吳燕　彭芳　吳斌

摘要：基于表面增強(qiáng)拉曼光譜方法（surface-enhanced raman spectroscopy，簡稱SERS）與快速溶劑提取前處理技術(shù)，建立茶葉中樂果農(nóng)藥殘留的快速檢測方法。以金納米粒子為增強(qiáng)基底，分別采集不同濃度樂果溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜和不同濃度以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜；采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進(jìn)行凈化處理，去除基質(zhì)中葉綠素、礦物質(zhì)、茶多酚、碳水化合物等物質(zhì)的干擾；762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰可作為鑒定樂果農(nóng)藥的峰。結(jié)果表明，茶葉中樂果農(nóng)藥最低濃度能達(dá)到1.0 mg/L以下；對不同濃度以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)762 cm-1處特征峰強(qiáng)度與樂果濃度在 1～10、8～25 mg/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；配制3個濃度樣本驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，平均回收率為93.89%～96.36%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.59%～4.87%，均小于5.00%，說明用該方法檢測茶葉中的樂果農(nóng)藥具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

關(guān)鍵詞：表面增強(qiáng)拉曼光譜；樂果農(nóng)藥；茶葉；殘留；快速檢測

中圖分類號： TQ450.2+63文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0160-04

樂果是茶葉種植中使用最廣泛的農(nóng)藥之一，對多種害蟲具有很高的毒效作用，殺蟲范圍廣。樂果農(nóng)藥隨農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入人體后，藥效能達(dá)到1周左右，會抑制體內(nèi)膽堿酯酶活性，造成神經(jīng)生理功能紊亂，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的身心健康[1-2]。目前，農(nóng)藥殘留常規(guī)檢測方法有氣相色譜法（GC）[3]、高效液相色譜法（HPLC）[4]等，這些方法具有準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，但前處理復(fù)雜、成本高、檢測速度慢、不適合現(xiàn)場實(shí)時快速檢測篩選。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman spectroscopy，簡稱SERS）技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對微量樣品的快速檢測，具有樣品制備簡單、操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已逐步應(yīng)用于食品和農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留快速檢測[5-7]。Li等利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)初步探討了蘋果中甲拌磷和倍硫磷的快速無損檢測方法[8]。Kim等以苯并咪唑類為研究對象，采集不同pH值下待測溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，對拉曼譜峰進(jìn)行歸屬[9]。張萍等采用快速溶劑提取前處理方法和表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測技術(shù)建立豆芽中6-BA殘留物質(zhì)的快速檢測方法[10]。Shende等采用固相萃取技術(shù)對橙汁進(jìn)行前處理，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，檢測最低濃度為50 μg/L[11]。近年來，已有研究者將表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)用于茶葉的品質(zhì)檢測[12-13]，但目前還未見利用拉曼光譜技術(shù)分析茶葉中樂果農(nóng)藥殘留的相關(guān)報道。

本研究以商業(yè)化的金納米顆粒為基底，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對茶葉中樂果農(nóng)藥殘留進(jìn)行定性定量分析。以有機(jī)綠茶為研究載體，利用快速溶劑提取前處理的方法提取含農(nóng)藥殘留茶葉的提取液，采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進(jìn)行凈化處理，去除基質(zhì)中葉綠素、礦物質(zhì)、茶多酚、碳水化合物等物質(zhì)的干擾，建立茶葉中樂果農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，為茶葉生產(chǎn)過程中的農(nóng)藥殘留檢測提供快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測方案。

1材料與方法

1.1原料

樂果標(biāo)準(zhǔn)品（99%，河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，河北冠龍農(nóng)化有限公司）；表面增強(qiáng)試劑（OTR202、OTR103，歐普圖斯光學(xué)納米科技有限公司）；硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳（河北冠龍農(nóng)化有限公司）；有機(jī)綠茶；超純水。

1.2試驗(yàn)儀器

高靈敏度激光拉曼光譜儀（RamTracer-200-HS，歐普圖斯光學(xué)納米科技有限公司）；渦旋混合器（VORTEX-5，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（KQ-500GTDV，上海精密儀器有限公司）；精密天平（FA135S，精度為0.01 mg，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取25 mg樂果標(biāo)準(zhǔn)品放入250 mL棕色容量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，待完全溶解后定容至刻度，得到濃度為100 mg/L的樂果標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液待用：50.0、20.0、15.0、10.0、8.0、5.0、40、2.0、1.0、0.5 mg/L。

1.4以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液配制

1.4.1空白茶葉提取液的提取準(zhǔn)確稱取5 g茶葉樣品，放入離心管中，加入乙腈10 mL，渦旋1 min，再超聲提取2 min，以 4 200 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液。

