崔迪，王勝，葛明月，王芹，殷姜文，代志剛，司軍強(qiáng)

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 麻醉科，新疆 石河子832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，新疆 石河子 832000）

細(xì)胞外信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)激酶5在異氟醚后處理減輕大鼠海馬腦片缺氧無(wú)糖損傷中的作用*

崔迪1，王勝1，葛明月1，王芹1，殷姜文1，代志剛1，司軍強(qiáng)2

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 麻醉科，新疆 石河子832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，新疆 石河子 832000）

目的探討異氟醚后處理大鼠海馬腦片缺氧無(wú)糖（OGD）損傷神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中細(xì)胞外信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）的作用。方法使用雄性SD大鼠，將其麻醉后取出海馬組織，制成離體腦片，然后隨機(jī)進(jìn)行正常對(duì)照組（Con組）、損傷組（OGD組）和藥物處理組的處理。采用花粉活力染色（TTC）法評(píng)價(jià)各組腦片損傷程度，采用碘化丙啶（PI）染色法檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測(cè)定細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信使核糖核酸（ERK5 mRNA）的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)ERK5蛋白的表達(dá)與磷酸化水平。結(jié)果與Con組比較，OGD組腦片損傷程度升高、海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多，海馬組織內(nèi)ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)升高（P＜0.05）；XMD組阻斷ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)，腦片損傷程度升高、海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多（P＜0.05）。與OGD、1.5%ISPOC和4.5%ISPOC組比較，3.0%ISPOC組腦片損傷程度減輕、海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞減少，海馬組織內(nèi)ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)升高（P＜0.05）。與3.0%ISPOC組比較，XMD阻斷ISPOC海馬組織內(nèi)ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)，腦片損傷程度升高、海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多（P＜0.05）。結(jié)論一定濃度的異氟醚后處理大鼠海馬腦片對(duì)抗OGD損傷的保護(hù)性機(jī)制可能與上調(diào)ERK5 mRNA和ERK5磷酸化水平有關(guān)。

麻醉藥；異氟醚后處理；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)MAP激酶類；腦缺血；海馬

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of extracellular signal-regulated protein kinase 5 (ERK5)on Isoflurane posttreatment-mediated decrease of hippocampal injury in rat models of oxygen-glucose deprivation(OGD).MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups:the normal control(Con)group,the OGD group,the XMD group,and the ISPOC group.Rats were anesthetized followed by harvest of the hippocampus for further preparation of tissue slices.Histological analysis of hippocampus was achieved by 2%2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining.Neuronal apoptosis in hippocampus CA1 region wasanalyzed by propidium iodide(PI)fluorescence staining.The expression level of ERK5 mRNA was determined by real-time fluorescent PCR.The ERK5 protein expression and phosphorylation were detected by Western blot.ResultsCompared with the Con group,the degree of hippocampal injury,apoptosis rate in hippocampal CA1 region and the expression levels of ERK5 mRNA and p-ERK5 in the OGD group were increased significantly (P＜0.05).In the XMD group,the expression levels of ERK5 mRNA and p-ERK5 were decreased,and the degree of tissue injury and the apoptosis rate in hippocampal CA1 region increased (P＜0.05).Compared with the group 3.0%ISPOC,XMD8-92 independently diminished the expression of ERK5 mRNA and phosphorylation of ERK5 in the hippocampus,and enhanced tissue injury as well as apoptosis rate in the XMD+ISPOC group (P＜0.05).ConclusionsThe protective effect of Isoflurane posttreatment on hippocampal OGD injury in rats may be related to the upregulation of ERK5 mRNA and phosphorylation of ERK5.

