唐玫琴, 田發(fā)青, 李舉亨, 黃映彩, 李惠卿, 成小慧

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 廣東 深圳 518172)

·論著·

肺炎鏈球菌疫苗抗原促進(jìn)CRTH2(CD4+CD294+Th2)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

唐玫琴, 田發(fā)青, 李舉亨, 黃映彩, 李惠卿, 成小慧

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 廣東 深圳 518172)

目的研究肺炎鏈球菌疫苗通過樹突狀細(xì)胞抗原遞呈作用對CRTH2(CD4+CD294+Th2)細(xì)胞促增殖作用，為擴(kuò)增及分選Th2細(xì)胞提供新方法。方法外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)為樹突狀細(xì)胞，負(fù)載肺炎鏈球菌疫苗抗原后與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，CCK8法測定混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，流式細(xì)胞儀分析DC及CRTH2細(xì)胞。結(jié)果肺炎鏈球菌疫苗可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，與TNF-a共同是DC成熟佐劑。DC負(fù)載肺炎鏈球菌疫苗抗原能使第5天CRTH2細(xì)胞亞群比率[(0.93±0.10)%]較首日[(0.70±0.02)%]升高，其絕對數(shù)也升高(均P<0.05)。結(jié)論樹突狀細(xì)胞負(fù)載肺炎鏈球菌疫苗抗原能夠促進(jìn)CRTH2細(xì)胞增殖，可能是擴(kuò)增Th2細(xì)胞有效方法之一。

肺炎鏈球菌疫苗; 樹突狀細(xì)胞; CRTH2細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

[Chin J Infect Control，2017，16(10)：916-919,930]

Th2細(xì)胞是重要的輔助T淋巴細(xì)胞，輔助B細(xì)胞增殖及分化。本世紀(jì)初Cosmi等[1]研究證實(shí)CRTH2(CD294)可以用來鑒別Th2細(xì)胞，即CD4+CD294+T細(xì)胞，提供一種新的分離Th2細(xì)胞的方法。Tsuda等[2]的實(shí)驗(yàn)也表明CRTH2表達(dá)于Th2和Tc2表面，而不表達(dá)于Th1和Tc1表面，是檢測人Th2和Tc2可靠的表面標(biāo)志，已經(jīng)作為商品化的試劑用磁珠分選Th2細(xì)胞。CRTH2是一種新的G蛋白偶聯(lián)受體, 與C5a受體和FMLP受體高度同源，IL-4能夠上調(diào)其表達(dá)，而IFN-γ則下調(diào)其表達(dá)。CRTH2同時(shí)也是前列腺素D2的一種受體，參與白細(xì)胞的遷移, 可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)[3-5]。CRTH2細(xì)胞包括Th2或Tc2細(xì)胞，不包括Th0或Tc0細(xì)胞，亦不包括Th1或Tc1細(xì)胞，所以通過CD4+聯(lián)合CD294+磁珠分選可以分選出Th2細(xì)胞(CD4+CD294+Th2細(xì)胞)。目前CRTH2細(xì)胞研究較少， 主要集中在過敏性疾病和炎癥性疾病中，其促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgE，導(dǎo)致免疫損傷[6]。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)遞呈卡介苗抗原激活CD4+CD294+Th2細(xì)胞，該Th2細(xì)胞可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖及克隆形成，因此，CD4+CD294+Th2細(xì)胞不僅在過敏性疾病中發(fā)揮作用，在某些腫瘤的發(fā)病機(jī)制中亦有重要作用，有必要對其進(jìn)一步研究[7]。本實(shí)驗(yàn)擬研究肺炎鏈球菌疫苗是否亦能通過DC遞呈抗原促進(jìn)CRTH2細(xì)胞增殖和分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CCK8試劑盒為Dojindo、Kumamoto、Japan產(chǎn)品，rhIL-2為PeproTech、USA產(chǎn)品，rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、rhIFN-γ來自于Shanghai Prime Gene Bio-Tech Co，肺炎鏈球菌疫苗為輝瑞公司產(chǎn)品，抗人CD1a-PE、CD4-FITC、CD11c-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC單抗為Burlingame公司產(chǎn)品，CD4+細(xì)胞和TH2細(xì)胞磁珠分選試劑盒(CD294-PE )為美天旎(Miltenyi Biotec GmbH, Germany)。