1.4.2以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液配制取5 mL茶葉提取液和5 mL濃度為100 mg/L的樂果標(biāo)準(zhǔn)儲備液放入 15 mL 離心管中，渦旋、振蕩、混合均勻，得到50 mg/L以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液。

1.4.3凈化將含有樂果農(nóng)藥殘留的溶液加入裝有一定量的硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳的離心管中，混合振蕩 1 min，以4 200 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，去除基質(zhì)中葉綠素、礦物質(zhì)、茶多酚、碳水化合物等物質(zhì)的干擾，取上清液用于拉曼光譜檢測。

以同樣方法，分別制備濃度為25.0、20.0、16.0、12.0、10.0、8.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mg/L的以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液。

1.5光譜數(shù)據(jù)采集

拉曼光譜采集參數(shù)：激發(fā)光源波長為785 nm，功率為 200 mW，光譜掃描范圍為400～1 800 cm-1，分辨率為 4 cm-1，積分時間為10 s，積分2次求平均值。向石英進(jìn)樣瓶中加入500 μL濃度為50 mg/L的樂果溶液，放入樣品池中采集樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的普通拉曼光譜；向石英進(jìn)樣瓶中加入以茶葉提取液為基質(zhì)的500 μL濃度為50 mg/L的溶液，放入樣品池中，采集以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液普通拉曼光譜；向石英進(jìn)樣瓶中依次加入500 μL OTR202試劑、20 μL不同濃度的樂果溶液、100 μL OTR103試劑，混合均勻后放入樣品池中，采集待測溶液的表面增強(qiáng)拉曼信號；向石英進(jìn)樣瓶中依次加入500 μL OTR202試劑、20 μL以茶葉提取液為基質(zhì)的樂果溶液、100 μL OTR103試劑，混合均勻后放入樣品池中，采集待測溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜。所有數(shù)據(jù)分析基于激光拉曼光譜儀平臺完成。

2結(jié)果與分析

2.1樂果農(nóng)藥的拉曼光譜分析

2.1.1樂果農(nóng)藥的固體拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜比較

圖1-a是樂果的固體拉曼光譜，圖1-b是濃度為 20 mg/L 樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，光譜采集范圍為400～1 800 cm-1。樂果主要由C[FY=，1]N、C—N、C[FY=，1]O、CH2、C—O、CH3、P—S、N—H等基團(tuán)組成。對比樂果的固體普通拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼譜圖，樂果固體的2個最強(qiáng)峰494、646 cm-1在表面增強(qiáng)拉曼譜圖中沒有出現(xiàn)，而在表面增強(qiáng)拉曼譜圖中出現(xiàn)了一些新的拉曼峰：582、678 cm-1，表明樂果農(nóng)藥分子在金膠的表面發(fā)生了較大的反應(yīng)。在600～1 400 cm-1 范圍內(nèi)，大多數(shù)拉曼峰變化為較小的波數(shù)：764～762、908～902、1 056～1 050、1 164～1 160、1 224～1 210、1 340～1 310 cm-1。

樂果固體和表面增強(qiáng)的拉曼峰及其歸屬如表1所示。762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰強(qiáng)度較高，對這7處特征峰進(jìn)行譜峰歸屬[13]：最強(qiáng)峰出現(xiàn)在 762 cm-1 處，762 cm-1歸屬于P—O拉伸振動；902 cm-1歸屬于C—C伸縮振動，并伴有CH3的搖擺振動；1 050 cm-1歸屬于C—N伸縮振動和C—C伸縮振動；1 160、1 210 cm-1歸屬于CH2搖擺振動；1 310 cm-1歸屬于C—N伸縮振動，并伴有CH2的搖擺振動和N—H的彎曲振動；1 653 cm-1歸屬于C[FY=，1]O的伸縮振動，這些特征譜峰可作為鑒定樂果農(nóng)藥的特征峰。

[FK（W12][TPWY1.tif]

2.1.2樂果農(nóng)藥表面增強(qiáng)拉曼光譜和背景信號光譜的比較

圖2-a是濃度為10 mg/L樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，圖2-b是濃度為10 mg/L樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的普通拉曼光譜，圖1-c是金膠表面增強(qiáng)拉曼光譜，圖1-d是甲醇溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜。對比樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的普通拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼譜，普通拉曼光譜圖只有單一譜峰，且峰強(qiáng)不高，樂果溶液的普通拉曼光譜中沒有檢測到樂果的拉曼信號，而樂果溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜中的譜峰較多，且譜峰強(qiáng)度較高，特征峰明顯， 說明納米增強(qiáng)試劑能有效增強(qiáng)樂果溶液的拉曼信號。對比甲醇溶液、金膠、樂果溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)，背景信號的表面增強(qiáng)拉曼光譜峰強(qiáng)較弱，且其譜峰位置與樂果農(nóng)藥分子的譜峰不重合，說明樂果溶液的表面增強(qiáng)拉曼信號不會受到背景信號的干擾。762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1這7處譜峰可作為鑒定樂果農(nóng)藥的特征峰。