Keywords:anesthetics;Isoflurane posttreatment;extracellular signal-regulated MAP kinases;brain ischemia;hippocampus

近年來(lái)急性缺血性腦損傷已成為全世界致殘致死的主要原因之一，在臨床診療過(guò)程中也存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)低灌注狀態(tài)的高風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，因此其在圍術(shù)期中的管理一直受到麻醉醫(yī)生的重視[3]。麻醉藥物具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且其后處理減少缺血性損傷更具有臨床意義[4]。由于異氟醚是一種具有適用范圍廣泛、刺激性小及蘇醒快特點(diǎn)的常用麻醉藥物，因此一直以來(lái)都是學(xué)者們?cè)诒Ｗo(hù)神經(jīng)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象，但是作用機(jī)制尚未完全明確[5]。許多研究表明，影響缺血損傷后腦神經(jīng)細(xì)胞的存活因素包括一系列信號(hào)通路，其中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族就是具有代表性的一個(gè)信號(hào)蛋白超家族，而最新發(fā)現(xiàn)該家族成員細(xì)胞外信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)激酶5（extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5）有較大C末端結(jié)構(gòu)，而且具有抑制和核穿梭功能，可不干擾MAPK家族其他成員的功能，因此更適用于特定靶點(diǎn)的藥物開發(fā)[6-7]。目前，關(guān)于ERK5在異氟醚神經(jīng)保護(hù)中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究擬利用經(jīng)典的大鼠海馬腦片缺氧無(wú)糖損傷（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，探討ERK5在異氟醚神經(jīng)保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性SD大鼠體重50～100 g（新疆石河子大學(xué)生理教研室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），異氟醚（批號(hào)：64140902，山東省臨沂魯南制藥集團(tuán)），ERK5抑制劑XMD8-92（美國(guó)Selleck Chemicals公司），二甲基亞砜（DMSO）（批號(hào)：302A0324，美國(guó)Sigma Aldrich公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠海馬腦片的復(fù)制使用10%水合氯醛（0.4 g/100 g）經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉，達(dá)到一定麻醉深度后，迅速斬首將其安樂(lè)死，取腦組織，置于0～4℃預(yù)充95%氧氣O2～5%二氧化碳CO2混合氣的含糖人工腦脊液（ACSF，mmol/L：NaCl 124，KCl 3.3，NaHCO325.7；NaH2PO41.24，MgSO42.4，CaCl22.4，Glu 10，pH 7.35～7.45）中，在冰臺(tái)上快速剝離出完整的海馬組織。使用NVSL振動(dòng)切片機(jī)（美國(guó)Campden Instruments公司）在距海馬長(zhǎng)軸兩端10 mm處矢狀面切片，厚度為400 μm，然后將海馬腦片移至設(shè)定溫度為34℃裝有含糖ACSF的灌流槽中，并向其內(nèi)浸潤(rùn)式通入95%O2～5%CO2混合氣體孵育90 min，以修復(fù)制備過(guò)程中的損傷。隨后可將部分腦片移入37℃含糖ACSF的灌流槽中，并向其內(nèi)浸潤(rùn)式通入95%O2～5%CO2混合氣體孵育30 min，作為正常對(duì)照組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組將腦片隨機(jī)進(jìn)行不同的分組處理，包括：正常對(duì)照組（Con組）、缺氧無(wú)糖損傷組（OGD組）、異氟醚后處理組（ISPOC組）、二甲基亞砜組（DMSO組）、ERK5抑制劑XMD8-92（XMD組）、ERK5抑制劑+3.0%異氟醚后處理組（XMD+ISPOC組）。其中，異氟醚后處理組分為3個(gè)濃度亞組（1.5%ISPOC組、3.0%ISPOC組和4.5%ISPOC組）。

1.2.3 缺氧無(wú)糖損傷模型的復(fù)制海馬腦片在90min修復(fù)后，改用37℃的無(wú)糖人工腦脊液（glu-free ACSF，mmol/L：NaCl 124，KCl 3.3，NaHCO325.7，NaH2PO41.24，MgSO42.4，CaCl22.4，蔗糖 10，pH 7.35～7.45）并通入95%氮?dú)釴2～5%CO2混合氣體孵育14 min，然后再使用37℃含糖的ACSF并通入95%O2～5%CO2混合氣體孵育30 min，即復(fù)糖復(fù)氧。

