祖立闖，王 芳，劉愛華，王金良，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，濱州 256600；3.山東省利津縣畜牧局，利津 257400；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

我國豬傳染性胃腸炎的流行現(xiàn)狀及實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

祖立闖1，王 芳2，劉愛華3，王金良4，李 峰4，沈志強(qiáng)1，4

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，濱州 256600；3.山東省利津縣畜牧局，利津 257400；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起豬的以腹瀉、嘔吐、脫水、逐漸消瘦為主要特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[1]，各年齡段的豬群均易感，對仔豬的危害最大，仔豬日齡越低死亡率越高，存活的仔豬生長發(fā)育嚴(yán)重受阻，生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率明顯降低，生產(chǎn)性能下降[2]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。筆者就目前我國TGE的流行現(xiàn)狀及各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在掌握我國豬群中TGE的流行現(xiàn)狀與流行特點(diǎn)，為逐步提高我國TGE實(shí)驗(yàn)室診斷水平，以及為我國TGE的綜合防控提供參考。

1 病毒分離鑒定情況

如表1所示，自2006年以來的近10年中，我國研究學(xué)者先后在我國四川、福建、吉林、陜西、甘肅、黑龍江、江蘇、山東、遼寧、河北等10個(gè)省共分離鑒定出17株TGEV，TGEV強(qiáng)毒株的感染由中部地區(qū)逐步向東部沿海以及北方地區(qū)逐步擴(kuò)散，現(xiàn)在我國大部分養(yǎng)豬密集地區(qū)均已有TGEV病毒感染并成功分離毒株的報(bào)道。

2 流行病學(xué)監(jiān)測情況

近10年我國研究學(xué)者對國內(nèi)TGEV的感染情況進(jìn)行了大量的流行病學(xué)監(jiān)測，筆者通過對監(jiān)測結(jié)果的整理與匯總，分析出近10年中我國豬群TGEV流行的幾個(gè)顯著特點(diǎn)。

2.1 流行范圍廣

如表2所示，TGEV的流行已經(jīng)遍布了我國黑龍江、貴州、福建、廣西、北京、河北、安徽、浙江、江蘇、青海、河南、廣東、遼寧、山東、內(nèi)蒙古、上海、江西、四川、山西、吉林、陜西等21個(gè)省市。

表1 近10年TGEV病毒分離鑒定情況匯總

2.2 感染率整體不高

如表2所示，在2007—2016年的39篇流行病學(xué)監(jiān)測文獻(xiàn)中，TGEV整體陽性感染率在0～31.86%范圍內(nèi)，其中陽性感染率超過10%的流行病學(xué)監(jiān)測文獻(xiàn)僅有10篇，而陽性感染率在5%～10%的文獻(xiàn)有12篇，陽性感染率低于5%的文獻(xiàn)達(dá)17篇，陽性感染率在10%以下文獻(xiàn)占總文獻(xiàn)的74.36%，表明TGEV在我國發(fā)病豬群中的感染率整體穩(wěn)定在較低水平，這與我國對TGEV防控工作的重視密不可分。

2.3 隱性感染普遍存在

如表2所示，2008—2009年貴州省健康豬群中TGEV抗體陽性率為0.41%，2015—2016年陜西省健康豬群中TGEV抗體陽性率為5.36%，2016年河南省健康豬群中TGEV抗體陽性率為1.5%，2012—2013年北京健康豬群中TGEV病原感染率為2.58%，2016年福建省健康豬群中TGEV病原感染率為28.9%。表明外觀健康豬群仍可檢測出TGEV病原或抗體，健康豬群中普遍存在TGEV隱性感染。

2.4 區(qū)域性流行特點(diǎn)顯著

如表2所示，不同地區(qū)感染率差異較大，如2012年青海的發(fā)病豬樣品的感染率達(dá)30.0%，而2012年安徽發(fā)病豬樣品的感染率僅為10.8%；如2016年福建健康豬樣品的感染率達(dá)28.9%，而2016年河南健康豬樣品的感染率僅為1.5%。

表2 近10年TGEV流行病學(xué)監(jiān)測情況匯總

2.5 與其它病原的混合感染情況較嚴(yán)重

如表3所示，TGEV與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PoRV）、豬嵴病毒（PKV）普遍存在二重、三重的混合感染，其中在部分不同地區(qū)與PEDV的二重混合感染率最高達(dá)29.2%，與PEDV、PoRV三重混合感染率最高達(dá)20.0%，與PEDV、PKV三重混合感染率最高達(dá)3.84%，混合感染增加了疫病的診斷與防控難度，造成的經(jīng)濟(jì)損失更加巨大，應(yīng)加強(qiáng)重視。