2.2樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)光譜

從圖3可以看出，隨著樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的增加，其特征峰的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，1 050、1 160、1 210 cm-1變化最快，902、1 653 cm-1 其次，762、1 310 cm-1變化最慢，這可能是因?yàn)榧{米增強(qiáng)粒子與樂果農(nóng)藥分子中各個基團(tuán)表面吸附力的大小和方向不同導(dǎo)致的。隨著樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的降低，拉曼特征峰的強(qiáng)度逐漸減弱，濃度為10.0 mg/L時，樂果的7處拉曼峰明顯，易識別；濃度為5.0、2.0、1.0 mg/L時，762、902、1 310 cm-1處拉曼信號明顯，而1 050、1 160、1 210 cm-1處拉曼信號沒有出現(xiàn)；濃度為0.5 mg/L時，762、902、1 310 cm-1處拉曼信號可以鑒別，但很微弱。由此表明，利用SERS技術(shù)檢測樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度能達(dá)到0.5 mg/L以下。從圖3中可以看出，隨著樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的降低，在762、1 310 cm-1處有良好的線性關(guān)系，可以用來對樂果農(nóng)藥進(jìn)行定量分析。

2.3茶葉中樂果農(nóng)藥殘留分析

受茶葉中葉綠素、礦物質(zhì)、茶多酚、碳水化合物等物質(zhì)的干擾，樂果農(nóng)藥分子的拉曼信號被削弱。本研究采用無水硫酸鎂、四氯化三鐵、石墨化碳對提取液進(jìn)行凈化處理，去除基質(zhì)中葉綠素、礦物質(zhì)、茶多酚、碳水化合物等物質(zhì)的干擾，凈化后含樂果農(nóng)藥茶葉溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜如圖4所示。圖4-a、圖4-b、圖4-c中，762、902、1 310 cm-1處特征峰明顯，易識別；濃度為2.0 mg/L時，762、1 310 cm-1處的峰強(qiáng)度明顯降低，但依然能識別，902 cm-1處的拉曼特征峰已無法識別；濃度為1.0 mg/L時，762、1 310 cm-1處特征峰依然存在，峰強(qiáng)十分微弱，但依然能識別。因此，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測茶葉中樂果農(nóng)藥的最低檢測濃度能夠達(dá)到 1.0 mg/L 以下。762 cm-1處特征峰明顯，沒有重疊峰的影響，選用該特征峰的強(qiáng)度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)特征峰 762 cm-1 處的峰強(qiáng)度與樂果濃度分別在1～10、8～25 mg/L時具有良好的線性關(guān)系。濃度范圍為1～10 mg/L時，線性方程為y=75.367x+1 657.5，r2=0.983 9（圖5-A）；濃度范圍為8～25 mg/L時，線性方程為y=36.389x+2 014.9，r2=0996 5（圖5-B）。

2.4準(zhǔn)確度與精確度分析

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，采用在茶葉提取液中添加樂果農(nóng)[CM（25]藥的方法，分別制備濃度為3、6、14 mg/L樂果溶液。對3個樣本采集表面增強(qiáng)拉曼光譜信號，用上述建立的方法對3個樣本進(jìn)行預(yù)測，將添加值與預(yù)測值進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。本方法的預(yù)測結(jié)果與添加值基本一致，添加值與預(yù)測值的回收率為93.89%～96.36%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.59%～4.87%，均小于5.00%，表明利用表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速檢測茶葉中樂果農(nóng)藥殘留是可行的。

3結(jié)論與討論

研究采用快速前處理和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測干茶葉中樂果農(nóng)藥殘留，建立干茶葉中樂果農(nóng)藥殘留的快速檢測分析方法，確定樂果農(nóng)藥的7個拉曼特征峰：762、902、1 050、

1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1。該方法檢測茶葉中樂果農(nóng)藥的最低濃度能達(dá)到1.0 mg/L以下。以762 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度建立茶葉中樂果農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，低濃度范圍（1～10 mg/L）的線性方程為y=75.367x+1 657.5，r2=0.983 9，高濃度范圍（8～25 mg/L）的線性方程為y=36.389x+2 014.9，r2=0.996 5。用3個樣本對方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本方法的預(yù)測結(jié)果與添加值基本一致，回收率為93.89%～ 96.36%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.59%～487%，均小于5.00%，說明采用該方法檢測茶葉中的樂果農(nóng)藥殘留是準(zhǔn)確可靠的。該方法前處理簡單，耗時短，整個過程在 15 min 內(nèi)完成，為茶葉大規(guī)模生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留快速檢測方案的建立提供了技術(shù)支持。

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