1.2.4 腦片的異氟醚后處理在對(duì)腦片進(jìn)行異氟醚后處理前，預(yù)先準(zhǔn)備好等量的含有異氟醚的無(wú)氧無(wú)糖的ACSF和含有異氟醚的有氧含糖ACSF，配制方法如下：將預(yù)先加濕加熱的95%N2～5%CO2混合氣連接異氟醚揮發(fā)罐（德國(guó)Drager公司）的進(jìn)氣端，出氣端通入無(wú)糖ACSF中平衡20 min，并將異氟醚揮發(fā)罐連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀（德國(guó)Drager公司）測(cè)定通入ACSF中的異氟醚濃度，參照本課題組前期科研成果[8]，選取1.5%、3.0%和4.5%3個(gè)異氟醚濃度梯度；再采用同樣的方法配制含有相應(yīng)濃度異氟醚的有氧含糖ACSF。然后用95%N2～5%CO2平衡后的含異氟醚的無(wú)糖ACSF，于OGD結(jié)束前5 min灌注腦片。在OGD結(jié)束時(shí)，改用95%O2～5%CO2平衡后的含異氟醚的含糖ACSF繼續(xù)灌注5 min，然后復(fù)氧復(fù)糖25 min，整個(gè)過(guò)程中異氟醚后處理10 min，復(fù)氧復(fù)糖30 min。

1.2.5 腦片的抑制劑處理將腦片用ERK5抑制劑XMD8-92（10μmol/L）在OGD前另外預(yù)孵育10min，然后OGD處理14 min，復(fù)氧灌流30 min；XMD8-92是通過(guò)特異性抑制BMK1/ERK5信號(hào)通路，從而化學(xué)阻斷ERK5活化組。（XMD+ISPOC）組將使用抑制劑XMD8-92與異氟醚后處理聯(lián)合同時(shí)進(jìn)行。DMSO組將腦片在34℃的ACSF中孵育80 min時(shí)，將XMD8-92的溶劑DMSO加入到ACSF中孵育10 min，然后復(fù)氧復(fù)糖30 min。

1.2.6 腦片損傷程度的測(cè)定腦片復(fù)氧灌流后，避光下進(jìn)行操作，用2%2，3，5-氯化三苯四唑（TTC）（批號(hào)：204H032，北京索萊寶科技公司）在35℃下染色30 min。隨后用生理鹽水沖洗，腦片表面水分用濾紙吸收，對(duì)腦片稱重，以1 g∶20 ml的量，避光在4℃下對(duì)腦片中紅色物質(zhì)甲瓚用1∶1的乙醇和DMSO復(fù)合物抽提24 h，次日將抽提液加至96孔板（每孔100 μl），酶標(biāo)儀測(cè)得在490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD490值）。各組腦片的TTC染色下降百分率即為組織損傷百分率，按如下方法計(jì)算：（1-OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490對(duì)照組）×100%，將計(jì)算組織損傷百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（OD490值越小，說(shuō)明TTC染色下降的越大，腦片損傷越嚴(yán)重）。

