趙樹民 虞方伯 葉正錢 方曉波 林海萍#

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復(fù)重點實驗室，浙江 杭州 311300)

耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離及鑒定*

趙樹民1虞方伯2葉正錢2方曉波2林海萍1#

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復(fù)重點實驗室，浙江 杭州 311300)

從黑麥草(LoliumperenneL.)根際土壤中分離到1株耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌LY02，經(jīng)形態(tài)觀察和16SrDNA序列測定以及同源性分析鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。該菌株能夠分泌吲哚乙酸(IAA)，促進磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10mg/L，可以促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于黑麥草對鎘的富集。

產(chǎn)鐵載體細菌 黑麥草 鎘 植物修復(fù) 巨大芽孢桿菌

Abstract: A cadmium-resistant and siderophore-producing strain was isolated from rhizospheric soil ofLoliumperenneL.. Through morphological observation and 16S rDNA sequencing determination (including homology analysis),the strain was identified asBacillusmegaterium. This strain could produce indole-3-acetic acid and accelerate phosphorus dissolved. Moreover,the strain could promote the germination rate ofLoliumperenneL. seeds and resist Cd stress. Therefore,BacillusmegateriumandLoliumperenneL. could benefit each other. The maximum tolerant Cd2+mass concentration ofBacillusmegateriumwas 10 mg/L. At the same time,theBacillusmegateriumcould transform Cd into dissolved bio-available form,easy forLoliumperenneL. to accumulate.

Keywords: siderophore-producing bacteria;LoliumperenneL.; Cd; phytoremediation;Bacillusmegaterium

植物修復(fù)因成本低、污染少、操作簡單等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于土壤重金屬污染修復(fù)中[1]。然而用于植物修復(fù)的大部分超富集植物存在生物量小、生長緩慢、對重金屬具有選擇性等缺點[2]。研究表明，產(chǎn)鐵載體細菌產(chǎn)生的鐵載體能與重金屬結(jié)合形成絡(luò)合物，若產(chǎn)鐵載體細菌與超富集植物共生，有利于提高植物對重金屬的富集效率。然而，目前大部分研究的產(chǎn)鐵載體細菌并不直接來自于超富集植物，存在共生困難等問題。

多年生黑麥草(Lolium perenneL.)是禾本科中產(chǎn)量較高的一種重金屬超富集植物，具有環(huán)境適應(yīng)性強、能耐受多種重金屬、生長速度快、分蘗力強、生物量大等優(yōu)點。2014年，環(huán)境保護部發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，無機污染物中鎘的污染最為嚴重，其點位超標率為7.0%。本研究嘗試從黑麥草根際土壤中篩選耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌，對其進行分離和鑒定，以期為產(chǎn)鐵載體細菌與超富集植物共生、提高植物對重金屬的富集效率提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基的配制

(1)LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl10.0g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。另加20.0g瓊脂變成LB固體培養(yǎng)基。

(2)MSA液體培養(yǎng)基：蔗糖20.0g、L-天冬氨酸2.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、蒸餾水1 000mL，用0.5g8-羥基喹啉除鐵，調(diào)節(jié)pH為7.0。

(3) 無機磷培養(yǎng)基(NBRIP)[3]:葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、KCl0.3g、Ca3(PO4)25.0g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5。

(4)Salkowski’s顯色劑：150mL濃硫酸溶于250mL蒸餾水中，加入7.5mL0.5mol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)。

(5) 鉻天青S(CAS)檢測液[4]：將0.079gCAS溶于50mL蒸餾水中，再加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)，記作溶液A。將0.069g十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶于40mL蒸餾水中，記作溶液B。將溶液A沿?zé)诰従徏尤肴芤築中，攪拌混勻即得CAS檢測液。

