底，無花粉；張體德等[38]發(fā)現(xiàn)芝麻細(xì)胞核雄性不育系ms86-1的花器也是不育株小于可育株，這些研究結(jié)果都與本研究結(jié)果相同。

隨著花椰菜雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究也顯得非常重要。目前，雄性不育敗育研究主要集中在油菜、小麥、水稻等大田作物中，主要有無花粉囊型、花粉母細(xì)胞敗育型和單核敗育型3種，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的典型無花囊型油菜不育系有533S[39]、宜3A[40]、212A[41]、Shaan-GMS[42]、9012[43]、BnaC.Tic40[44]、BnMs3[45]等。本研究發(fā)現(xiàn)在花蕾發(fā)育早期（≤1 mm）時，低溫條件下的溫敏雄性不育系GS-19處于孢原時期和造孢時期，能分化形成造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞，該時期高溫條件下的GS-19的花藥發(fā)育也正常。隨著花蕾的繼續(xù)發(fā)育（＞1 mm），高溫條件下溫敏雄性不育系GS-19不育株的花粉母細(xì)胞和可育株一樣，也能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，但形成的四分體孢子不正常，出現(xiàn)擬四分體孢子現(xiàn)象，細(xì)胞器顯著減少，內(nèi)含物降解，出現(xiàn)液泡吞噬現(xiàn)象，導(dǎo)致敗育，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型，與溫敏核不育系小麥BNS[12]和BNS366[46]、甘藍(lán)Ogura CMS[47]的敗育類型一致，此外，水稻[45]、小麥[48]、高粱[49]、大豆[50]、紅菜薹[51]等作物的雄性不育系也是因為減數(shù)分裂過程出現(xiàn)問題，導(dǎo)致花粉母細(xì)胞不能形成四分體，也與本試驗不育類型一致。但是一些其他的溫敏雄性不育水稻、小麥、甘藍(lán)型油菜的花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，這些敗育類型屬于單核敗育型[10,34,52]。推斷GS-19是一個具有重要利用價值的花椰菜溫敏雄性不育系，其不育發(fā)生的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果，對于揭示不育發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制和雜交制種具有重要的指導(dǎo)意義。

表4 花椰菜溫敏雄性不育系GS-19Unigene的KEGG代謝途徑分析

通過基因功能注釋，可以明確基因的功能，也可以了解基因的保守結(jié)構(gòu)域，基因自身表達(dá)條件和潛在的代謝途徑[53]。本研究通過GO數(shù)據(jù)庫，對溫敏雄性不育系GS-19 Unigene進(jìn)行基因生物學(xué)特征功能分類，發(fā)現(xiàn)37 220個GO條目歸屬于細(xì)胞組分中的20個功能組；29 992個GO條目歸屬于分子功能中的10個功能組，62 204個GO條目歸屬于生物學(xué)過程中的25個功能組，明顯看出GO分析雄性不育相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量大，相關(guān)差異表達(dá)基因集聚在代謝中的多個通路，初步證明花椰菜溫敏雄性不育產(chǎn)生機(jī)理的復(fù)雜性。前人研究發(fā)現(xiàn)植物代謝過程中的花粉壁形成、類黃酮合成等過程都與植物雄性不育形成過程中的花粉發(fā)育密切相關(guān)[54]，細(xì)胞程序性死亡也與植物雄性不育關(guān)系密切[55]，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似。相反，大豆的細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究中，發(fā)現(xiàn)參與胚發(fā)育過程的基因數(shù)量最多[56]；大蒜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的花青素代謝相關(guān)基因在差異表達(dá)基因中數(shù)量較多[57]，說明敗育方式差異會導(dǎo)致雄性不育表現(xiàn)出特有差異基因富集的功能通路。

基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的缺乏大大限制花椰菜溫敏雄性不育系的分子機(jī)理方面的相關(guān)研究。目前，對溫敏雄性不育的轉(zhuǎn)錄組分析研究發(fā)現(xiàn)，遺傳背景、敗育時期和方式等多方面因素都會影響基因的表達(dá)水平，Mei等[58]在蘿卜2個核背景存在差異的同一細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)與其相對應(yīng)的保持系差異表達(dá)基因數(shù)分別為3 843和2 041個，這些基因都是與不育特性密切相關(guān)的基因；An等[59]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Pol不育株中的基因上調(diào)表達(dá)數(shù)目顯著高于可育株。本研究發(fā)現(xiàn)，在不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170個基因差異表達(dá)，其中1 078個上調(diào)表達(dá)和1 092個下調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)主要出現(xiàn)在不育材料中，上調(diào)表達(dá)主要出現(xiàn)在可育材料中，與Qu等[60]在油菜細(xì)胞核雄性不育系中的研究結(jié)果相一致，可育材料中的差異基因以上調(diào)表達(dá)為主。但是與Mei等[58]和An等[59]的研究結(jié)果有一定差異，可能與基因型有很大的關(guān)系，這些研究都說明了基因的表達(dá)量及表達(dá)的上、下調(diào)關(guān)系與遺傳背景和差異基因的功能密切相關(guān)，因此，可以通過對基因表達(dá)水平變化的分析，來預(yù)測和研究其基因功能的變化。