1.2.7 凋亡細(xì)胞數(shù)的測(cè)定復(fù)氧灌流后，每組隨機(jī)取8～10張腦片，避光下進(jìn)行操作，用碘化丙啶（PI）（批號(hào)：MKBP1360V，美國(guó)Sigma Aldrich公司）加入ACSF中（2 μl/ml），37℃下，避光灌流細(xì)胞核染色 60 min，并通入95%O2～5%CO2混合氣體。然后用磷酸鹽緩沖液沖洗，浸入4%多聚甲醛中固定10 min，甘油封片。用激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)光波530 nm，發(fā)射光波620 nm，LSM510，德國(guó)Zeiss公司）觀察各組CA1區(qū)PI染色凋亡細(xì)胞核呈紅色熒光的強(qiáng)度變化，使用Aim-Image Examiner軟件（德國(guó)Zeiss公司）測(cè)定熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（即PI熒光強(qiáng)度越大，代表凋亡細(xì)胞越多）。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time fluorescent polymerase chain reaction，qRTPCR）檢測(cè)ERK5 mRNA的表達(dá)取冷凍保存于-80℃冰箱中的各組腦片（70±10）mg，在冰盒上用液氮研磨方式打破細(xì)胞，使用Brizol（杭州博日科技有限公司）從腦組織勻漿中提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。利用互補(bǔ) DNA（complementary DNA，cDNA）第一鏈合成試劑盒（杭州博日科技有限公司）進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Bio-Rad公司）設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄條件為：室溫預(yù)變性10 min，45℃變性45 min，95℃退火5 min，冰浴5 min。本實(shí)驗(yàn)中使用的特異性序列引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。ERK5，正向引物：5'-CTT CCAACCTCCTGCTGAAC-3'；反向引物：5'-GTCCAG CCAGAGGGTCAGTA-3'。MACTB，正向引物：5'-TT CCTTCTTGGGTATGGAAT-3'；反向引物：5'-GAGCA ATGATCTTGATCTTC-3'。逆轉(zhuǎn)錄后獲取 cDNA，SYBR GreenⅠreal time PCR試劑盒（杭州博日科技有限公司）配置反應(yīng)液。ABI 7500（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行熒光定量PCR過(guò)程，按如下條件進(jìn)行：94℃熱啟動(dòng) 2 min，95℃變性 15 s，60℃退火30 s，然后40個(gè)循環(huán)。通過(guò)每個(gè)循環(huán)增加的相對(duì)熒光測(cè)定擴(kuò)增量，獲得每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的循環(huán)閾值（Ct值），按照 ΔCT=Ct目的基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，將計(jì)算出來(lái)的 2-ΔΔCt值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9 免疫印跡法（Western blot）測(cè)定ERK5和磷酸化ERK5的表達(dá)水平在冰盒上，取各組大鼠海馬腦片，使用含有PMSF和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）將剪碎的組織裂解、超聲波充分裂解2 s，然后離心15 min（4℃，12000r/min），取上清液。抽取各組等量總蛋白50μg分別加入到10%SDS-聚乙烯酰胺凝膠的孔中進(jìn)行電泳分離，并用預(yù)染蛋白質(zhì)Marker（北京Solarbio公司）作為分子量標(biāo)記。電泳結(jié)束后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國(guó)Roche公司），使用5%脫脂奶粉或牛血清蛋白（BSA）室溫封閉2 h后，4℃下孵育特異性一抗過(guò)夜，ERK5一抗（1∶1 000，美國(guó)Abcam公司），p-ERK5一抗（1∶1 000，美國(guó) Cell Signaling公司）和 β-actin（1∶1 000，北京中山金橋生物技術(shù)公司）。二抗孵育濃度為1∶20000，室溫孵育2h。暗室曝光：膜上均勻涂抹發(fā)光試劑，顯影，定影，曝光膠片。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件（Gel-pro analyzer，美國(guó)Media Cybernetics公司）測(cè)定條帶灰度值，將目的蛋白的灰度值與β-actin的灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett'st檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬腦片的損傷程度

與Con組比較，OGD組、XMD組和（XMD+ISPOC）組吸光度（optical density，OD）值降低、腦片損傷程度升高（P＜0.05），DMSO組OD值、損傷程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OGD組比較，3.0%ISPOC組OD值升高、損傷程度降低（P＜0.05）；而與3.0%ISPOC 組比較，1.5%ISPOC 組、4.5%ISPOC組、XMD組及（XMD+ISPOC）組OD值降低、損傷程度升高（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠海馬腦片OD490值和損傷百分率的比較（±s）

表1 各組大鼠海馬腦片OD490值和損傷百分率的比較（±s）

注：1）與 Con 組比較，P＜0.05；2）與 OGD 組比較，P＜0.05；3）與3.0%ISPOC組比較，P＜0.05

組別 OD490值 組織損傷百分率/%Con組 0.59±0.04 0.00 OGD組ISPOC組0.28±0.03 53.22±1.791）1.5%ISPOC 組 0.32±0.05 44.85±5.571）2）3）3.0%ISPOC 組 0.45±0.04 23.93±2.461）2）4.5%ISPOC 組 0.31±0.04 47.81±3.851）3）DMSO 組 0.56±0.04 4.55±2.12）3）XMD 組 0.18±0.03 70.03±3.521）2）3）XMD+ISPOC 組 0.21±0.03 63.68±2.81）2）3）F值 - 344.000 P值 - 0.000