1.2 耐鎘細菌的分離、純化

在浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗基地選取長勢較好的黑麥草植株，將其連根帶土裝入滅菌袋中帶回實驗室分離菌種。稱取黑麥草根際土壤10g，裝入三角瓶中并加入100mL無菌水，在150r/min條件下振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸濁液1mL，依次稀釋102、103、104、105、106倍，然后各取100μL涂布于含2mg/LCd2+的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3d，挑取生長良好的單菌落純化，-80 ℃保存。

取含有100mg/LL-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基50mL分裝于250mL三角瓶中，接種分離、純化得到的耐鎘細菌菌液，28 ℃、150r/min振蕩培養(yǎng)2d。

1.3 菌株特性研究

產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)檢測：取5mL菌液于離心管中，6 000r/min離心10min后，取1mL上清液，加2mLSalkowski’s顯色劑，充分混合，黑暗條件下顯色30min， 530nm波長下測定吸光度，以未接種菌株的培養(yǎng)液為參比，每組做3個重復(fù)取平均值并計算IAA濃度。

溶磷能力檢測：采用姜瑛等[5]的方法，將菌液接種于NBRIP中，28 ℃、150r/min條件下培養(yǎng)7d，6 000r/min離心10min后取上清液1mL，采用鉬銻抗比色法測定上清液中溶解性磷含量。以不接種菌株的NBRIP為空白對照，重復(fù)3次取平均值。

產(chǎn)鐵載體能力檢測[6]：取50μL菌液接種到MSA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min條件下培養(yǎng)48h，10 000r/min離心10min，取上清液3mL與3mLCAS檢測液充分混勻，靜置1h，在630nm波長處測定吸光度，用未接種菌株的培養(yǎng)液作參比，重復(fù)3次取平均值，根據(jù)文獻[7]的方法計算鐵載體活性(SU)，SU越大，表明菌株產(chǎn)鐵載體能力越強。

1.4 菌株鑒定

形態(tài)觀察：利用荷蘭飛納Pro掃描電子顯微鏡觀察細菌形態(tài)。

16SrDNA序列測定與同源性分析：聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的正向引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1513R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應(yīng)在94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10min。擴增產(chǎn)物測序后提交GenBank進行同源性比對，并用NJ法在Mega5軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.5 菌株的耐鎘性測試及對土壤中鎘的活化能力

取50μL菌液接種于含Cd2+質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150r/min的搖床中培養(yǎng)3d，觀察其能否生長以獲得菌株的最大耐鎘濃度[8]。

取50μL菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min培養(yǎng)24h，6 000r/min離心10min，取10mL上清液添加到5.0g鎘污染土樣中，充分混勻，重復(fù)3次，置于28 ℃下培養(yǎng)7d后，6 000r/min離心10min，用PerkinElmer7000DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測上清液中Cd2+含量[9]。以未接種菌液的LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.6 菌株對鎘脅迫下黑麥草種子萌發(fā)的影響實驗

菌懸液的制備：取50μL菌液接種于100mLLB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min培養(yǎng)48h，6 000r/min離心10min，棄上清液，再用無菌水沖洗菌體5遍，添加適量無菌水使每毫升菌液中含108cfu的細菌。再添加Cd2+使得Cd2+質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、15mg/L。對照組以等量的無菌水代替50μL菌液。

黑麥草種子(購于臨安種子站)用75%(體積分數(shù))的酒精消毒3min，用無菌水沖洗5遍。選取飽滿的種子放置于墊了兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿50顆，加入上述菌懸液5mL，在溫度為25 ℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以長出1cm的苗長作為發(fā)芽標準，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，培養(yǎng)7d后計算發(fā)芽率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株特性分析

