彭靚,葉萍,陳國(guó)慶,謝曉英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 江西贛州 341000)

·臨床研究·

Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miR-199a-5p表達(dá)變化及其意義

彭靚,葉萍,陳國(guó)慶,謝曉英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,江西贛州341000)

目的觀察Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miR-199a-5p表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法選擇52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織標(biāo)本為卵巢癌原發(fā)組，卵巢癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本為卵巢癌轉(zhuǎn)移組，29例良性上皮性卵巢腫瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本為良性組，32例因子宮肌瘤行子宮附件切除術(shù)患者的正常卵巢組織標(biāo)本為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)四組標(biāo)本中miR-199a-5p表達(dá)量，并分析上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達(dá)量與上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分級(jí)及組織學(xué)類(lèi)型的關(guān)系。結(jié)果卵巢癌原發(fā)組、卵巢癌轉(zhuǎn)移組、良性組、對(duì)照組標(biāo)本miR-199a-5p表達(dá)量分別為1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原發(fā)組miR-199a-5p表達(dá)量低于良性組和對(duì)照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達(dá)量低于良性組和對(duì)照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達(dá)量低于卵巢癌原發(fā)組(P<0.05)，良性組和對(duì)照組miR-199a-5p表達(dá)量相比P>0.05。上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達(dá)量和卵巢癌FIGO分期有關(guān)(P<0.05)，與病理分級(jí)和組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)病灶和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達(dá)降低。檢測(cè)上皮性卵巢癌原發(fā)病灶組織中miR-199a-5p表達(dá)量有助于判斷上皮性卵巢癌的FIGO分期。

卵巢癌；上皮性卵巢癌；微小RNA；微小RNA199a-5p

卵巢癌是婦科常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一，據(jù)國(guó)家癌癥中心最新數(shù)據(jù)估計(jì)，2013 年卵巢癌發(fā)病例數(shù)為5萬(wàn)例，發(fā)病率約為7.53/10萬(wàn)，位居女性惡性腫瘤發(fā)病的第10位[1]。上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)的卵巢惡性腫瘤，5年生存率一直徘徊在30%～40%，嚴(yán)重威脅婦女生命和健康[2]。因此，明確上皮性卵巢癌發(fā)病機(jī)制，并尋找早期診斷和治療方法至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)大小19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其與腫瘤的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)[3，4]。MiR-199a-5p是miRNA的一種，在各種腫瘤組織中表達(dá)不一，其在宮頸癌[10]、肝癌[11]組織中表達(dá)下調(diào)，而在胃癌[12]、結(jié)直腸癌[13]組織中表達(dá)上調(diào)。但是目前未有miR-199a-5p在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)情況的研究報(bào)道。本研究觀察了Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達(dá)變化，并分析其與上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科2014年5月～2015年12月收治的52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者的卵巢癌組織標(biāo)本為卵巢癌原發(fā)組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本為卵巢癌轉(zhuǎn)移組?；颊吣挲g 22～71歲，平均47歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。按FIGO2009卵巢癌診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)IGO分期Ⅱ期22例，Ⅲ期30例；病理分級(jí)G1級(jí)13例，G2級(jí)23例，G3級(jí)16例；組織學(xué)類(lèi)型漿液性腺癌 25例、黏液性腺癌21例，子宮內(nèi)膜樣癌 4 例，透明細(xì)胞癌2例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或激素治療。選擇29例良性上皮性卵巢腫瘤患者的卵巢腫瘤組織標(biāo)本為良性組，患者年齡18～68歲，平均45歲。選擇因子宮肌瘤行子宮附件切除術(shù)的32例患者的正常卵巢組織標(biāo)本為對(duì)照組，患者年齡19～62歲，平均47歲。三組患者均未合并其他器官腫瘤或內(nèi)外科合并癥。三組患者年齡相比P>0.05。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 miR-199a-5p檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。標(biāo)本離體后10 min內(nèi)置于去除RNase的凍存管中，經(jīng)液氮罐迅速冷凍后置-196 ℃保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)取各組標(biāo)本用液氮研磨法磨成粉末并稱(chēng)取合適量，加入總RNA提取試劑NcmZolReagent，按NcmZolReagent試劑說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA溶液D260/D280比值，計(jì)算RNA濃度和純度，比值若在1.8～2.1，說(shuō)明提取的總RNA較純，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，否則棄用。行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 10 min。行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以U6 為內(nèi)參照。引物購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。miR-199a-5p上游引物5′-GTCGATACCAGTGCGTGTCGTCCTGTCGGC-3′，下游引物5′AATTGCACTGGATACGACAGCCTAT-3′。U6上游引物 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR 反應(yīng)條 件 ：95 ℃變性 5 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 45 s共40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次。 用2-ΔΔCt表示各組miR-199a-5p表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組標(biāo)本miR-199a-5p表達(dá)量比較 卵巢癌原發(fā)組、卵巢癌轉(zhuǎn)移組、良性組、對(duì)照組標(biāo)本miR-199a-5p表達(dá)量分別為1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原發(fā)組miR-199a-5p表達(dá)量低于良性組和對(duì)照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達(dá)量低于良性組和對(duì)照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達(dá)量低于卵巢癌原發(fā)組(P<0.05)，良性組和對(duì)照組miR-199a-5p表達(dá)量相比P>0.05。