表3 近10年我國豬群TGEV與其它致病原混合感染情況匯總

3 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

TGEV與PEDV、PoRV等疫病的臨床表現(xiàn)極其相似，均表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、逐漸消瘦等特征，且TGEV經(jīng)常與PEDV、PoRV等疫病混合感染，增加了TGEV臨床診斷的難度，故目前對TGEV感染的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，包括病毒的分離與鑒定、分子生物學(xué)和免疫學(xué)診斷技術(shù)。

3.1 病毒的分離與鑒定

病毒分離與鑒定方法一直是動(dòng)物病毒病實(shí)驗(yàn)室確診的經(jīng)典方法，但該方法存在試驗(yàn)周期長，操作較繁瑣，不適合臨床快速診斷。滿坤等[19]將采集的病死豬小腸內(nèi)容物處理后接種ST細(xì)胞，經(jīng)過12代盲傳后開始出現(xiàn)細(xì)胞顆粒增多、圓縮、損傷和脫落等典型細(xì)胞病變，分離病毒被TGEV特異性血清中和后接種細(xì)胞不出現(xiàn)細(xì)胞病變，仔豬口服分離病毒后出現(xiàn)水樣腹瀉、糞便呈乳白色或黃綠色、嘔吐、脫水等癥狀，經(jīng)過對分離病毒的ORF3基因序列進(jìn)行分析證實(shí)分離毒株為TGEV。

3.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.2.1 RT-PCR及多重RT-PCR方法 RT-PCR首先以病毒的基因組RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是疾病病原檢測中最常用的一種分子生物學(xué)診斷技術(shù)。多重RT-PCR方法是在單一RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上建立起來的，可在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對引物同時(shí)對多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，可在一次PCR反應(yīng)過程中檢測到多個(gè)致病原。張作華等[59]根據(jù)TGEV N基因序列設(shè)計(jì)了1對特異性引物，建立了檢測TGEV的RT-PCR方法，該方法檢測豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、PEDV均為陰性，可檢測到1×10-3μg/μL的TGEV RNA，通過對126份臨床疑似為TGEV感染病料的檢測證明該RT-PCR檢測方法可用于臨床上TGEV感染引起的傳染病病原學(xué)檢測。李麗敏等[60]分別針對PEDV和TGEV的N基因、PoRV的VP7基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測PEDV、TGEV和PoRV的多重RT-PCR方法，該方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、CSFV、PRV及PCV2等病毒均為陰性，可以檢測到PEDV、TGEV和PoRV的最低核酸濃度分別為16.07、803.9和321.5 μg/L，該多重RT-PCR和PEDV、TGEV、PoRV單項(xiàng)RT-PCR的符合率分別為96.77%、93.54%和93.54%，該多重RT-PCR能夠快速鑒別檢測PEDV、TGEV和PoRV 3種病毒，可用于PEDV、TGEV與PoRV的臨床快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

3.2.2 熒光RT-PCR及多重?zé)晒釸T-PCR方法 熒光定量RT-PCR技術(shù)融匯了常規(guī)RT-PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，但該方法對儀器設(shè)備和操作人員技術(shù)水平要求均較高。李子祥等[61]針對TGEV S基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，建立了基于SYBR GreenⅠ染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（r=0.997），擴(kuò)增效率高，檢測靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，該方法檢測124份臨床疑似TGEV病料，陽性率為13.7%，可用于獸醫(yī)臨床上TGEV的快速檢測和流行病學(xué)分析。許夢怡[62]分別根據(jù)TGEV、PEDV、PoRV的M、M、VP2基因序列，設(shè)計(jì)了3對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物和3組熒光RT-PCR引物和探針，通過優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度，成功建立了3種病毒的TaqMan探針熒光定量PCR方法。該方法對TGEV、PEDV、PoRV的檢測靈敏度分別為2.49拷貝/μL、4.36拷貝/μL、4.96拷貝/μL。組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均不超過5%，檢測PRV、PCV1、PRRSV等病毒均為陰性，在40份臨床病料樣品檢測中三重?zé)晒釸T-PCR方法的檢測結(jié)果與單一熒光RT-PCR方法一致，三重?zé)晒釸T-PCR方法具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.2.3 RT-LAMP方法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP）是2000年以后發(fā)展起來的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，只需在恒溫條件下就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊儀器設(shè)備，并且擴(kuò)增結(jié)果可通過反應(yīng)體系的濁度或加入染料來直觀判斷，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用，但LAMP方法容易形成氣溶膠污染，造成假陽性的結(jié)果。高睿澤等[63]根據(jù)TGEV N基因序列設(shè)計(jì)2對RT-LAMP引物，建立針對TGEV的RT-LAMP快速檢測方法，該方法在63℃恒溫下作用50 min，使TGEV獲得了高效率特異性擴(kuò)增，檢測PEDV等其它豬易感病毒均為陰性，可檢測到131.4fg/μL的目標(biāo)病毒，比普通RT-PCR的靈敏度高3個(gè)數(shù)量級，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光，該RTLAMP對40份臨床樣品的檢測結(jié)果與RT-PCR和ELISA的符合率均為100%，為TGE的臨床快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡單、快速和高效的技術(shù)手段。

