劉堯　馬金龍

摘要：利用堿性蛋白酶從花生餅粕中提取花生水解蛋白。研究了稀釋倍數(shù)對花生餅粕降解的影響，在此基礎上對花生水解蛋白提取工藝條件進行優(yōu)化。確定最佳稀釋倍數(shù)為10倍體積稀釋，在此條件下得到的電泳條帶最為清晰。

關鍵詞：花生餅粕；堿性蛋白酶；水解

花生是全球最重要油料作物之一，種植面積僅次于油菜，居油料作物第二位，在世界油脂生產(chǎn)中占有重要地位。但由于傳統(tǒng)上把花生看作是提取食用油的原料，蛋白質(zhì)利用沒有得到足夠重視，往往因制油后蛋白溶解性能較差而作為動物飼料和肥料，造成蛋白質(zhì)資源極大浪費?；ㄉ鞍赘缓梭w多種必需氨基酸，不含膽固醇，可消化性高，對維護幼兒發(fā)育和人體健康具有重要作用。從花生餅粕中提取蛋白質(zhì)并改善其功能性質(zhì)，對增加花生餅粕附加值具有重要現(xiàn)實意義。采用酶法提取花生蛋白作用條件溫和，蛋白質(zhì)多肽鏈可水解為短肽鏈，提高蛋白質(zhì)消化率，并能有效提高蛋白質(zhì)得率。

1材料與方法

1.1材料

斜面保藏培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，瓊脂0.5%，pH值7.0，雙蒸水制備。

電泳緩沖液（mmol/L）：Tris堿25g，甘氨酸192g，SDS0.1%，雙蒸水制備。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：酪蛋白酸水解物（干酪素）1%，葡萄糖1.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH值7.0，雙蒸水制備

30%凝膠貯備液（30%丙烯酰胺-0.8%甲叉雙丙烯酰胺溶液）（A液）（mol/L）：Tris-Hcl（PH8.8）1.5，SDS 0.4%，雙蒸水制備。

4倍分離膠緩沖液（C液）（mol/L）：Tris-Hcl（PH6.8）0.5，SDS 0.4%，雙蒸水制備。

5倍樣品緩沖液（蛋白質(zhì)樣品處理液）（mmol/L）：Tris-Hcl（PH6.8）60，甘油：25%，SDS：2%，a-巰基乙醇14.4，雙蒸水制備。10%（W/V）過硫酸銨溶液；TEMED；1%溴酚藍。

考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮藍R-250 1.0g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，雙蒸水450mL。

考馬斯亮藍脫色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，雙蒸水：800mL。

1.2主要儀器設備

pH計，離心機，電動攪拌器，分光光度儀，恒溫水槽，高壓滅菌鍋，無菌操作臺，恒溫搖床，培養(yǎng)箱，蛋白質(zhì)電泳儀，自動分離收集器等。

1.3方法

1.3.1制備斜面：按照培養(yǎng)基的配方

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)：將斜面內(nèi)的菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，240 rmp，搖床培養(yǎng)48h。

1.3.3粗酶液提取：取搖床培養(yǎng)48 h左右的發(fā)酵液200mL，在4℃下8000 r/min離心20 min，取上清液，得粗酶液。

1.3.4樣品的制備：將已粉碎的花生餅粕粉分裝在9個10mL離心管內(nèi)，每管0.5g，分別加入9mL粗酶液。在30～C反應30min。酶解反應后，分別稀釋5、10、15、20、25、30、35、40倍，取0.25mL裝入lmL離心管內(nèi)，并裝入等體積的5倍樣品緩沖液。沸水浴中加熱3-5rain后上樣。

1.3.5電泳：運用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法對所制備的樣品分離，染色，脫色后得到實驗結果。

2結果

對所得到的膠板進行反復的脫色，可以清晰地看到每一條電泳條帶的酶解成果。左數(shù)分別是蛋白maker，未稀釋酶解條帶，5倍稀釋，10倍稀釋，15倍稀釋，20倍稀釋，25倍稀釋，30倍稀釋，35倍稀釋，40倍稀釋。由圖1可以看出，10倍稀釋最為清晰。

3討論

本試驗采用大連海域，產(chǎn)堿性蛋白酶菌降解花生餅粕，經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠垂直板電泳后，可以較好地將花生餅粕內(nèi)的蛋白降解分離，得到數(shù)條清晰的蛋白條帶。本實驗以稀釋倍數(shù)為條件，發(fā)現(xiàn)10倍稀釋下得到的條帶最為清晰，為今后繼續(xù)尋找最適條件打下基礎。

4結果

利用堿性蛋白酶從花生餅粕中提取花生水解蛋白。研究了稀釋倍數(shù)對花生餅粕降解的影響，在此基礎上對花生水解蛋白提取工藝條件進行優(yōu)化。確定最佳稀釋倍數(shù)為10倍體積稀釋，在此條件下得到的電泳條帶最為清晰，為今后尋找更為合適的條件奠定基礎。