2.2 上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達(dá)量和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達(dá)量和卵巢癌FIGO分期有關(guān)(P<0.05)，與病理分級(jí)和組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)的卵巢惡性腫瘤，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，病死率高居?jì)D科惡性腫瘤之首。由于卵巢惡性腫瘤的生成是多環(huán)節(jié)、多因素作用的結(jié)果，基因功能和表達(dá)的異常通常直接參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如原癌基因的激活和抑癌基因的突變等，而侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的最關(guān)鍵因素之一。探尋參與上皮性卵巢癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程的基因并加以干預(yù)有可能為治療上皮性卵巢癌提供新的途徑。

表1 上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達(dá)量和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

研究表明，miRNAs調(diào)控著人類(lèi)1/3基因的表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[5，6]。Calin等[7]首次證實(shí)了miRNA在人類(lèi)惡性腫瘤慢性淋巴細(xì)胞性白血病中的作用，miR-15a/miR-16-1被確定為腫瘤抑制因子。miR-200a高表達(dá)與卵巢癌組織學(xué)類(lèi)型和分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移灶中miR-200c表達(dá)顯著升高，血漿中的miR-200a和miR-200c可能是診斷卵巢癌的標(biāo)記物[8]。miR-199a-5p是由其基因轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物pri-miR-199a經(jīng)酶剪切并加工成熟后形成的，miR-199a由位于19號(hào)染色體和1號(hào)染色體上的2種基因剪切產(chǎn)生[9]。由于組織細(xì)胞中存在多種miRNA的表達(dá)，并且同一種miRNA在不同組織中的表達(dá)情況也各不一樣，因此有報(bào)道m(xù)iR-199a-5p在各類(lèi)腫瘤組織中的表達(dá)報(bào)道不一，其在宮頸癌[10]及肝癌[11]中表達(dá)下調(diào)，而在胃癌[12]及結(jié)直腸癌[13]中表達(dá)上調(diào)。He等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相比正常胃黏膜組織，miR-199a-5p在胃癌組織中顯著上調(diào)，并且miR-199a-5p能夠增加胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，晚期腫瘤或是有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-199a-5p表達(dá)水平相對(duì)較高。鄒阮敏等[14]的研究報(bào)道了miR-199a-5p在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)低于正常組織，并且miR-199a-5p表達(dá)與宮頸癌的組織分化程度存在一定相關(guān)性，而宮頸癌小細(xì)胞的miR-199a-5p表達(dá)低于其他組織分化類(lèi)型的標(biāo)本。miR-199a-5p在宮頸癌組織中的異常表達(dá)。miR-199a-5p有望成為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中 miR-199a-5p 表達(dá)量明顯低于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織，提示 miR-199a-5p與上皮性卵巢癌的發(fā)病具有密切聯(lián)系。卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中 miR-199a-5p表達(dá)量低于原發(fā)灶，提示miR-199a-5p可能參與卵巢癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。有研究表明，復(fù)發(fā)性卵巢癌和原發(fā)性卵巢癌組織中miR-199a-5p表達(dá)具有差異性，且miR-199a-5p表達(dá)量與患者無(wú)進(jìn)展生存、總生存率有關(guān)[15]。這一研究進(jìn)一步提示我們miR-199a-5p表達(dá)量與卵巢癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。國(guó)內(nèi)李燕彬等[16]檢測(cè)了miR-199a-5p在胃癌組織及癌旁正常組織表達(dá)情況，miR-199a-5p在胃癌中表達(dá)較正常胃黏膜組織明顯下降，miR-199a-5p的表達(dá)量與腫瘤大小、分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達(dá)量與上皮性卵巢癌FIGO分期有關(guān)，Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達(dá)量低于Ⅱ期上皮性卵巢癌，進(jìn)一步表明miR-199a-5p參與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并且與上皮性卵巢癌的進(jìn)展相關(guān)。但本研究結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達(dá)量與上皮性卵巢癌病理分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)?？紤]為樣本量較小導(dǎo)致的，今后如有條件，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究。