3.2.4 基因芯片方法 基因芯片技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一門新技術(shù)，在基片上點(diǎn)陣排列一系列靶基因，與熒光素等標(biāo)記的探針分子在同一條件下進(jìn)行核酸雜交，經(jīng)過共聚焦激光掃描儀掃描、利用數(shù)據(jù)分析軟件獲得雜交結(jié)果，具有自動(dòng)化、平行性和高通量等潛在優(yōu)勢，能同時(shí)對多種疾病進(jìn)行檢測。滑翔等[64]分別根據(jù) PEDV 基因（S、M）、TGEV 基因（S、N）、PoRV 基因（VP7、NSP4）的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增靶基因，進(jìn)行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA陣列設(shè)計(jì)，構(gòu)建了能夠擴(kuò)增PEDV、TGEV、PoRV的cDNA芯片，該cDNA芯片檢測PRRSV、CSFV、豬乙型腦炎病毒（JEV）、PRV均為陰性，芯片的最低檢測質(zhì)量濃度為20 pg/μL，同一張芯片可重復(fù)使用至少7次，該P(yáng)EDV-TGEV-PoRV診斷cDNA芯片具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，為PEDV、TGEV、PoRV的鑒別診斷提供了新的高通量檢測技術(shù)。

3.3 免疫學(xué)診斷技術(shù)

3.3.1 ELISA方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是繼免疫熒光和放射性同位素免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新型的免疫酶技術(shù)，該方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、操作簡便、快速等特點(diǎn)，非常適用于臨床大批量樣品的檢測。ELISA方法可用于測定抗原，也可用于測定抗體，主要有直接法、間接法、夾心法、競爭法（阻斷法），其中間接ELISA檢測抗體和雙抗夾心ELISA檢測抗原是動(dòng)物疫病檢測中最常用的二種方法。

（1）間接ELISA方法。間接ELISA方法中首先用特異性抗原包被固相載體，加入待測抗體（一抗），待測抗體與包被固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合；再加入酶標(biāo)記的抗體（酶標(biāo)二抗），酶標(biāo)抗體與待測抗體發(fā)生特異性結(jié)合，再加入底物顯色液，底物顯色液與酶標(biāo)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，最后顯色顏色的深淺與待測抗體的量成正比。徐向偉等[65]將TGEV的N基因片段克隆到pET-28a載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以純化的重組N蛋白作為包被抗原，建立了檢測TGEV抗體的間接ELISA方法，該 ELISA方法檢測 PEDV、CSFV、PRRSV、口蹄疫病毒（FMDV）、PCV2等 5種病毒陽性血清均為陰性，該方法操作簡便、特異性好、敏感性高，可用于大規(guī)模臨床樣品的檢測。

（2）雙抗夾心ELISA方法。雙抗夾心ELISA方法中首先用捕獲抗體包被固相載體，加入待測抗原，待測抗原與捕獲抗體發(fā)生特異性結(jié)合，再加入檢測抗體（標(biāo)記抗體），檢測抗體與待測抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物，再加入底物顯色液，底物顯色液與檢測抗體發(fā)生特異性結(jié)合，最后顯色顏色的深淺與待測抗原的含量成正比。屈月等[66]以抗TGEV N蛋白單克隆抗體為包被抗體，純化的抗TGEV N蛋白多克隆抗體為檢測抗體，建立了TGEV雙抗體夾心ELISA方法，該ELISA的重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，檢測PEDV、豬細(xì)小病毒（PPV）、CSFV、PoRV 等均為陰性，對 22份臨床豬糞便樣品的陽性檢出率為22.7%，與常規(guī)RT-PCR的符合率達(dá)81.8%，該雙抗體夾心ELISA方法檢測TGEV具有較高的特異性和敏感性，可以用于TGEV的病原學(xué)檢測。

