劉慶杰 白宏英

1)永城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 永城 476600 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014

·論著 科研之窗·

烏司他丁對腦缺血再灌注大鼠腦組織JNK及細(xì)胞凋亡的影響

劉慶杰1)白宏英2)

1)永城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 永城 476600 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014

目的 探討烏司他丁對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白表達(dá)及凋亡細(xì)胞數(shù)的影響。方法 36只雄性清潔SD大鼠按隨機(jī)平均原則分成3組：假手術(shù)組(12只)、腦缺血再灌注組(對照組，12只)、腦缺血再灌注+烏司他丁治療組(治療組，12只)。大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作。采用RT-PCR法檢測大鼠腦組織JNK的表達(dá)，采用 TUNEL法檢測大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，對照組和治療組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)JNK的表達(dá)明顯升高，凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P均<0.05)。與對照組相比，治療組大鼠腦組織JNK的表達(dá)明顯下降，凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯減少(均P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可下調(diào)缺血再灌注大鼠腦組織JNK的表達(dá)并抑制其細(xì)胞凋亡，烏司他丁抑制細(xì)胞凋亡可能與抑制JNK傳導(dǎo)通路相關(guān)。

烏司他??；腦缺血再灌注；c-Jun氨基末端激酶；細(xì)胞凋亡

本研究觀察烏司他丁對大鼠腦缺血再灌注后缺血側(cè)腦組織JNK蛋白的表達(dá)及凋亡細(xì)胞數(shù)的影響，探討烏司他丁抑制細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制及相關(guān)通路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動(dòng)物與分組：清潔級健康雄性SD大鼠 36只，體質(zhì)量220～300 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組(對照組)、腦缺血再灌注+烏司他丁干預(yù)組(治療組)，每組12只。

1．1．2 主要儀器及試劑：RT-PCR圖像分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific D140)；電泳儀(北京市六一儀器廠 DYY-6C)；PCR Gene Amp system(美國 Applied Biosystems 2700)；圖像采集系統(tǒng)(德國Lecia 顯微照相系統(tǒng))；烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號H19990133)；TUNEL試劑盒(羅氏ZK-8005)，PCR試劑盒(EasyTaq DNA Polymerase，北京全式金生物技術(shù)有限公司AP111-12)，Rt試劑盒(EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司AE301-02)。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物模型制作及處理：采用改良Zea-Longa線栓法[1]制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶缺血模型。大腦中動(dòng)脈缺血2 h后將線栓抽至頸外動(dòng)脈處并固定再灌注24 h，成功完成缺血再灌注模型制作。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和迷走神經(jīng)不結(jié)扎不插線栓。于缺血2 h后應(yīng)用Longa法[1]對其進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：右側(cè)前爪伸展不完全；2分：爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行時(shí)身體向右側(cè)傾倒；4分：意識喪失，行走不能。1～3分為造模成功，0、4分大鼠剔除。治療組于再灌注開始時(shí)給予烏司他丁2萬U/kg腹腔注射；假手術(shù)組及對照組用相同劑量的生理鹽水替代。

1．2．2 JNK表達(dá)的檢測：每組隨機(jī)抽取6只大鼠，于冰塊上行快速斷頭取腦，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱中備用，采用RT-PCR法檢測大鼠病變側(cè)腦組織JNK的表達(dá)。將大鼠缺血側(cè)腦組織常規(guī)研磨提取總RNA。JNK大小為343 bp，上游引物：5′-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3′，下游引物：5′-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3′，內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物大小為568 bp，上游引物：CCCATCTATGAGGGTTAC，下游引物：GGAAGGTGGACAGTGAG。嚴(yán)格按照北京全式金生物技術(shù)有限公司RT-PCR和TRIZOL試劑盒說明書提供方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；52 ℃退火35 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。最后進(jìn)行電泳測定，在紫外線投射儀下對跑好的電泳條帶進(jìn)行觀察并照相，用圖像記錄儀和分析系統(tǒng)對所得條帶進(jìn)行光密度(OD)掃描分析，JNK的水平用JNK和DNA β-actin的DNA條帶灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠腦組織JNK表達(dá)比較 與假手術(shù)組(0.395±0.053)相比，對照組(1.384±0.145)和治療組(0.587±0.079)大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)JNK的表達(dá)明顯升高。與對照組相比，治療組大鼠腦組織JNK的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。見圖1。

2．2 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較 與假手術(shù)組[(5.60±0.89)個(gè)/HP]相比，對照組[(51.4±3.95)個(gè)/HP]和治療組[(26.8±3.14)個(gè)/HP]凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加(均P<0.05)。與對照組相比，治療組凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)。 見圖2。

圖1 JNK mRNA的表達(dá) 1：假手術(shù)組；2：缺血再灌注組；3：治療組

圖2 各組腦組織Tunel 陽性細(xì)胞數(shù)(×400) A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：治療組

3 討論

缺血再灌注是一病理過程，其特征是初始限制一個(gè)器官的血液供應(yīng)，隨后恢復(fù)灌注和伴隨的氧氣恢復(fù)，再灌注存在加重缺血性損傷可能。缺血器官代謝供需的不平衡導(dǎo)致嚴(yán)重的組織缺氧和微血管功能障礙，再灌注進(jìn)一步促進(jìn)了先天的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的活性和細(xì)胞死亡程序。缺血和再灌注導(dǎo)致細(xì)胞死亡程序的激活，特別是缺血階段轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)發(fā)生重大變化，再灌注的特點(diǎn)是自身免疫反應(yīng)，包括自然抗體識別新抗原和隨后激活補(bǔ)體系統(tǒng)的自身免疫。缺血和再灌注激活多種細(xì)胞死亡程序，包括細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡、壞死。細(xì)胞凋亡是一個(gè)半胱天冬酶信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個(gè)獨(dú)立的程序，表現(xiàn)為細(xì)胞及胞核的收縮，其核細(xì)胞膜一直保持完整性，這個(gè)過程一直被視為免疫刺激性低于壞死。最近的研究表明，來自于凋亡細(xì)胞釋放的細(xì)胞外ATP通過泛連蛋白半通道扮演“找到我”信號吸引吞噬細(xì)胞[2]。抑制細(xì)胞凋亡可能在缺血再灌注損傷的治療策略上有一定前途。

