唐玫琴, 田發(fā)青, 李舉亨, 黃映彩, 李惠卿, 成小慧

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 廣東 深圳 518172)

·論著·

肺炎鏈球菌疫苗抗原促進CRTH2(CD4+CD294+Th2)細胞增殖的實驗研究

唐玫琴, 田發(fā)青, 李舉亨, 黃映彩, 李惠卿, 成小慧

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 廣東 深圳 518172)

目的研究肺炎鏈球菌疫苗通過樹突狀細胞抗原遞呈作用對CRTH2(CD4+CD294+Th2)細胞促增殖作用，為擴增及分選Th2細胞提供新方法。方法外周血單核細胞培養(yǎng)為樹突狀細胞，負載肺炎鏈球菌疫苗抗原后與T淋巴細胞共培養(yǎng)，CCK8法測定混合淋巴細胞反應，流式細胞儀分析DC及CRTH2細胞。結果肺炎鏈球菌疫苗可促進樹突狀細胞成熟，與TNF-a共同是DC成熟佐劑。DC負載肺炎鏈球菌疫苗抗原能使第5天CRTH2細胞亞群比率[(0.93±0.10)%]較首日[(0.70±0.02)%]升高，其絕對數(shù)也升高(均P<0.05)。結論樹突狀細胞負載肺炎鏈球菌疫苗抗原能夠促進CRTH2細胞增殖，可能是擴增Th2細胞有效方法之一。

肺炎鏈球菌疫苗; 樹突狀細胞; CRTH2細胞； 細胞增殖

[Chin J Infect Control，2017，16(10)：916-919,930]

Th2細胞是重要的輔助T淋巴細胞，輔助B細胞增殖及分化。本世紀初Cosmi等[1]研究證實CRTH2(CD294)可以用來鑒別Th2細胞，即CD4+CD294+T細胞，提供一種新的分離Th2細胞的方法。Tsuda等[2]的實驗也表明CRTH2表達于Th2和Tc2表面，而不表達于Th1和Tc1表面，是檢測人Th2和Tc2可靠的表面標志，已經(jīng)作為商品化的試劑用磁珠分選Th2細胞。CRTH2是一種新的G蛋白偶聯(lián)受體, 與C5a受體和FMLP受體高度同源，IL-4能夠上調(diào)其表達，而IFN-γ則下調(diào)其表達。CRTH2同時也是前列腺素D2的一種受體，參與白細胞的遷移, 可能與炎癥反應有關[3-5]。CRTH2細胞包括Th2或Tc2細胞，不包括Th0或Tc0細胞，亦不包括Th1或Tc1細胞，所以通過CD4+聯(lián)合CD294+磁珠分選可以分選出Th2細胞(CD4+CD294+Th2細胞)。目前CRTH2細胞研究較少， 主要集中在過敏性疾病和炎癥性疾病中，其促進B細胞分泌IgE，導致免疫損傷[6]。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞(dendritic cells，DC)遞呈卡介苗抗原激活CD4+CD294+Th2細胞，該Th2細胞可促進骨髓瘤細胞增殖及克隆形成，因此，CD4+CD294+Th2細胞不僅在過敏性疾病中發(fā)揮作用，在某些腫瘤的發(fā)病機制中亦有重要作用，有必要對其進一步研究[7]。本實驗擬研究肺炎鏈球菌疫苗是否亦能通過DC遞呈抗原促進CRTH2細胞增殖和分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CCK8試劑盒為Dojindo、Kumamoto、Japan產(chǎn)品，rhIL-2為PeproTech、USA產(chǎn)品，rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、rhIFN-γ來自于Shanghai Prime Gene Bio-Tech Co，肺炎鏈球菌疫苗為輝瑞公司產(chǎn)品，抗人CD1a-PE、CD4-FITC、CD11c-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC單抗為Burlingame公司產(chǎn)品，CD4+細胞和TH2細胞磁珠分選試劑盒(CD294-PE )為美天旎(Miltenyi Biotec GmbH, Germany)。

1.2 單個核細胞的分離 實驗通過醫(yī)院倫理委員會批準，所采集標本得到健康志愿者本人自愿同意并簽署同意書。采集健康供者外周血10 mL(40 U/mL肝素抗凝)加等體積的PBS溶液稀釋，沿管壁徐徐疊加于盛有2倍體積的淋巴細胞分離液的離心管行單個核細胞分離(注意要保證液面界面清晰，勿與淋巴細胞分離液混合)，離心后由上至下分為四層：血清、單個核細胞(BMMNC)、淋巴細胞分離液、紅細胞。收集單個核細胞層于10 mL離心管中，用PBS溶液稀釋洗滌3次、分別離心10 min，收集細胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素、100 U/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640作為完全培養(yǎng)基懸浮沉淀細胞，貼壁培養(yǎng)2～4 h，收集貼壁細胞，調(diào)整濃度為106/mL，作為單核細胞培養(yǎng)DC。非貼壁細胞作為T淋巴細胞。