綜上，Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)病灶和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達(dá)降低。檢測(cè)上皮性卵巢癌原發(fā)病灶組織中miR-199a-5p表達(dá)量有助于判斷上皮性卵巢癌的FIGO分期。在miR-199a-5p可能在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的功能，但這一功能的具體機(jī)制不明，今后可以對(duì)此進(jìn)行研究，尋找相關(guān)分子通路上游或下游靶基因，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制，并加以干預(yù)。

[1] 陳萬(wàn)青,鄭榮壽,張思維,等.2013年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2017, 26(1):1-7.

[2] 華克勤,豐有吉.實(shí)用婦產(chǎn)科學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:567.

[3] Kavitha N, Vijayarathna S, Jothy SL, et al. MicroRNAs: biogenesis, roles for carcinogenesis and as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(15):7489-7497.

[4] 寧莉,魏殿軍.急性腎損傷相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥, 2017，57(14).110-112.

[5] Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis function and decay[J]. Nat Rev Genet, 2010,11(9):597-610.

[6] Acunzo M, Croce CM. MicroRNA in cancer and cachexia--a mini-review[J]. J Infect Dis, 2015,212(Suppl 1):74-77.

[7] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(24):15524-15529.

[8] Zuberi M, Mir R, Das J, et al. Erratum to: Expression of serum miR-200a, miR-200b and miR-200c as candidate biomarkers in epithelial ovarian cancer and their association with clinicopathological features[J].Clin Transl Oncol, 2015,17(10):779.

[9] Duan Q, Wang X, Gong W, et al. ER stress negatively modulates the expression of the miR-199a/214 cluster to regulates tumor survival and progression in human hepatocellular cancer[J]. PLoS One, 2011,7(2):31518.

[10] Huang L, Lin J X, Yu Y H, et al. Downregulation of six microRNAs is associated with advanced stage, lymph node metastasis and poor prognosis in small cell carcinoma of the cervix[J]. PLoS One, 2012,7(3):e33762.

[11] Shen Q, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Role of miR-199a-5p and discoidin domain receptor 1 in human hepatocellular carcinoma invasion[J]. Mol Cancer, 2010,9(7):227.

[12] He XJ, Ma YY, Yu S, et al. Up-regulated miR-199a-5p in gastric cancer functions as an oncogene and targets klotho[J]. BMC Cancer, 2014,14(1):218.

[13] Hu Y, Liu J, Jiang B, et al. MiR-199a-5p loss up-regulated DDR1 aggravated colorectal cancer by activating epithelial-to-mesenchymal transition related signaling[J]. Dig Dis Sci, 2014,59(9):2163-2172.

[14] 鄒阮敏,胡芝,陳昊,等.miR-199a在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中的表達(dá)及意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(7):55-59.

[15] Marchini S, Cavalieri D, Fruscio R, et al. Association between miR-200c and the survival of patients with stage I epithelial ovarian cancer: a retrospective study of two independent tumour tissue collections[J]. Lancet Oncol, 2011,12(3):273-285.

[16] 李燕彬,胡寶光,李玉明,等.MicroRNA-199a-5p在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,40(1):4-6.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.012

R737.31

B

1002-266X(2017)35-0039-03

2017-06-07)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360383)。

謝曉英(E-mail:xiexiaoying603@126.com)