鄭轉(zhuǎn)珍,李國(guó)霞,張耀方,徐麗娟,朱鐳

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001；2 山西省婦幼保健院)

急性白血病患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2的表達(dá)及其與病灶髓外浸潤(rùn)和預(yù)后的關(guān)系

鄭轉(zhuǎn)珍1,李國(guó)霞1,張耀方1,徐麗娟1,朱鐳2

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001；2山西省婦幼保健院)

目的觀察急性白血病(AL)患兒 骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CAMP反應(yīng)元件型結(jié)合因子(CREB)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2) mRNA和蛋白的表達(dá)變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤(rùn)、預(yù)后的關(guān)系。方法選擇2015年2月～2017年3月收治的96例AL患兒，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)61例為ALL組，急性髓細(xì)胞白血病(AML)35例為對(duì)照組，另取骨髓穿刺排除白血病的其他血液病患兒35例為對(duì)照組。均行骨髓穿刺抽取骨髓組織分離單個(gè)核細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)算其中CREB、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，用Western blotting法測(cè)算其中CREB、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行組間比較。將ALL、AML組患兒按是否存在髓外浸潤(rùn)分為髓外浸潤(rùn)亞組和無髓外浸潤(rùn)亞組，按化療后是否緩解分為緩解亞組和未緩解亞組，比較各亞組CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果ALL、AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。ALL組和AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量相比，P均>0.05。ALL、AML組中有髓外浸潤(rùn)亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于各自的無髓外浸潤(rùn)亞組(P均<0.05)。ALL、AML組中緩解亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于各自的未緩解亞組(P均<0.05)。結(jié)論AL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白高表達(dá)，且表達(dá)量與髓外浸潤(rùn)和患兒預(yù)后有關(guān)。

急性白血病；急性淋巴細(xì)胞白血??；急性髓細(xì)胞白血??；骨髓；單個(gè)核細(xì)胞；CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；B淋巴細(xì)胞瘤-2

急性白血病(AL)作為多發(fā)于兒童時(shí)期的一類常見的血液性惡性腫瘤，對(duì)患兒的生命安全具有較大的威脅。該病發(fā)病機(jī)制不明確，復(fù)發(fā)率高，髓外浸潤(rùn)多見，影響長(zhǎng)期生存，治療難度較大。尋找AL的相關(guān)基因并用其輔助AL診治具有重要的臨床意義[1]。CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)屬于核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有利于細(xì)胞的存活與增殖，還可對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制，參與正常機(jī)體的造血功能及慢性白血病的發(fā)生發(fā)展[2]，但其與AL的關(guān)系尚不明確。B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)屬于凋亡抑制基因，其同惡性腫瘤的形成緊密相關(guān)[3，4]，但Bcl-2與AL關(guān)系的相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究觀察了AL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤(rùn)、預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2017年3月收治的96例AL患兒。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患兒均經(jīng)骨髓穿刺病例活檢確診；②年齡<14歲；③初診的患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型的惡性血液性疾??；②繼發(fā)于其他惡性腫瘤者；③有嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器的功能性不全者。其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)61例，為ALL組。ALL組男32例、女29例，年齡3～12(6.24±1.07)歲。B細(xì)胞型20例，T細(xì)胞型41例。有髓外浸潤(rùn)46例，無髓外浸潤(rùn)15例。均采用標(biāo)準(zhǔn)VDLP方案(長(zhǎng)春新堿+柔紅霉素+潑尼松+左旋門冬酰胺酶)治療1個(gè)月，緩解(完全緩解+部分緩解)48例，未緩解13例。急性髓細(xì)胞白血病(AML)35例為AML組。男22例、女13例，年齡4～13(6.27±1.12)歲。M1型7例，M2型19例，M4型6例，M5型3例。有髓外浸潤(rùn)27例，無髓外浸潤(rùn)8例。均采用DAE方案(柔紅霉素+阿糖胞苷+VP16)治療1個(gè)月，緩解24例，未緩解11例。另選同期收治的骨髓穿刺排除白血病的35例血液病患兒為對(duì)照組。男25例、女10例，年齡3～12(6.25±1.09)歲。其中感染性疾病15例，缺鐵型貧血14例，血小板減少型紫癜6例。各組患兒性別、年齡等一般資料相比P均>0.05。本研究的內(nèi)容和方法已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 各組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 mRNA檢測(cè) 取各組患兒骨髓穿刺所得骨髓組織，用天津浩洋公司生產(chǎn)的Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)算其中CREB、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。先用購(gòu)于美國(guó)MBI公司的RNA提取試劑盒對(duì)細(xì)胞的RNA進(jìn)行提取，操作過程應(yīng)嚴(yán)格遵照說明書的步驟施行。然后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，試劑盒購(gòu)自美國(guó)MBI公司，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。CREB引物序列：正向5′-GACTTTCTCCGGAACTCA-3′，反向5′-CGGTACCATTGCTAGCCAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度312 bp。Bcl-2引物序列：正向5′-CGCTTTGCCACGGTGGTGGAG-3′，反向5′-GTACATCACTGACAATGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度415 bp。內(nèi)參照β-actin引物序列：正向5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTC-3′，反向5′-GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度168 bp。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，64 ℃1 min，后退火(其中CREB為55 ℃，Bcl-2為60 ℃，β-actin為50 ℃)約1 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共40個(gè)循環(huán)。將10μL的PCR產(chǎn)物放于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析，用2-ΔΔCt表示CREB、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 各組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取按1.2方法分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解，心收集蛋白，用Western blotting法檢測(cè)CREB、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。CREB、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量以CREB、Bcl-2 蛋白條帶與內(nèi)參照GADPH條帶灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量見表1。ALL、AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。ALL組和AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量相比,P均>0.05。

