侯震坤，魏 寧，劉兆軍，謝景興，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存的影響

侯震坤，魏 寧，劉兆軍，謝景興，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

研究將抗氧化劑曲酸（Kojic acid）應(yīng)用到關(guān)中黑豬精液的常溫保存中，通過(guò)滲透壓、精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和總抗氧化能力（T-AOC）等指標(biāo)檢測(cè)，探究曲酸對(duì)精子的保護(hù)作用，為關(guān)中黑豬精液稀釋粉的研發(fā)提供技術(shù)支持。試驗(yàn)結(jié)果顯示，BTS稀釋液中添加0.1 g/L濃度以內(nèi)的曲酸能夠有效提高精子質(zhì)膜、頂體完整性，提升精子的總抗氧化能力。其中0.04 g/L濃度組保存效果最好，保存第5天時(shí)精子活率為61.45%，可將精子有效保存時(shí)間延長(zhǎng)2 d，0.06 g/L濃度組與之差異不顯著（P＞0.05）。綜上所述，在BTS液中添加0.04 g/L曲酸能夠?qū)映乇４嫫鸬阶罴训目寡趸Ｗo(hù)效果。研究對(duì)解決豬精液常溫保存中精子的氧化損傷問(wèn)題具有重要參考意義，同時(shí)為自主研發(fā)稀釋粉產(chǎn)品提供試驗(yàn)依據(jù)。

曲酸；關(guān)中黑豬；豬精液；常溫保存

AbstractIn this study,antioxidant kojic acid were applied to the preservation of Guanzhong black pig semen at room temperature.Osmotic pressure,sperm viability,plasma membrane integrity,acrosome integrity and total antioxidant capacity(T-AOC)and some other detection indexes were experimented to explore the efficacy of kojic acid on the protection of semen,this study was aimed to provide a theoretical support for the research of dilution powder for Guanzhong black pig semen.The following are the main results in this study:BTS extenders solution with less than 0.1 g/L kojic acid can significantly improve the sperm plasma membrane,acrosome integrity,enhance the total antioxidant capacity of sperm(P＜0.05),especially 0.04 g/L group has the best performance for the sperm viability was 61.45%at the 5th day which can prolong the sperm storage time for another 2 days.In addition,the sperm preservation effect of 0.06 g/L group was not significantly different with 0.04 g/L group(P＞0.05).In summary,adding 0.04 g/L kojic acid in BTS solution had the best antioxidation protection effect on sperm preservation at room temperature.The results of this study are of great significance to solve the problem of sperm oxidative damage in porcine semen preservation at room temperature,and provide experimental basis for independent diluted powder research.

Key wordskojic acid;Guanzhong black pig;boar semen;room temperature preservation

活性氧（ROS）是精子生理過(guò)程的正常副產(chǎn)物，在獲能、頂體反應(yīng)和確保受精的協(xié)調(diào)信號(hào)事件中起重要作用[1]。然而，ROS和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡是引起氧化應(yīng)激（OS）的重要原因，表現(xiàn)為過(guò)氧化損傷，最終可能導(dǎo)致雄性不育[2]。公豬精子質(zhì)膜富含多不飽和脂肪酸，對(duì)OS特別敏感，并且由于精液的處理和加工過(guò)程，增加了ROS水平升高的幾率[3-4]。盡管類似于許多其他細(xì)胞類型，精子同樣具有自帶的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，但并不能完全保護(hù)細(xì)胞膜免受OS的影響，因此，精子受益于它們浸浴的精漿中的抗氧化成分[5]。當(dāng)精子射出體內(nèi)后，精子的生存環(huán)境發(fā)生極大變化，尤其是經(jīng)過(guò)稀釋后的精液，精漿中酶等保護(hù)物質(zhì)經(jīng)過(guò)幾倍甚至10余倍的稀釋，部分精漿中的稀精子段在采精時(shí)甚至被舍棄，這無(wú)疑會(huì)削弱精子抗氧化能力。因此，添加外源性抗氧化劑來(lái)保護(hù)精子在常溫液態(tài)狀態(tài)下的存活并保證其在一定期限內(nèi)具有使卵子受精的能力是至關(guān)重要的，也是當(dāng)今豬精液商業(yè)化生產(chǎn)交易和運(yùn)輸常態(tài)下的必要需求[6]。

