郭政宏+周彪+嚴亨秀

摘要：探討1株來自藏豬糞便中具有一定體外益生潛力的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23在動物體內(nèi)的益生性、安全性及添加到飼料中的應用性。結(jié)果表明，按108 CFU/mL飼喂小鼠對其生長性能影響最大，可促進小鼠胸腺和脾臟發(fā)育，日均增質(zhì)量較對照組提高1倍左右，在肉眼和光學顯微鏡下觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化；將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中，可降解一定量的黃曲霉毒素B1。試驗表明，該菌株能提高小鼠生長性能，增強小鼠的免疫力，安全無毒，且添加到發(fā)酵飼料中還能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量，具有一定的應用價值。

關鍵詞：藏豬；解淀粉芽孢桿菌；益生性；安全性；黃曲霉毒素B1

中圖分類號： S852.6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0137-03

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種在形態(tài)、生理生化、培養(yǎng)特征等方面與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）非常相似的芽孢桿菌，在生長繁殖過程中能產(chǎn)生許多淀粉酶、蛋白酶、抑菌物等代謝產(chǎn)物[1]。2007年，解淀粉芽孢桿菌FZB42全基因組序列的測定，使人類對這種芽孢桿菌有了更多的了解，同時也了解了淀粉芽孢桿菌在多方面的研究應用[2]；如在動物飼養(yǎng)研究中，González-Ortiz等用解淀粉芽孢桿菌CECT5940、屎腸球菌CECT4515復合制劑飼喂成年狗，促進了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、降低了糞便中致病菌的含量[3]；在環(huán)境保護研究中，高大響等從健康雞糞便中分離到1株具有除臭作用的解淀粉芽孢桿菌[4]。李超等從滇池富營養(yǎng)化水中分離篩選得到1株對魚腥藻生長具有抑制效果的解淀粉芽孢桿菌DC1[5]等。黃曲霉毒素（aflation，簡稱AFT）是由黃曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有抑制免疫、致癌的作用，威脅著畜牧業(yè)及飼料工業(yè)，其中影響最大、分布最廣的就是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，簡稱AFB1），目前，利用微生物對AFB1進行生物降解，具有特異性強、效率高等優(yōu)點[6]。

動物體外腸道模型與動物機體胃腸道環(huán)境有一定的差異，一株潛在的益生菌能否在動物體內(nèi)產(chǎn)生益生作用，終須進行動物試驗等應用性研究。此次試驗主要探討解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23對動物生長性能的影響、對動物的安全性及添加到飼料中對黃曲霉毒素B1的降解能力，以期為解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23應用于畜牧生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗菌株

西南民族大學生命科學與技術學院現(xiàn)代生物技術中心在前期試驗中分離篩選到的具有一定體外益生潛力的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23。

1.2主要試劑

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，簡稱TSB），購于青島海博生物技術有限公司；黃曲霉毒素B1，購于美國SUPELCO公司；Mayer氏蘇木素染液、伊紅復染液，購于珠海貝索生物技術有限公司；黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒，購于南昌博恒生物制品有限公司。

1.3主要儀器

電子分析天平（梅特勒-托利儀器有限公司）、光學顯微鏡、病理圖像分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）、微量移液器（德國EPPENDORF公司）、石蠟包埋機、普通石蠟切片機，（德國LEICA公司）、病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器有限公司）、細胞超聲破碎儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4試驗動物

Balb/c小鼠25只（SPF級），雌性，6～7周齡，體質(zhì)量 20～25 g，購于四川大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF級動物房。

1.5小鼠飼喂試驗

1.5.1益生性試驗

挑取菌株接種于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，37 ℃培養(yǎng)12 h，調(diào)整細菌濃度為106、107、108 、109 CFU/mL。將25只小鼠隨機分成5組，每組5只，設置空白對照組、106、107、108、109 CFU/mL組。每組每只小鼠分別灌服0.5 mL無菌TSB液體培養(yǎng)基，106、107、108、109 CFU/mL的菌株菌液。連續(xù)灌胃21 d，每天觀察并記錄小鼠活動量、增質(zhì)量、有無腹瀉等。正常飼喂21 d后，將各組小鼠處死，解剖取出脾臟和胸腺，稱質(zhì)量并記錄，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)[7]。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.5.2安全性試驗