2.2 各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度

PI染色后各組腦片顯示，與Con組比較，OGD組、XMD組及（XMD+ISPOC）海馬CA1區(qū)凋亡的細(xì)胞增多（P＜0.05），DMSO組細(xì)胞凋亡程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與 OGD 組比較，1.5%ISPOC 組、3.0%ISPOC組及4.5%ISPOC組海馬CA1區(qū)凋亡的細(xì)胞減少（P＜0.05）；而與 3.0%ISPOC組比較，1.5%ISPOC組和4.5%ISPOC組海馬CA1區(qū)凋亡的細(xì)胞增多，XMD組和（XMD+ISPOC）組海馬CA1區(qū)凋亡的細(xì)胞增多（P＜0.05）。以上各組海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度比較的檢測(cè)結(jié)果與各組腦片損傷程度比較的檢測(cè)結(jié)果基本相一致。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度的比較（±s）

表2 各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度的比較（±s）

注：1）與 Con 組比較，P＜0.05；2）與 OGD 組比較，P＜0.05；3）與3.0%ISPOC組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡程度Con組 15.18±6.53 OGD組ISPOC組99.1±17.771）1.5%ISPOC 組 37.11±6.011）2）3）3.0%ISPOC 組 23.87±8.972）4.5%ISPOC 組 45.12±8.421）2）3）DMSO 組 22.99±6.052）3）XMD 組 102.84±9.951）3）XMD+ISPOC 組 108.07±6.761）3）F值 173.11 P值 0.000

2.3 各組大鼠海馬腦片ERK5 mRNA的表達(dá)

ERK5 mRNA在各組腦片中的表達(dá)水平為：Con組（1.00±0.00）、OGD 組（2.63±0.25）、1.5%ISPOC組（2.25±0.06）、3.0%ISPOC 組（5.53±0.22）、4.5%ISPOC 組（1.24±0.25）、DMSO 組（1.18±0.11）、XMD組（0.16±0.04）及（XMD+ISPOC）組（0.27±0.02），以上各組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=379.05，P=0.000）。與Con組比較，OGD組、1.5%ISPOC組及3.0%IS POC組ERK5 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），XMD組和（XMD+ISPOC）組 ERK5 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），DMSO組ERK5 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OGD組比較，3.0%ISPOC組ERK5 mRNA表達(dá)上調(diào) （P＜0.05），4.5%ISPOC 組、XMD 組和（XMD+ISPOC）組 ERK5 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與3.0%ISPOC組比較，1.5%ISPOC組、4.5%ISPOC組、XMD組及（XMD+ISPOC）組 ERK5 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠海馬腦片ERK5信號(hào)蛋白的表達(dá)

Con組、OGD組、1.5%ISPOC組、3.0%ISPOC組及4.5%ISPOC組海馬腦片p-ERK5蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.07，P=0.000）。與Con組比較，OGD組、1.5%ISPOC組、3.0%ISPOC組及4.5%ISPOC組ERK5磷酸化蛋白水平升高（P＜0.05）；與OGD組比較，3.0%ISPOC組ERK5磷酸化蛋白水平升高（P＜0.05）；與 3.0%ISPOC 組比較，1.5%ISPOC組和4.5%ISPOC組ERK5磷酸化蛋白水平降低（P＜0.05）（見(jiàn)附圖 A）。Con組、OGD 組、3.0%ISPOC 組、DMSO組、XMD組及（XMD+ISPOC）組海馬腦片p-ERK5蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=174.08，P=0.000）。與Con組比較，DMSO組ERK5磷酸化蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），單純使用ERK5抑制劑XMD8-92后，ERK5磷酸化蛋白表達(dá)水平降低，XMD8-92與3.0%異氟醚聯(lián)合處理后，ERK5磷酸化蛋白表達(dá)水平也降低（P＜0.05）（見(jiàn)附圖B）。以上各組中磷酸化的ERK5表達(dá)結(jié)果與ERK5 mRNA的表達(dá)結(jié)果相一致。

附圖 各組大鼠海馬腦片p-ERK5蛋白的表達(dá)