4 結(jié)論

花椰菜溫敏雄性不育系GS-19育性轉(zhuǎn)換受溫度控制。GS-19不育與可育株花器差異顯著，不育株的花器明顯小于可育株。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)GS-19不育株的花藥發(fā)育過程有造胞細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的分化，形成正?；ǚ勰遥划a(chǎn)生花粉?；蛘弋a(chǎn)生微量的無生活力的花粉粒，花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時期，形成了花粉粒外壁發(fā)育異常的擬“四分體孢子”，隨著小孢子發(fā)育，擬“四分體孢子”逐漸降解，只剩下花粉空殼，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，GS-19共獲得了67 930個Unigene，GO注釋到25 336個Unigene；KOG注釋到13 198個Unigene；KEGG注釋到14 778個Unigene。GS-19不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170個基因差異表達(dá)，1 078個上調(diào)表達(dá)和1 092個下調(diào)表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Transcriptome and Cytological Researches on the Anther Abortion of a Thermo-sensitive Genic Male Sterile Line GS-19 in Cauliflower

TAO XingLin1,2, HOU Dong1, ZHU HuiXia1, LIU MingXia1, ZHANG JinWen2, HU LiMin1

(1Institute of Vegetable, Gansu Academy of Agricultural Science/Lanzhou Research Station of Horticultural Crop Biology and Germplasm Enhancement, Ministry of Agriculture, Lanzhou 730070;2Gansu Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement/Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)

【Objective】In order to clarify the mechanism of cellular and molecular sterility characteristics, the flower morphology, anther abortion period and molecular mechanism of the thermos-sensitive male sterile line of cauliflower were studied, thus laying a theoretical foundation for further study of the male sterility. 【Method】The thermo-sensitive male sterile line GS-19 was used as the experimental material, using morphological, cytological and high-throughput sequencing techniques, the morphological, cytological and molecular mechanism were studied with treatment at different temperatures (15℃ and 20℃). 【Result】The fertility conversion of the thermo-sensitive male sterile line GS-19 was controlled by temperature, sterility at high temperature (20℃), and fertility at low temperature (15℃).The flower difference between sterile and fertile plants reached a significant level in GS-19, the flower was significantly smaller than that of fertile plants. The anthers abortive stages and manners were different between sterile and fertile plants of GS-19by the microstructureobservation.The anther development of GS-19had differentiation of pollenmother cell, formed normal pollen sac, did not produce pollen grains or produce trace ofpollen grains withoutviability, the developmentof antherswas blocked from pollen mother cell to the tetradstage. The pollen mother cells could not pass the meiosis, with no dyads and tetrads formed in GS-19, insteading of some “pseudo microspores”, belong to an abortive type of pollen mother cell. The pollen exines of the “pseudo microspores” were abnormal. The “pseudo microspores” were decayed gradually and only empty shells remained at last. A total of 67 930 unigenes were generated in GS-19 alabastrum by sequence, Nt database compared to the largest number of similar sequences, for the 52 191, Nr database to similar sequence of times (46 447), KOG database than similar sequence of the least (13 198). By GO database the 25 336 unigenes were divided into 3 categories containing 55 function groups; by KOG databases the 13 198 unigenes were grouped into 26 functional categories; by KEGG database the 14 778 unigenes were divided into 19 metabolism pathways.Gene differential expression analysis revealed that there were 2 170 differentially expressed genes in the bud of GS-19 male sterile line and fertile plants, 1 078 genes up-regulated and 1 092 genes down regulated. 【Conclusion】The fertility conversion of the thermo-sensitive male sterile line GS-19 is controlled by temperature, sterility at high temperature. The flower is significantly smaller than that of fertile plants. The filaments are significantly shortened, the anthers shrank, and dried. The developmentof anthersis blocked from pollen mother cell to the tetradstage, belonging to an abortive type of pollen mother cell. A total of 67 930 unigenes were generated in GS-19 alabastrum by transcriptome analysis. Gene differential expression analysis reveals that there are 2 170 differentially expressed genes in the bud of GS-19 male sterile and fertile plants.

cauliflower (L.); thermo-sensitive genic male sterile; anther abortion; cytology; transcripiome analysis

2016-12-15；接受日期：2017-04-13

國家自然科學(xué)基金（31460519）、農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測試驗站項目（2015-A2621-620321-G1203-066）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25-G-48）、甘肅省農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程學(xué)科團(tuán)隊（2014GAAS07）

陶興林，E-mail：taoxinglin77@126.com