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摘要：肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷合成途徑的關(guān)鍵酶之一，其蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度直接影響植物中黃酮類化合物和芳香族化合物的生物合成量。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的C4H基因的序列設(shè)計(jì)兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果實(shí)C4H基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1 680 bp。該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸，分子量為58.08 ku。蛋白等電點(diǎn)為9.52，分析發(fā)現(xiàn)該基因主要定位在線粒體中。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)得到3種三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)圖；通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與橄欖、可可等植物具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)不同著色的芒果品種的C4H基因表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達(dá)量最高，而綠色的桂七品種中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞：芒果； C4H基因；克隆；蛋白質(zhì)；生物信息

中圖分類號(hào)： S667.701文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0008-04

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，簡(jiǎn)稱C4H），別稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，是細(xì)胞色素單加氧酶P450超家族的成員之一[1]，該酶由Russell等首次從豌豆芽中發(fā)現(xiàn)[2]，它是苯丙素類化合物生物合成途徑里繼苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanineammonia-iyase，簡(jiǎn)稱PAL）之后的第2個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，其作用是將苯丙氨酸途徑的合成酶復(fù)合物固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[3]；同時(shí)，在氧和磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，簡(jiǎn)稱NADP）存在下，將反式肉桂酸苯環(huán)的4位羥基化生成對(duì)-香豆酸[4]。C4H分布在微粒體中，能夠原位利用PAL催化產(chǎn)生的苯乙烯酸。普遍認(rèn)為，肉桂酸-4-羥化酶是苯丙素類物質(zhì)代謝中一個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)[2]。由于肉桂酸-4-羥化酶基因在植物次生代謝中有這些重要的作用，因此被廣泛關(guān)注。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，肉桂酸-4-羥化酶的基因克隆逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。迄今，已有擬南芥、大豆、花生、杜仲等50多種植物的C4H基因被分離出來(lái)[5-10]。與苯丙氨酸脫氨酶基因類似，肉桂酸-4-羥化酶基因的拷貝數(shù)在不同植物之間存在差異。如：苜蓿C4H基因有2個(gè)拷貝，豌豆的C4H基因只有1個(gè)拷貝，綠豆和長(zhǎng)春花的C4H基因家族都有多個(gè)成員。這些不同植物種的C4H基因所編碼的氨基酸序列相似性極高，同源性普遍在85%左右。但玉米和法國(guó)菜豆中的2個(gè)C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60%[11]。C4H基因在植物各組織中均具有很高的活性[11-14]，研究表明，C4H的蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度直接影響植物中黃酮類化合物、木質(zhì)素、芳香族類化合物的合成等多條代謝途徑[15-16]。芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹(shù)，果實(shí)色彩多樣，有綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等。芒果果實(shí)富含類胡蘿卜素、花色素苷等物質(zhì)，其中花色素苷合成途徑是紅色芒果果實(shí)著色的一個(gè)主要的代謝途徑。芒果果實(shí)C4H基因的研究工作未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，簡(jiǎn)稱RACE）從芒果的果實(shí)中克隆得到1個(gè)C4H基因，深入探討該基因在芒果果實(shí)花色素苷合成的作用機(jī)制及其對(duì)果實(shí)著色的影響，借以深入揭示該基因在芒果果實(shí)花色素苷生物合成的分子機(jī)制，以期為芒果果實(shí)著色研究提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用芒果（品種有紅色貴妃、黃色金煌、綠色桂七）果實(shí)取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部芒果種質(zhì)資源圃。引物委托上海英俊生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其他藥品如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱為IPTG）、酵母抽提物（yeast extract，簡(jiǎn)稱YE）、氨芐青霉素（ampicillin，簡(jiǎn)稱為Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（簡(jiǎn)稱為X-GaL）、pMD-19T載體及各種酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1芒果總RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒用RNase-free無(wú)菌水溶解，并用寶生物工程（大連）有限公司的DNase試劑盒進(jìn)行DNA去除，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性和DNA是否去除干凈。

1.2.2PCR反應(yīng)程序94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性50 s，50 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 7 min； 反應(yīng)體系為25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs；[JP3]擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳，采用gelred染色后在紫外凝膠成像儀上觀察、拍照分析。

1.3C4H基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

以貴妃芒果的果實(shí)總RNA作為模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并參照該試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 3′端、5′末端 cDNA 的擴(kuò)增。根據(jù)cDNA片段的測(cè)序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)2條上游引物，以接頭為錨定引物進(jìn)行半巢式PCR反應(yīng)。根據(jù)測(cè)得的片段和得到的cDNA 3′端、5′末端的序列結(jié)果拼接該基因的全長(zhǎng) cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4C4H基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和分子進(jìn)化的分析

將測(cè)得的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行NCBI序列比對(duì)，確定該全長(zhǎng)序列是否為C4H基因，并進(jìn)行其他物種C4H基因的比對(duì)，采用DNAMAN軟件分析基因核苷酸、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和同源性；分析該基因所推定氨基酸序列進(jìn)行多序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。endprint