1.3 細胞培養(yǎng) 單核細胞培養(yǎng)板中加入rhGM-CSF(終濃度為1 000 U/mL)、rhIL-4(終濃度為500 U/mL)，第5天，加入TNF-a(終濃度為100 ng/mL)和稀釋百倍的肺炎鏈球菌疫苗，再培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)成熟DC用絲裂霉素(25 μg/L)處理1 h去增殖后作為刺激細胞與外周血分離的T淋巴細胞混合培養(yǎng)。調(diào)整細胞濃度為106/mL后，以不同比例(DC∶T細胞分別為1∶100、1∶50、1∶10、1∶1)與T細胞(2×105個/mL)在96孔平底培養(yǎng)板中作用5 d。終體積為每孔200 μL，對每個濃度均作4個平行孔。以同樣抗原處理后的單核細胞(Mo)與T細胞共培養(yǎng)孔作為DC與T淋巴細胞作用的對照孔。培養(yǎng)第五天以CCK8法測定混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction MLR)，CCK8(20 μL/孔)，每孔加入CCK8試劑后在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測波長450 nm時的吸光度(A)值，參比波長為630 nm，結果取均值。算增殖指數(shù)(PI)。PI=ADC+Tcell-ADC/ ATcell-Ablank。

1.4 流式細胞儀(FCM)檢測 DC培養(yǎng)第5、7天，F(xiàn)CM測定其膜CD分子表達調(diào)節(jié)。取細胞懸液100 μL/管(細胞濃度為1×106/mL)，分別加入相應單克隆抗體各15 μL，混勻后置室溫下暗室反應30 min，加PBS緩沖液，離心洗滌，以1%多聚甲醛固定備作FCM測定。DC以1∶10在培養(yǎng)瓶中與外周血分離的T淋巴細胞混合培養(yǎng)，F(xiàn)CM測定首日及第5天CD4+CD294+Th2細胞。Cell Quest軟件進行分析。

2 結果

2.1 DC分析 DC培養(yǎng)第4～5天即可見典型樹突狀突起，見圖1。第5、7天FCM檢測其表型，第7天DC成熟標志CD83升高，而CD1a表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 樹突狀細胞(倒置顯微鏡：100×10)

表1 DC免疫表型分型

2.2 混合淋巴細胞反應(MLR) DC與T淋巴細胞混合培養(yǎng)，第2天即見淋巴細胞集落樣抱團樣生長，見圖2。CCK8法測定MLR，結果顯示DC刺激淋巴細胞PI能力呈數(shù)量依賴性，并較Mo明顯，提示T淋巴細胞在DC作用下明顯擴增。DC以1∶10與淋巴細胞混合培養(yǎng)時PI約(8.02±1.12)，即較混合培養(yǎng)第1天細胞數(shù)增加約8倍，見圖3。

圖2 淋巴細胞(倒置顯微鏡：5×10)

*：表示DC刺激淋巴細胞增殖呈數(shù)量依賴性，與Mo比較增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

2.3 FCM檢測CD4+CD294+細胞亞群 DC與外周血淋巴細胞培養(yǎng)首日及第5天，F(xiàn)CM檢測CD4+CD294+Th2細胞比率分別為(0.70±0.02)%、(0.93±0.10)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 CD4+CD294+ Th2細胞FCM測定

2.4 CD4+CD294+細胞絕對值計算 肺炎鏈球菌疫苗處理的DC(treated-DC組)與未用肺炎鏈球菌疫苗處理的DC(untreated-DC組)分別與T淋巴細胞混合培養(yǎng)(DC∶T = 1∶10)，第5天，流式細胞儀測定CD4+CD294+Th2亞群，計算CD4+CD294+Th2細胞絕對值。結果顯示treated-DC組較untreated-DC組CD4+CD294+Th2絕對值增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 CD4+CD294+ Th2細胞絕對值