3.3.2 IPMA方法 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）是在感染病毒的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入待檢標(biāo)本，再加入標(biāo)有辣根過氧化物酶抗免疫球蛋白特異抗體，經(jīng)底物顯色后利用光學(xué)顯微鏡即可觀察結(jié)果。朱蘊(yùn)暖等[67]以TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，AEC過氧化物酶底物為顯色液，建立了檢測TGEV的IPMA方法。該方法中一抗的最佳使用濃度為0.5 ng/μL，二抗的最佳稀釋倍數(shù)為1∶2 000倍，經(jīng)AEC顯色后TGEV感染的陽性細(xì)胞呈紅棕色，能檢測到101TCID50的病毒，檢測常見的PEDV、PoRV和PCV2等豬病病原均為陰性，為TGEV的實(shí)驗(yàn)室診斷及TGEV在感染細(xì)胞中的定位和動(dòng)態(tài)分布提供有效的檢測手段。

3.3.3 免疫膠體金方法 免疫膠體金技術(shù)是結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫檢測技術(shù)發(fā)展起來的一種新型檢測技術(shù)，其以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，將其標(biāo)記抗原或抗體后形成標(biāo)記物，樣品中的待測物與標(biāo)記物形成的絡(luò)合物通過層析作用在層析材料上泳動(dòng)，與層析材料上針對該待測物的受體發(fā)生免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物中的膠體金大量聚集形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點(diǎn)。具有簡便、快速、不需儀器設(shè)備、結(jié)果判斷直觀、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病診斷尤其是基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)地診斷中得到了廣泛應(yīng)用。常亮等[68]采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，用TGEV單克隆抗體標(biāo)記并包被在玻璃纖維膜上，另外將純化的TGEV單克隆抗體和羊抗小鼠抗體包被在硝酸纖維膜上，組裝成TGEV快速檢測試紙條，該試紙條檢出TGEV最低量為150 μg/mL，而檢測CSFV、PRRSV、大腸桿菌及沙門氏菌均為陰性，試紙條在常溫下可保存1年。膠體金試劑條具有快速、靈敏、特異、操作簡便等特點(diǎn)，非常適用于基層單位。

3.3.4 IFA方法 間接免疫熒光（IFA）檢測方法可利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的定位，且該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高和操作簡便等特點(diǎn)，在病原檢測、病毒感染及致病機(jī)理研究中得到廣泛應(yīng)用。朱蘊(yùn)暖等[69]將TGEV接種PK-15細(xì)胞后，以抗TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，熒光素FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了TGEV的IFA檢測方法。該方法檢測常見的PEDV、PoRV和 PCV2等豬病病原均為陰性，為TGEV的臨床鑒別診斷提供了一種免疫學(xué)診斷技術(shù)。

4 小結(jié)與展望

現(xiàn)階段的流行現(xiàn)狀分析表明TGEV在我國豬群中呈散發(fā)性、區(qū)域性流行，其整體感染率一直穩(wěn)定在較低水平，表明我國采取的TGE綜合防控措施發(fā)揮了功效，但分析中發(fā)現(xiàn)TGEV的隱性感染以及與其它致病原的混合感染均普遍存在，應(yīng)加強(qiáng)重視。對于TGEV的各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，病毒分離鑒定、IPMA、IHA、基因芯片方法均存在試驗(yàn)條件要求高、操作復(fù)雜、過程繁瑣、費(fèi)用成本高等條件限制，不利于基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測。RT-LAMP和膠體金方法對儀器設(shè)備要求較低，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性。RT-PCR、ELSA方法操作簡單、檢測快速、高通量，是目前TGEV診斷和流行病學(xué)監(jiān)測使用的主要方法，但RT-PCR方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)需使用溴化乙錠（EB），對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生一定的威脅。熒光RT-PCR方法彌補(bǔ)了常規(guī)RT-PCR不能定量以及EB的污染問題，但對儀器、試劑、操作人員技術(shù)水平要求均較高，有條件的實(shí)驗(yàn)室可選擇使用。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)的不斷完善與標(biāo)準(zhǔn)化，以及我國對TGE研究的不斷深入和防控措施的不斷完善，TGE的各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)必將會(huì)走向不斷成熟與完善，TGE的流行也將會(huì)得到進(jìn)一步控制，從而逐步實(shí)現(xiàn)TGEV在我國的凈化。

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2017)05-0123-06

2017-08-09

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2016CM35）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究工作.E-mail：zulichuang2008@126.com