1.5表達(dá)分析

分別提取不同芒果品種的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，并采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為：actin-F 5′-AATGGAACTGGAATG GTCAAGGC-3′，actin-R5′-TGCCAGATCTTCTCCATGTCA TCCCA-3′；目的基因擴(kuò)增采用的引物為：C4H-F，5′-CAGCATAGCCTAGCACATACTC-3′，C4H-R 5′-CAATG GAGCATATACGAAACTAT-3′，PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并采用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1C4H基因的獲得

根據(jù)RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行拼接最后得到C4H基因的全長(zhǎng)cDNA序列，電泳收測(cè)序后全長(zhǎng)序列為1 680 bp，分析發(fā)現(xiàn)，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸序列（圖1）。通過(guò)NCBI上已經(jīng)登錄的水稻、大豆、橄欖、可可的C4H蛋白序列進(jìn)行比對(duì)（圖2）發(fā)現(xiàn)，克隆的基因?yàn)镃4H基因。

利用NCBI的Blast進(jìn)行保守區(qū)查找，獲得序列的保守Domain（CD）。結(jié)果表明，C4H有PLN02394（trans-cinnamate 4-monooxygenase）、p450（cytochrome P450）、CypX（secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism）P450_cycloAA_1（cyclodipeptide synthase-associated）、PLN02738（carotene beta-ring hydroxylase）等結(jié)合域。對(duì)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，芒果C4H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲為主，也具有少量的β-折疊結(jié)構(gòu)（圖4）。采用Bioedit軟件的Kyte和Doolittle算法對(duì)C4H蛋白的親水/疏水性（正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性）進(jìn)行分析，C4H蛋白所含氨基酸的值主要介于-2.2～31之間（圖5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件對(duì)C4H蛋白進(jìn)行定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因定位在線粒體中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，推導(dǎo)出該蛋白有3種結(jié)構(gòu)構(gòu)型（圖6）。采用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，芒果C4H蛋白與橄欖、可可等植物具有較近的親緣關(guān)系（圖7）。

2.3C4H基因的RT-PCR分析

對(duì)不同著色品種的芒果果皮進(jìn)行RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在紅色果皮貴妃的果實(shí)中表達(dá)較多，黃色果皮金煌的果實(shí)中次之，而綠色果皮桂七的果實(shí)中相對(duì)表達(dá)較少（圖8），初步推斷C4H基因可能與紅色果實(shí)的花色素苷合成有密切的關(guān)系。

3討論

本研究成功地從芒果果實(shí)中分離得到1個(gè)全長(zhǎng)C4H基因，該基因cDNA的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸。通過(guò)在線軟件對(duì)cDNA和蛋白序列分析證實(shí)該序列是植物C4H基因的一員。芒果C4H基因與所選其他物種C4H基因序列相比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在全長(zhǎng)cDNA序列上還是在其編碼氨基酸序列上都具有較高保守的結(jié)構(gòu)域細(xì)胞色素P450。同時(shí)，通過(guò)與其他部分物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)發(fā)現(xiàn)，芒果C4H基因編碼的蛋白與橄欖、可可、棉花等植物聚為一類。植物黃酮類物質(zhì)的生物合成相關(guān)的蛋白一般定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，由一系列特定的黃酮合成相關(guān)酶組成的多酶復(fù)合體連續(xù)合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中[17]。C4H蛋白的N-末端的膜錨定信號(hào)基（signal-anchor sequence），使其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，參與苯丙烷類代謝途徑中多酶復(fù)合體的亞細(xì)胞定位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上電子鏈的化學(xué)傳遞[18]，進(jìn)而進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的生物合成。Baek等在黑莓中發(fā)現(xiàn)，黃酮積累量與C4H表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期表現(xiàn)了同步增加或減少的變化趨勢(shì)[19]。本研究對(duì)芒果不同果實(shí)著色分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達(dá)量最高，而綠色的桂七品種中表達(dá)量最低，這與花色素苷的含量有一定的相關(guān)性。在大蒜中C4H的轉(zhuǎn)錄在根中最高，而在苯丙素類物質(zhì)富集的莖中卻很低。推測(cè)大蒜中苯丙素類物質(zhì)可能在根部合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到莖中[20]。在逆境脅迫下，植物可通過(guò)調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類和芳香族類的合成和積累[8]，其中就包括C4H。Ryan等在矮牽?；ㄖ械难芯堪l(fā)現(xiàn)，在UV-B脅迫處理下，C4H等基因表達(dá)量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加[21]。Liu等發(fā)現(xiàn)K離子缺乏誘導(dǎo)的菊花中C4H等基因的表達(dá)量減少，造成了該部位黃酮含量的降低[22]。芒果C4H基因是芒果花色素苷合成代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵的基因，對(duì)芒果果皮紅色的形成具有重要的作用。芒果果實(shí)的著色也受得了光照、溫度等條件的影響，這些因素是否影響了C4H基因的表達(dá)，同時(shí)，對(duì)該基因功能的深入研究須要進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)驗(yàn)證。

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