曲酸（Kojic acid）是由幾種真菌產(chǎn)生的真菌代謝物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性，通常用作皮膚美白研究中的陽(yáng)性對(duì)照[7]。其廣泛用于防止水產(chǎn)品的酶促褐變，西蘭花、菠蘿蜜等蔬菜水果的保鮮保水[8-9]。此外，曲酸能夠增加大腸桿菌內(nèi)外膜的通透性，加速細(xì)菌的死亡[10]。目前，曲酸在豬精液常溫保存上的應(yīng)用還少見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)探討稀釋液中添加曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子的保護(hù)效果，通過(guò)保存過(guò)程中精子活率、質(zhì)膜和頂體完整性以及精子總抗氧化能力的測(cè)定，分析曲酸作為抗氧化劑添加的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)于2016年9月至2017年3月在西北農(nóng)林科技大學(xué)進(jìn)行。試驗(yàn)用種公豬精液采自西北農(nóng)林科技大學(xué)三站豬場(chǎng)的3頭年齡分別為1.4歲、1.5歲、2歲的成年關(guān)中黑豬種公豬。

1.2 主要試劑及儀器

曲酸，葡萄糖，果糖，檸檬酸鈉，氯化鉀，碳酸氫鈉，Rh123（羅丹明），碘化丙啶（PI），異硫氰酸熒光素/花生凝集素聯(lián)合染色（FITC-PNA）試劑盒，丙二醛（MDA）測(cè)試試劑盒，總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試試劑盒，多功能酶標(biāo)儀Synergy H1，精子密度儀Modelo V11，豬精液計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)HVIESSW V8.0（CASA），紫外光分光光度計(jì)，恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋HHS21-4-S，17℃恒溫冰箱；全自動(dòng)冰點(diǎn)滲透壓儀Osmopro 3250。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬精液的采集 通過(guò)雙層手套手握法進(jìn)行采精，并用3層濾紙過(guò)濾后將富含精子的部分收集于保溫杯中。

1.3.2 豬精液的稀釋和分裝 采精完畢后，立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行稀釋分裝。稀釋前分別用精子密度儀和快速pH試紙檢測(cè)精子密度和pH。將之前溶解好并預(yù)熱過(guò)的BTS稀釋液與精液共同置于37℃的水浴鍋中水浴5 min，避光，使二者溫度相近。隨后用燒杯稱量精液量并記錄，將稀釋液緩慢倒入精液中，按1∶4比例進(jìn)行等溫稀釋。之后精液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在室溫下放置2 h使其溫度緩慢降至室溫，再轉(zhuǎn)移到17℃恒溫冰箱中常溫保存，精液保存期間每天搖勻1次。

1.3.3 試驗(yàn)分組 預(yù)試驗(yàn)分為6組，BTS稀釋液中曲酸的添加濃度分別為 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L。正式試驗(yàn)分為6組，BTS稀釋液中曲酸的添加濃度分別為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。

1.3.4 精子活率的檢測(cè) 精子活率定義為沿直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比。采用CASA系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)精子活率。進(jìn)行精子活率檢測(cè)前，每組分別取1 mL精液于1.5 mL離心管中放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min。檢測(cè)時(shí)吸取10 μL精液樣品滴于載玻片上，將載玻片放置于顯微鏡物鏡下的恒溫載物臺(tái)上預(yù)熱30 s，恒溫載物臺(tái)溫度設(shè)置為37℃，隨后用計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行檢測(cè)計(jì)算。精子活率每隔24 h檢測(cè)1次，直到活率低于60%為止。

1.3.5 滲透壓的測(cè)定 通過(guò)滲透壓儀測(cè)定各組精液的滲透壓。

1.3.6 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè) 按檸檬酸鈉7.35 g/L、果糖13.5 g/L配制檸檬酸鈉-果糖低滲液（現(xiàn)配現(xiàn)用），待溶液溶解后，從各試驗(yàn)組中吸取1 mL精液，分別加入9 mL檸檬酸鈉-果糖低滲液，在37℃條件下水浴30 min，期間不時(shí)輕晃試管，以免精子沉積造成膜損傷，影響結(jié)果。之后用微量移液器吸取15 μL，先在40倍視野下找到精子，后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察精子彎尾率，計(jì)算在200個(gè)精子中尾部彎曲的精子所占比例，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7 精子頂體完整性檢測(cè) 使用熒光染料異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA）對(duì)精子進(jìn)行染色，檢測(cè)頂體完整率。在熒光顯微鏡下可以觀察到兩種類型精子：a）精子頂體前部呈現(xiàn)完整的明亮綠色熒光，即頂體完整的精子。b）頂體前部熒光殘缺或無(wú)熒光，即頂體破損或丟失的精子。