在2mg/LCd2+脅迫下的LB固體培養(yǎng)基中共分離、純化出3株生長良好的耐鎘菌株，分別記作LY01、LY02和LY03。

由表1可見，3株菌株都能產(chǎn)生IAA，能夠促進磷的溶解，具有產(chǎn)鐵載體能力。IAA是植物生長過程中十分重要的生長激素，能調(diào)控植物根、莖、葉的生長和各組織的形成發(fā)育等。由微生物產(chǎn)生的IAA也能促進植物的生長[10]，所以有利于與超富集植物共生。磷是植物生長的必需元素，然而土壤中的磷大部分都以難溶態(tài)的形式存在，植物很難直接利用，若共生細菌能夠促進磷的溶解顯然有利于植物生長。3株菌株中LY02產(chǎn)生的IAA質(zhì)量濃度最高，為26.5mg/L；其溶磷能力最強，溶解性磷質(zhì)量濃度為96.3mg/L；SU最大達到86.1%，屬于高產(chǎn)鐵載體細菌。因此，后續(xù)實驗選取LY02作為目標耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌。

表1 株菌特性分析結(jié)果

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

菌株LY02在LB固體培養(yǎng)基上的菌落為乳白色，近圓形，邊緣規(guī)則，表面光滑，濕潤，不透明。在11 000倍掃描電子顯微鏡下觀察到的形態(tài)為桿狀，產(chǎn)近球形芽孢(見圖1)。

圖1 菌株LY02在掃描電子顯微鏡下的形態(tài)(×11 000)Fig.1 Morphology of strain LY02 under the scanning electron microscope(×11 000)

從圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果看，菌株LY02與BacillusmegateriumNBRC 15308的相似性最高，因此可以推斷LY02為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，與形態(tài)分析結(jié)果也一致。

圖2 菌株LY02的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LY02

2.3 菌株的耐鎘性和對土壤中鎘的活化能力

耐鎘性測試結(jié)果表明，耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌巨大芽孢桿菌對Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10 mg/L。

在對土壤中鎘的活化能力實驗中，實驗組Cd2+質(zhì)量濃度達到6.5 mg/kg，而對照組Cd2+質(zhì)量濃度僅為4.2 mg/kg。也就是說，耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌巨大芽孢桿菌能促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于超富集植物對鎘的富集，提高富集效率。

2.4 菌株對黑麥草種子發(fā)芽率的影響

種子發(fā)芽是植物生長的起點和關(guān)鍵時期，此時種子對外界環(huán)境十分敏感。其中發(fā)芽率是非常直觀的指標。黑麥草種子在不同Cd2+濃度脅迫環(huán)境中的發(fā)芽率如圖3所示。從圖3可以看出，無論是實驗組還是對照組，隨著Cd2+濃度的升高黑麥草種子發(fā)芽率均下降。在相同Cd2+濃度脅迫下，實驗組由于與巨大芽孢桿菌共生，黑麥草發(fā)芽率高于對照組，低濃度時這種差異不顯著，但高濃度時差異顯著(P<0.01)。因此，耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌巨大芽孢桿菌與黑麥草種子共生有利于提高其發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力。

注：相同字母表示在P<0.01水平上差異不顯著，不同字母表示在P<0.01水平上差異顯著。

圖3巨大芽孢桿菌對鎘脅迫下黑麥草種子發(fā)芽率的影響
Fig.3 Effects ofBacillusmegateriumon germination rate ofLoliumperenneL. seeds under Cd stress

3 結(jié) 論

從黑麥草根際土壤中分離得到耐鎘產(chǎn)鐵載體細菌LY02，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌。該菌株能夠分泌IAA，促進磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10 mg/L，可以促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于黑麥草對鎘的富集。

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Isolationandidentificationofacadmium-resistantandsiderophores-producingstrain

ZHAOShumin1,YUFangbo2,YEZhengqian2,FANGXiaobo2,LINHaiping1.

(1.NationalJointEngineeringLaboratoryofBiopesticidePreparation,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,HangzhouZhejiang311300；2.KeyLaboratoryofSoilContaminationBioremediationofZhejiangProvince,HangzhouZhejiang311300)

趙樹民，男，1992年生，碩士研究生，主要從事土壤生態(tài)修復(fù)研究。#

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*浙江省重點創(chuàng)新團隊項目(No.2013TD12);浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(No.2015C32078)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.014

2016-11-10)