3 討論

DC是目前已知的功能最強大的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)[8-9]。不成熟DC能高效地攝取、加工處理抗原，但抗原遞呈能力弱；成熟DC有強大的抗原遞呈能力，其抗原遞呈能力是單核細胞的10～100倍，能有效激活Na?ve T細胞。DC有較強的遷移能力，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。DC盡管數(shù)量少，不足外周血單核細胞的1%，但表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和黏附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，所以有強大的刺激Na?ve T細胞向CTL、Th1及Th2細胞分化及增殖[10-12]。通過APC遞呈抗原激活Na?ve T細胞，一般遞呈外源性抗原例如微生物抗原通過MHC-Ⅱ類分子，使Na?ve T細胞向CD4+T細胞方向發(fā)展。其中，Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等細胞因子，輔助細胞毒性T細胞(CTL)或者作用于單核細胞發(fā)揮細胞免疫功能，而Th2細胞則分泌IL-4、IL-5、IL-6等細胞因子，輔助B細胞增殖、分化，介導體液免疫應答[13-14]。本研究中通過TNF-a和肺炎鏈球菌疫苗作為成熟佐劑，促進DC成熟。實驗結果提示，在TNF-a和肺炎鏈球菌疫苗作用下，出現(xiàn)DC典型形態(tài)學變化，其成熟標志CD83分子表達明顯升高，與本課題組前期研究DC時使用卡介苗做成熟佐劑的結果相似[7]，提示肺炎鏈球菌疫苗也是良好的DC成熟的佐劑。成熟的DC有明顯促進T淋巴細胞增殖的效應，提示DC遞呈肺炎鏈球菌疫苗某些抗原促進了Na?ve T細胞分化。MLR實驗提示DC使T淋巴細胞增殖后，T細胞數(shù)量增高可達8倍之上，并且FCM結果提示CD4+CD294+Th2(CRTH2)細胞亞群比例亦較前增加。因此，CD4+CD294+Th2(CRTH2)細胞絕對值較DC作用前增加，提示DC遞呈肺炎鏈球菌疫苗促進了CRTH2細胞的增殖。

CRTH2(CD4+CD294+Th2)細胞屬于Th2細胞，膜分子CD294是前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)的G蛋白偶聯(lián)受體，通過與配體PGD2結合而活化，調(diào)節(jié)細胞功能[15]。肥大細胞可分泌PGD2，通過募集Th2細胞而促進分泌IgE，同時也作用于嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞膜上CD294受體[6]。動物實驗證實抑制CRTH2細胞可恢復中性粒細胞的遷移能力，延長中性粒細胞生存，恢復中性粒細胞對敗血癥的敏感性，提示其可能是調(diào)節(jié)中性粒細胞遷移、恢復對敗血癥敏感性的關鍵調(diào)節(jié)機制之一[16]。有資料顯示CRTH2亦與IgG4分泌有關[17]。本課題組在前期研究中，以卡介苗誘導CRTH2細胞增殖，該Th2細胞可促進遞呈同類抗原的骨髓瘤細胞增殖及集落形成[14]，并且該Th2細胞可輔助B細胞分泌免疫球蛋白。本研究進一步說明微生物抗原可通過DC遞呈促進CRTH2細胞增殖和分化?？傊?，本課題研究為獲得足夠數(shù)量CRTH2細胞及Th2細胞，提供一個新方法，可保證分選足夠數(shù)量的Th2細胞。

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(本文編輯：陳玉華)

PneumococcalvaccinepromotestheproliferationofCRTH2(CD4+CD294+Th2)cells

TANGMei-qin,TIANFa-qing,LIJu-heng,HUANGYing-cai,LIHui-qing,CHENGXiao-hui
(LonggangDistrictPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518172,China)

ObjectiveTo study the proliferation of CRTH2 (CD4+CD294+Th2) cells promoted by pneumococcal vaccine through antigen presentation of dendritic cells (DCs), so as to provide a new approach for amplification and sorting of Th2 cells.MethodsCDs induced from peripheral blood mononuclear cells were cocultured with T lymphocytes after loading pneumococcal vaccine antigen, mixed lymphocyte reaction (MLR) was detected by cell counting kit-8(CCK8), DCs and CRTH2 cells were analyzed by flow cytometry.ResultsPneumococcal vaccine could promote the maturation of DCs, together with TNF-a, it was adjuvant for maturation of DCs. Pneumococcal vaccine antigen-loaded DCs could increase the rate of subsets of CRTH2 cells on day 5([0.93±0.10]%) compared with day 1([0.70±0.02]%), and absolute number also increased (bothP<0.05).ConclusionAmplification of CRTH2 cells can be greatly promoted by pneumococcal vaccine antigen-loaded DCs, which might be one of the effective way to induce amplification of Th2 cells.

pneumococcal vaccine; dendritic cell; CRTH2 cell； cell proliferation

R392.12

A

1671-9638(2017)10-0916-05

2016-12-20

深圳市科技創(chuàng)新項目科技研發(fā)基金(JCYI 20140414123738256); 深圳市龍崗區(qū)科技發(fā)展基金(YLWS 20150514150041453)

唐玫琴(1981-)，女(漢族)，湖南省常德市人，主治醫(yī)師，主要從事血栓與止血相關研究。

田發(fā)青 E-mail:trumantfq@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.10.005