JNK是腦缺血再灌注損傷過程中炎癥反應(yīng)和凋亡的重要調(diào)控中介[3]，腦缺血后，JNK信號通路高度激活，促進(jìn)缺血相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和功能障礙。阻斷JNK信號通路已被證明具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受腦缺血再灌注損傷的作用，促進(jìn)神經(jīng)元存活。JNK的信號級聯(lián)由上游激酶和磷酸酶之間的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。JNK通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，包含多種家族酶系，其中MAPK激酶激酶(MLKs/MAPKKK)激活MAPK激酶4/7(MKK4/7)，MKK4/7進(jìn)一步磷酸化JNK 183位蘇氨酸殘基和185位酪氨酸殘基使其激活。抑制MLK3和MKK4/7阻止上游激酶級聯(lián)涉及JNK失活。Akt稱為神經(jīng)保護(hù)蛋白質(zhì)，可通過阻斷上游激酶下調(diào)JNK的活性。在腦缺血狀態(tài)下Akt通過磷酸化SEK 180位絲氨酸使其失活進(jìn)一步抑制ASK1-SEK1-JNK2 信號通路[5]。有報(bào)道顯示，PI3K/Akt信號級聯(lián)反應(yīng)在PC12細(xì)胞中可以通過抑制MLK3進(jìn)一步下調(diào)MKK-7負(fù)性調(diào)節(jié)JNK通路。與此同時(shí)，缺血預(yù)處理雌激素可上調(diào)Akt活性的表達(dá)，這被認(rèn)為Akt在缺血誘導(dǎo)的損傷中具有保護(hù)作用[6]。磷酸酶可通過直接對其183位蘇氨酸殘基和185位酪氨酸殘基去磷酸化調(diào)節(jié)JNK的活性[7]。急性氧化應(yīng)激已經(jīng)證實(shí)可導(dǎo)致MKP-7從胞核到胞質(zhì)的重新分配和胞質(zhì)JNK的減少。p53是DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)中的重要組成部分，其在細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。上游激活的JNK通路通過調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄進(jìn)而激活p53，JNK2與p53結(jié)合則阻止其退化和增加其穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞死亡的另外一個(gè)機(jī)制為促凋亡Bcl-2家族的轉(zhuǎn)換。作為促凋亡Bcl-2家族的一員，Bim是一種BH3-only蛋白，其功能為對DNA損傷起應(yīng)答和促進(jìn)凋亡。報(bào)道顯示，Bim是以JNK依賴的方式被磷酸化的[8]，JNK1和JNK2可以使另一BH3-only促凋亡蛋白成員Bid在其蘇氨酸59位處發(fā)生磷酸化，進(jìn)而參與caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)。

烏司他丁相對分子量約為6 700，由143個(gè)氨基酸組成，是一種糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑，對多種酶有抑制作用，具有抑制炎癥介質(zhì)釋放及清除氧自由基的作用，多應(yīng)用于肺部疾病和胰腺炎的治療，其在腦血管病的作用集中在其抗炎和抗氧化方面的作用機(jī)制，至于其在細(xì)胞凋亡方面的作用及機(jī)制報(bào)道相對較少。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組凋亡細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相比明顯增加，表明缺血再灌注可引起細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步說明模型制作成功；烏司他丁治療組凋亡細(xì)胞數(shù)與缺血再灌注組相比明顯減少，表明烏司他丁可以抑制缺血再灌注后細(xì)胞凋亡。

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(收稿2017-01-06)

責(zé)任編輯：關(guān)慧

Effects of ulinastatin on the expression of c-Jun N-terminal kinase and apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

Liu Qingjie*，Bai Hongying

*Department of Neurology，the People’s Hospital of Yongcheng City，Yongcheng 476600，China

ObjectiveTo investigate the effects of ulinastatin on the expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK) and apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury．MethodsThirty-six male clean SD rats were divided into three groups by the random number method：sham operation group (SO group，n=12)，cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group，n=12)，cerebral ischemia-reperfusion plus ulinastatin treatment group (treatment group，n=12)．The focal cerebral ischemia-reperfusion injury models were established by using suture-occluded method to block middle cerebral artery．The expression of JNK was detected by using RT-PCR method and the number of apoptosis was detected by TUNEL method．ResultsCompared with the SO group，the treatment group and control group showed high expression of JNK on cortex area and high number of apoptosis (allP<0.05)．Both the expression of JNK and the number of apoptosis in the treatment group were significantly less than those in the control group (allP<0.05)．ConclusionUlinastatin can down-regulate the expression of JNK in brain tissues and can suppress apoptosis which may be related to inhibit JNK conduction path．

Ulinastatin；Ischemia-reperfusion；C-Jun N-terminal kinase；Apoptosis

R-332

A

1673-5110(2017)17-0004-03

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.17.002

劉慶杰(1982—)，男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：腦血管病。Email：lqj820@126.com