1.2 單個(gè)核細(xì)胞的分離 實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所采集標(biāo)本得到健康志愿者本人自愿同意并簽署同意書。采集健康供者外周血10 mL(40 U/mL肝素抗凝)加等體積的PBS溶液稀釋，沿管壁徐徐疊加于盛有2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液的離心管行單個(gè)核細(xì)胞分離(注意要保證液面界面清晰，勿與淋巴細(xì)胞分離液混合)，離心后由上至下分為四層：血清、單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)、淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞。收集單個(gè)核細(xì)胞層于10 mL離心管中，用PBS溶液稀釋洗滌3次、分別離心10 min，收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素、100 U/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640作為完全培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)2～4 h，收集貼壁細(xì)胞，調(diào)整濃度為106/mL，作為單核細(xì)胞培養(yǎng)DC。非貼壁細(xì)胞作為T淋巴細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 單核細(xì)胞培養(yǎng)板中加入rhGM-CSF(終濃度為1 000 U/mL)、rhIL-4(終濃度為500 U/mL)，第5天，加入TNF-a(終濃度為100 ng/mL)和稀釋百倍的肺炎鏈球菌疫苗，再培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)成熟DC用絲裂霉素(25 μg/L)處理1 h去增殖后作為刺激細(xì)胞與外周血分離的T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL后，以不同比例(DC∶T細(xì)胞分別為1∶100、1∶50、1∶10、1∶1)與T細(xì)胞(2×105個(gè)/mL)在96孔平底培養(yǎng)板中作用5 d。終體積為每孔200 μL，對每個(gè)濃度均作4個(gè)平行孔。以同樣抗原處理后的單核細(xì)胞(Mo)與T細(xì)胞共培養(yǎng)孔作為DC與T淋巴細(xì)胞作用的對照孔。培養(yǎng)第五天以CCK8法測定混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction MLR)，CCK8(20 μL/孔)，每孔加入CCK8試劑后在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm時(shí)的吸光度(A)值，參比波長為630 nm，結(jié)果取均值。算增殖指數(shù)(PI)。PI=ADC+Tcell-ADC/ ATcell-Ablank。

1.4 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測 DC培養(yǎng)第5、7天，F(xiàn)CM測定其膜CD分子表達(dá)調(diào)節(jié)。取細(xì)胞懸液100 μL/管(細(xì)胞濃度為1×106/mL)，分別加入相應(yīng)單克隆抗體各15 μL，混勻后置室溫下暗室反應(yīng)30 min，加PBS緩沖液，離心洗滌，以1%多聚甲醛固定備作FCM測定。DC以1∶10在培養(yǎng)瓶中與外周血分離的T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，F(xiàn)CM測定首日及第5天CD4+CD294+Th2細(xì)胞。Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 DC分析 DC培養(yǎng)第4～5天即可見典型樹突狀突起，見圖1。第5、7天FCM檢測其表型，第7天DC成熟標(biāo)志CD83升高，而CD1a表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 樹突狀細(xì)胞(倒置顯微鏡：100×10)

表1 DC免疫表型分型

2.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) DC與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，第2天即見淋巴細(xì)胞集落樣抱團(tuán)樣生長，見圖2。CCK8法測定MLR，結(jié)果顯示DC刺激淋巴細(xì)胞PI能力呈數(shù)量依賴性，并較Mo明顯，提示T淋巴細(xì)胞在DC作用下明顯擴(kuò)增。DC以1∶10與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)PI約(8.02±1.12)，即較混合培養(yǎng)第1天細(xì)胞數(shù)增加約8倍，見圖3。

圖2 淋巴細(xì)胞(倒置顯微鏡：5×10)

*：表示DC刺激淋巴細(xì)胞增殖呈數(shù)量依賴性，與Mo比較增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.3 FCM檢測CD4+CD294+細(xì)胞亞群 DC與外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)首日及第5天，F(xiàn)CM檢測CD4+CD294+Th2細(xì)胞比率分別為(0.70±0.02)%、(0.93±0.10)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 CD4+CD294+ Th2細(xì)胞FCM測定

2.4 CD4+CD294+細(xì)胞絕對值計(jì)算 肺炎鏈球菌疫苗處理的DC(treated-DC組)與未用肺炎鏈球菌疫苗處理的DC(untreated-DC組)分別與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(DC∶T = 1∶10)，第5天，流式細(xì)胞儀測定CD4+CD294+Th2亞群，計(jì)算CD4+CD294+Th2細(xì)胞絕對值。結(jié)果顯示treated-DC組較untreated-DC組CD4+CD294+Th2絕對值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 CD4+CD294+ Th2細(xì)胞絕對值