1.3.8 精液總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定 總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試使用總抗氧化能力測(cè)試盒（A015-2 ABTS快速法100T）測(cè)定（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步整理后，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響

2.1.1 預(yù)試驗(yàn)中不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響 由表1可知，當(dāng)曲酸的添加量超過(guò)0.10 g/L 時(shí)，精子活率降低；曲酸添加量為 0.10 g/L時(shí)，精子活率略優(yōu)于對(duì)照組，但是差異不顯著（P＞0.05）。由此推測(cè)曲酸的最適添加濃度范圍在0～0.10 g/L。

表1 預(yù)試驗(yàn)中不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響（n=3） %

2.1.2 正式試驗(yàn)中不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響 由表2可知，精子保存至第3天時(shí)，對(duì)照組精子活率即下降到60.62%，與0.10 g/L曲酸組差異不顯著（P＞0.05），與 0.02 g/L 曲酸組、0.04 g/L 曲酸組、0.06 g/L 曲酸組、0.08 g/L 曲酸組差異顯著（P＜0.05）。自保存第4天起，對(duì)照組精子活率與所有試驗(yàn)組差異顯著。保存至第5天時(shí)，除添加0.04 g/L曲酸組精子活率為61.45%，高于60%，其余所有組精子活率均低于60%。綜合來(lái)看，0.04 g/L曲酸組對(duì)精子活率保存效果最好。

表2 正式試驗(yàn)中不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響（n=5） %

2.2 曲酸對(duì)稀釋液滲透壓的影響

由表 3 得知，不同濃度（0～1.60 g/L）曲酸對(duì) BTS稀釋液滲透壓影響極小，各組間均無(wú)顯著差異。

2.3 曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子質(zhì)膜完整性的影響

由表4可知，對(duì)照組精子質(zhì)膜完整性自保存第1天起就與各試驗(yàn)組有顯著差異（P＜0.05），并且這種顯著差異保持到精液保存的第5天。在保存5天期間內(nèi)，試驗(yàn)組質(zhì)膜完整性最高的組別有所不同，第1天、第3天為曲酸0.06 g/L組最高，第2天、第4天、第5天為曲酸0.04 g/L組最高。保存至后期，0.04 g/L曲酸組對(duì)精子質(zhì)膜完整性保護(hù)效果最好。

表3 BTS稀釋液中添加不同濃度曲酸后的滲透壓 mOsm/kg

表4 不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子質(zhì)膜完整性的影響（n=5） %

2.4 曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子頂體完整性的影響

由表5可知，在精子保存第1天時(shí)，所有組別的頂體完整率均無(wú)顯著差異。從保存第2天起，試驗(yàn)組開(kāi)始顯示出優(yōu)勢(shì)：保存第2天0.04 g/L曲酸組頂體完整性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），并且顯著性持續(xù)到保存第5天。0.10 g/L曲酸組對(duì)精子頂體完整性有不利影響。添加曲酸0.04 g/L對(duì)精子頂體完整性保護(hù)效果最好。

表5 不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子頂體完整性的影響（n=5） %

2.5 曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精子總抗氧化能力的影響

由表6可知，精液保存第3天，添加曲酸組精子總抗氧化能力均高于對(duì)照組，除0.02 g/L曲酸組與對(duì)照組差異不顯著外（P＞0.05），其余試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中 0.04 g/L 曲酸組 T-AOC值最高，0.06 g/L曲酸組次之。保存至第5天，添加曲酸的試驗(yàn)組T-AOC值均高于對(duì)照組，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 不同濃度曲酸對(duì)關(guān)中黑豬精液T-AOC的影響（n=5） U/mL