表1 各組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 有、無髓外浸潤(rùn)亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 ALL、AML組中有、無髓外浸潤(rùn)亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量見表2。ALL、AML組中有髓外浸潤(rùn)亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于各自的無髓外浸潤(rùn)亞組(P均<0.05)。

表2 有、無髓外浸潤(rùn)亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與無髓外浸潤(rùn)組相比，*P<0.05。

2.3 緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 ALL、AML組中緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量見表3。ALL、AML組中緩解亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于各自的未緩解亞組(P均<0.05)。

表3 緩解、未緩解亞組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與未緩解組相比，*P<0.05。

3 討論

骨髓細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄主要受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[5]。CREB屬于CREB/ATF-1這一重要轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。在多類癌癥中均已發(fā)現(xiàn)CREB處于高表達(dá)狀態(tài)。Bcl-2蛋白由Bcl-2原癌基因編碼，其高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞存活。有報(bào)道指出[6～8]，AL的發(fā)病機(jī)制主要是增殖失控、分化障礙和細(xì)胞凋亡抑制。造血細(xì)胞的非正常惡性增殖及凋亡受抑也與患者預(yù)后有關(guān)[9～11]。為進(jìn)一步明確CREB、Bcl-2與AL的關(guān)系，我們觀察了AL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化，并探討其與AL患兒髓外浸潤(rùn)、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示ALL、AML組患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，ALL、AML組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與文川等[12～14]的報(bào)道結(jié)果類似，提示無論是ALL還是AML，患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)均上升。分析原因，主要可能與CREB和Bcl-2在癌細(xì)胞中的作用機(jī)制及白血病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。CREB的高表達(dá)則可能是通過某種信號(hào)通路對(duì)Bcl-2在白血病的有關(guān)發(fā)病進(jìn)程中的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。換言之，CREB及Bcl-2的高表達(dá)均可能是ALL及AML的部分發(fā)病共同機(jī)制，因此二者在ALL組和AML組中的表達(dá)水平均明顯上升。本研究還發(fā)現(xiàn)，ALL、AML患兒髓外浸潤(rùn)亞組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于各自的無髓外浸潤(rùn)亞組。這提示了CREB及Bcl-2在有髓外浸潤(rùn)的白血病患兒中更易表現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。原因可能是因?yàn)樗柰饨?rùn)易使病情進(jìn)展，終使二者均呈現(xiàn)出高表達(dá)。此外，ALL、AML組緩解亞組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CREB、Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于未緩解亞組。這提示了經(jīng)過相應(yīng)的治療后，癥狀緩解的白血病患兒骨髓細(xì)胞中CREB和Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)。原因可能是因?yàn)榛熕幬锏淖饔脷⑺懒瞬糠职┘?xì)胞，阻斷了白血病有關(guān)細(xì)胞的異常增殖過程，最終干擾了CREB和Bcl-2在細(xì)胞中的表達(dá)，并使二者均下調(diào)[15]。

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