3 討論

DC是目前已知的功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)[8-9]。不成熟DC能高效地?cái)z取、加工處理抗原，但抗原遞呈能力弱；成熟DC有強(qiáng)大的抗原遞呈能力，其抗原遞呈能力是單核細(xì)胞的10～100倍，能有效激活Na?ve T細(xì)胞。DC有較強(qiáng)的遷移能力，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC盡管數(shù)量少，不足外周血單核細(xì)胞的1%，但表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和黏附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，所以有強(qiáng)大的刺激Na?ve T細(xì)胞向CTL、Th1及Th2細(xì)胞分化及增殖[10-12]。通過APC遞呈抗原激活Na?ve T細(xì)胞，一般遞呈外源性抗原例如微生物抗原通過MHC-Ⅱ類分子，使Na?ve T細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞方向發(fā)展。其中，Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等細(xì)胞因子，輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)或者作用于單核細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，而Th2細(xì)胞則分泌IL-4、IL-5、IL-6等細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞增殖、分化，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[13-14]。本研究中通過TNF-a和肺炎鏈球菌疫苗作為成熟佐劑，促進(jìn)DC成熟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在TNF-a和肺炎鏈球菌疫苗作用下，出現(xiàn)DC典型形態(tài)學(xué)變化，其成熟標(biāo)志CD83分子表達(dá)明顯升高，與本課題組前期研究DC時(shí)使用卡介苗做成熟佐劑的結(jié)果相似[7]，提示肺炎鏈球菌疫苗也是良好的DC成熟的佐劑。成熟的DC有明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)，提示DC遞呈肺炎鏈球菌疫苗某些抗原促進(jìn)了Na?ve T細(xì)胞分化。MLR實(shí)驗(yàn)提示DC使T淋巴細(xì)胞增殖后，T細(xì)胞數(shù)量增高可達(dá)8倍之上，并且FCM結(jié)果提示CD4+CD294+Th2(CRTH2)細(xì)胞亞群比例亦較前增加。因此，CD4+CD294+Th2(CRTH2)細(xì)胞絕對值較DC作用前增加，提示DC遞呈肺炎鏈球菌疫苗促進(jìn)了CRTH2細(xì)胞的增殖。

CRTH2(CD4+CD294+Th2)細(xì)胞屬于Th2細(xì)胞，膜分子CD294是前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)的G蛋白偶聯(lián)受體，通過與配體PGD2結(jié)合而活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[15]。肥大細(xì)胞可分泌PGD2，通過募集Th2細(xì)胞而促進(jìn)分泌IgE，同時(shí)也作用于嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞膜上CD294受體[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制CRTH2細(xì)胞可恢復(fù)中性粒細(xì)胞的遷移能力，延長中性粒細(xì)胞生存，恢復(fù)中性粒細(xì)胞對敗血癥的敏感性，提示其可能是調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移、恢復(fù)對敗血癥敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制之一[16]。有資料顯示CRTH2亦與IgG4分泌有關(guān)[17]。本課題組在前期研究中，以卡介苗誘導(dǎo)CRTH2細(xì)胞增殖，該Th2細(xì)胞可促進(jìn)遞呈同類抗原的骨髓瘤細(xì)胞增殖及集落形成[14]，并且該Th2細(xì)胞可輔助B細(xì)胞分泌免疫球蛋白。本研究進(jìn)一步說明微生物抗原可通過DC遞呈促進(jìn)CRTH2細(xì)胞增殖和分化?？傊?，本課題研究為獲得足夠數(shù)量CRTH2細(xì)胞及Th2細(xì)胞，提供一個(gè)新方法，可保證分選足夠數(shù)量的Th2細(xì)胞。

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(本文編輯：陳玉華)

PneumococcalvaccinepromotestheproliferationofCRTH2(CD4+CD294+Th2)cells

TANGMei-qin,TIANFa-qing,LIJu-heng,HUANGYing-cai,LIHui-qing,CHENGXiao-hui
(LonggangDistrictPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518172,China)

ObjectiveTo study the proliferation of CRTH2 (CD4+CD294+Th2) cells promoted by pneumococcal vaccine through antigen presentation of dendritic cells (DCs), so as to provide a new approach for amplification and sorting of Th2 cells.MethodsCDs induced from peripheral blood mononuclear cells were cocultured with T lymphocytes after loading pneumococcal vaccine antigen, mixed lymphocyte reaction (MLR) was detected by cell counting kit-8(CCK8), DCs and CRTH2 cells were analyzed by flow cytometry.ResultsPneumococcal vaccine could promote the maturation of DCs, together with TNF-a, it was adjuvant for maturation of DCs. Pneumococcal vaccine antigen-loaded DCs could increase the rate of subsets of CRTH2 cells on day 5([0.93±0.10]%) compared with day 1([0.70±0.02]%), and absolute number also increased (bothP<0.05).ConclusionAmplification of CRTH2 cells can be greatly promoted by pneumococcal vaccine antigen-loaded DCs, which might be one of the effective way to induce amplification of Th2 cells.

pneumococcal vaccine; dendritic cell; CRTH2 cell； cell proliferation

R392.12

A

1671-9638(2017)10-0916-05

2016-12-20

深圳市科技創(chuàng)新項(xiàng)目科技研發(fā)基金(JCYI 20140414123738256); 深圳市龍崗區(qū)科技發(fā)展基金(YLWS 20150514150041453)

唐玫琴(1981-)，女(漢族)，湖南省常德市人，主治醫(yī)師，主要從事血栓與止血相關(guān)研究。

田發(fā)青 E-mail:trumantfq@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.10.005