解剖觀察各組小鼠內(nèi)臟器官是否有肉眼可見的病理變化，并取小鼠心、肝、脾、肺、腎制作病理石蠟切片顯微觀察是否有組織病變。

1.6對黃曲霉毒素B1（AFB1）降解試驗

1.6.1確定菌株有無降解AFB1能力

取10 mL經(jīng)過12 h培養(yǎng)的菌株菌液，4 ℃條件下5 000 r/min離心30 min，分離上清液和菌體沉淀，上清液用0.22 μm孔徑濾器過濾并于4 ℃保存?zhèn)溆茫w沉淀用無菌TSB液體培養(yǎng)基洗滌離心2次，加入10 mL無菌生理鹽水制成菌體沉淀懸液備用；另取 10 mL 菌株發(fā)酵液，4 ℃條件下5 000 r/min離心30 min，棄上清液，將菌體沉淀用無菌TSB液體培養(yǎng)基洗滌離心2次，加入10 mL無菌TSB液體培養(yǎng)基制成菌懸液，再將菌懸液進行超聲波破碎，4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，離心后的上清液用0.22 μm孔徑濾器過濾制得胞內(nèi)液，并于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?00 μL全菌液、菌株上清液、菌體沉淀懸液、胞內(nèi)液及無菌TSB液體培養(yǎng)基中分別加入到100 μL黃曲霉毒素B1標準液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應48 h，用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒對黃曲霉毒素B1的降解量進行測定并計算降解率[6]。黃曲霉毒素B1降解率=（1-試驗組黃曲霉毒素B1含量/對照組黃曲霉毒素B1含量）×100%。

1.6.2降解AFB1應用試驗

將1 kg飼料平均分成試驗組和對照組，按料 ∶[KG-*3]水=2 ∶[KG-*3]1（即2 kg飼料中加1 kg水）的比例，在試驗組飼料中加入250 mL菌株發(fā)酵混合液，在對照組飼料中加入250 mL無菌TSB液體培養(yǎng)基，并充分攪拌均勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d；在飼料發(fā)酵開始后第0、1、3、5、7、9、11、13、15天，分別采集樣品10 g，用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒檢測發(fā)酵飼料中的黃曲霉毒素B1的含量，并計算降解率。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠飼喂試驗

2.1.1益生性試驗

由表1可知，不同濃度的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23對小鼠生長性能有不同的影響，其中按 108 CFU/mL 飼喂小鼠對其生長性能影響最大，可使日均增質(zhì)量較對照組提高1倍左右；同時，與對照組比較，菌株對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有一定促進作用，這說明解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23不但能提高小鼠生長性能，還能在一定程度上促進小鼠免疫器官發(fā)育。

2.1.2安全性檢測

任何菌株在生長代謝過程中不但能產(chǎn)生水解酶類等，也可能會產(chǎn)生一些毒素，通過安全性試驗可檢測解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23是否會產(chǎn)生對宿主有害的毒素等。通過試驗，在對照組和各試驗組小鼠飼喂期間，各組小鼠精神狀態(tài)無差異，無腹瀉情況發(fā)生，無類似中毒癥狀出現(xiàn)，解剖后肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟無病變，光學顯微鏡下觀察病理切片無明顯病理變化（圖1）。

2.2對黃曲霉毒素B1降解試驗

2.2.1菌株對AFB1的降解能力

由圖2可知，解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23培養(yǎng)液不同組分對AFB1降解率各不相同，與對照相比，全菌液和上清液降解能力較強，分別為 42.13%、31.57%；菌體沉淀懸液降解能力較差，僅為 3.48%；胞內(nèi)液基本沒有降解能力。因此，可認為解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23能代謝產(chǎn)生對黃曲霉毒素B1具有一定降解作用的物質(zhì)，且該物質(zhì)主要存在于菌株培養(yǎng)液的上清液中。

2.2.2降解AFB1應用試驗

由圖3可知，在第13天時，對照組發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1的含量為10.88 μg/kg，已超過國家安全限量（10 μg/kg）[8]，而試驗組發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1的含量為6.85 μg/kg，低于國家安全限量，說明在飼料中添加解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23能夠在一定程度上降低飼料中AFB1含量，以提高飼料飼喂動物的安全性。

3討論

動物體質(zhì)量的增加與減少是動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力和健康狀況最直接的反映，益生性試驗結(jié)果說明各個濃度的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23都能提高小鼠的生長性能，其中按108 CFU/mL飼喂小鼠可使日均增質(zhì)量較對照組提高2倍左右，究其原因可能是解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23定植于小鼠腸道中，促進了腸道對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收，從而提高了小鼠的生長性能。除此之外，安全性試驗結(jié)果表明，該菌株不會代謝產(chǎn)生使動物機體中毒的物質(zhì)，影響飼喂動物安全。

飼料霉變、霉菌毒素殘留與污染是在畜牧業(yè)生產(chǎn)中很嚴重的問題。飼料或環(huán)境中各種霉菌孢子在適宜的環(huán)境下會萌發(fā)成各種霉菌，并迅速生長使飼料結(jié)塊、發(fā)霉，產(chǎn)生霉菌毒素，污染飼料與環(huán)境[9-10]，其中危害最大的就是黃曲霉毒素B1。通過降解應用性試驗研究，將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量，保證飼料對動物的安全性；在降解黃曲霉毒素應用性試驗中，菌株對黃曲霉毒素降解率為37.04%，較降解能力試驗中42.13%低，可能是由于菌株在不同生長環(huán)境中增殖速率等不同導致的。

4結(jié)論

通過對菌株益生性、安全性和降解黃曲霉毒素B1能力的研究，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWUN-TP23對小鼠安全無毒，能提高小鼠生長性能，增強免疫力，且將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中還能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量。

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