3 討論

公豬精漿中含有抗氧化酶，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。但在稀釋的商品豬精液中，原始的抗氧化酶水平大幅降低，在長(zhǎng)達(dá)3～5 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間的常溫保存過(guò)程中，精子僅靠自身的抗氧化系統(tǒng)不足以抵御生存環(huán)境和長(zhǎng)時(shí)間的保存運(yùn)輸所帶來(lái)的氧化應(yīng)激，因此稀釋液中添加抗氧化劑是降低精子氧化損傷重要手段。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同個(gè)體公豬射出的新鮮精液滲透壓也存在差異，雖然這種差異不大一般不超過(guò)10 mOsm/kg。Fraser等（2001）也發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象，并認(rèn)為個(gè)別公豬精子之間存在滲透反應(yīng)的差異，但具體機(jī)制還不清楚[10]。Fraser等（2001）還發(fā)現(xiàn)滲透壓影響精子的膜完整性[11]。本試驗(yàn)表明，不同濃度曲酸（0～1.60 g/L）添加對(duì)稀釋液的滲透壓影響極小，因此，各項(xiàng)精液質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)的差異可以排除與曲酸濃度導(dǎo)致的滲透壓變化有關(guān)。

預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果表明，曲酸添加濃度不宜超過(guò)0.10 g/L。精子活率即沿直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子百分比，是精子運(yùn)動(dòng)性能最直接的表現(xiàn)形式。在CASA系統(tǒng)下由計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)性能，結(jié)果更為準(zhǔn)確，同時(shí)也避免了檢查者主觀情感上帶來(lái)的判別誤差[12]。曲酸添加濃度在0.10 g/L內(nèi)，對(duì)精子表現(xiàn)出較好的保存效果：所有試驗(yàn)組精子活率均高于對(duì)照組，且0.04 g/L曲酸組、0.06 g/L曲酸組效果最好，從保存第3天開(kāi)始顯著高于其他組并延續(xù)到保存第5天。與活率相似的結(jié)果也出現(xiàn)在精子質(zhì)膜完整性上，0.04、0.06 g/L曲酸組明顯對(duì)質(zhì)膜的保護(hù)效果要更為優(yōu)秀。本試驗(yàn)精子質(zhì)膜完整性在數(shù)值上整體低于范曉騰（2016）試驗(yàn)中相同保存時(shí)間精子質(zhì)膜完整性，原因在于檢測(cè)手段的差別。本試驗(yàn)采用低滲腫脹試驗(yàn)（HOST）觀察精子在低滲狀態(tài)下的彎尾率，范曉騰的試驗(yàn)采用PI/SYBR-14聯(lián)合熒光染色。

有趣的是，本試驗(yàn)用FITC-PNA熒光染色觀察檢測(cè)發(fā)現(xiàn)精子在保存期間頂體完整性的變化與活率、質(zhì)膜等指標(biāo)相比在數(shù)值上的變化較小，這與謝東淇（2016）的試驗(yàn)結(jié)果相似，但添加曲酸組仍然顯示出優(yōu)異性，0.04、0.06、0.08 g/L曲酸組3組對(duì)頂體完整性的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于其他組，曲酸高于0.08 g/L對(duì)頂體完整性有不利影響，具體原因還需進(jìn)一步研究。

精子的總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)是檢測(cè)抗氧化劑是否有效的重要參考指標(biāo)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示精子保存至第3天時(shí)，添加曲酸試驗(yàn)組的精子T-AOC值顯著高于對(duì)照組，充分體現(xiàn)了曲酸的抗氧化效果。第5天時(shí)，添加曲酸試驗(yàn)組雖然整體上T-AOC值高于對(duì)照組，但各組間無(wú)顯著差異，這可能與本試驗(yàn)精液中未加入抗菌劑導(dǎo)致細(xì)菌大量增殖有關(guān)。

4 結(jié)論

BTS稀釋液中添加0.1 g/L濃度以內(nèi)的曲酸能夠有效提高精子質(zhì)膜、頂體完整性，提升精子的總抗氧化能力，其中0.04 g/L質(zhì)量濃度保存效果最顯著，可將精子有效保存時(shí)間延長(zhǎng)2 d。

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（編輯：富春妮）

Effects of Kojic Acid on the Quality of Boar Semen of Guanzhong Black Pig during Room Temperature Preservation

HOU Zhenkun,WEI Ning,LIU Zhaojun,XIE Jingxing,YANG Gongshe,PANG Weijun
(College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

S828.3

A

1002-1957(2017)05-0037-04

2017-08-05

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站（基地）科技成果推廣項(xiàng)目（TGZX2015-18）

侯震坤（1993-），男，河南焦作人，在讀碩士研究生，主要從事豬人工授精技術(shù)的研究工作.E-mail:rensh102257＠163.com

龐衛(wèi)軍（1972-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榧∪馍飳W(xué)與豬遺傳改良.E-mail:pwj1226＠nwafu.edu.cn