3 討論

研究表明，異氟醚誘導(dǎo)Ras-Raf-MEK-ERK通路磷酸化激活，減少神經(jīng)元壞死，從而提供神經(jīng)保護(hù)作用[9]。MAPK信號(hào)通路中上調(diào)磷酸化的ERK1/2和抑制磷酸化的JNK、p38能夠?qū)谷毖T導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。而ERK5是MAPK家族的新成員，在海馬CA1區(qū)，缺血預(yù)處理通過(guò)增加活化的p-Bad和14-3-3蛋白結(jié)合，使ERK5上調(diào)逆轉(zhuǎn)活化的c-JNK下調(diào)，以及c-fos上調(diào)[12]?；罨腅RK5能促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)，從而修復(fù)缺血區(qū)域損傷的組織[13]。異氟醚能夠上調(diào)神經(jīng)保護(hù)蛋白Bcl-2和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF），從而增強(qiáng)神經(jīng)元存活[9]。有研究表明，ERK5可通過(guò)與KLF4通路級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)略高水平的H2O2活性氧預(yù)處理和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），來(lái)減少原代海馬神經(jīng)元死亡[14]。

本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，OGD組海馬腦片損傷程度升高、海馬腦片CA1區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增多，提示大鼠海馬腦片缺氧無(wú)糖損傷模型復(fù)制成功。與OGD組比較，1.5%ISPOC組和3.0%ISPOC組損傷程度降低，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明1.5%和3.0%濃度的異氟醚后處理對(duì)大鼠海馬腦片OGD損傷起到保護(hù)作用；且3.0%ISPOC組ERK5 mRNA和p-ERK5的表達(dá)升高，而XMD8-92阻斷3.0%ISPOC組海馬組織內(nèi)ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)后，腦片損傷程度升高、海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多，說(shuō)明異氟醚后處理對(duì)大鼠海馬腦片OGD損傷的保護(hù)作用可能與ERK5 mRNA和p-ERK5的表達(dá)上調(diào)有關(guān)；4.5%濃度的異氟醚后處理并未起到保護(hù)作用，且ERK5 mRNA降低。與3.0%ISPOC組比較，1.5%ISPOC組和4.5%ISPOC組損傷程度高，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡多，ERK5 mRNA和p-ERK5的表達(dá)低，說(shuō)明一定濃度的異氟醚后處理可通過(guò)上調(diào)ERK5 mRNA和p-ERK5來(lái)減輕大鼠海馬腦片OGD損傷，但是其濃度范圍的掌握還應(yīng)由更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)和精準(zhǔn)化。在本研究中觀察3.0%ISPOC組神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)，所以選擇3.0%濃度異氟醚來(lái)進(jìn)一步完成ERK5抑制劑聯(lián)合異氟醚后處理組，即XMD+ISPOC組。使用DMSO作為ERK5抑制劑XMD8-92的溶劑，與Con組比較，DMSO組損傷程度和凋亡程度無(wú)差異，可排除對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；XMD組腦片損傷程度升高、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，ERK5 mRNA表達(dá)低，可見(jiàn)XMD8-92為強(qiáng)效的選擇性的BMK1/ERK5抑制劑阻斷ERK5信號(hào)通路后，腦片表現(xiàn)出易受損的狀態(tài)。然而OGD處理后，大鼠海馬區(qū)ERK5 mRNA和p-ERK5表達(dá)升高，可能與刺激機(jī)體自身保護(hù)反應(yīng)有關(guān)，且有研究證實(shí)海馬區(qū)的ERK5在大鼠缺血后迅速被激活[15]。

綜上所述，一定濃度的異氟醚后處理大鼠海馬腦片對(duì)抗OGD損傷的保護(hù)性機(jī)制可能與上調(diào)ERK5 mRNA和ERK5磷酸化水平有關(guān)。在圍術(shù)期管理中，異氟醚介導(dǎo)的ERK5信號(hào)蛋白作為一種可能干預(yù)和防治缺血性腦損傷的目標(biāo)靶點(diǎn)，隨著研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入，期望探索出它與其他通路在信號(hào)交互對(duì)話關(guān)系中扮演的角色，以及明確其在腦保護(hù)過(guò)程中的獨(dú)特作用。

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Involvement of ERK5 in Isoflurane posttreatment-mediated protective effect on hippocampal oxygen-glucose deprivation injury in rats*

Di Cui1,Sheng Wang1,Ming-yue Ge1,Qin Wang1,Jiang-wen Yin1,Zhi-gang Dai1,Jun-qiang Si2
(1.Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832008,China;2.Department of Physiology,Medical College of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

R332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.001

1005-8982（2017）21-0001-06

2017-02-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81360203）

王勝，E-mail：iamsheng2006@163.com；Tel：18935701573