黃 琳, 張 莉, 武丹露

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三疣梭子蟹()凍藏過程中肌肉蛋白質(zhì)生化特性的變化

黃 琳, 張 莉, 武丹露

(中國海洋大學食品科學與工程學院, 山東青島266003)

以三疣梭子蟹肌肉基本營養(yǎng)成分、蛋白質(zhì)組成、肌原纖維蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量、二硫鍵含量以及肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析作為指標, 研究了三疣梭子蟹在不同凍藏溫度下肌肉蛋白質(zhì)生化特征的變化。結(jié)果表明, 三疣梭子蟹是典型的高蛋白食品; 隨著凍藏時間的延長, 水溶性蛋白含量先增加后減少, 鹽溶性蛋白和不溶性蛋白含量逐漸減少, 堿溶性蛋白含量逐漸增加; 肌原纖維蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量隨著凍藏時間的延長, 均呈現(xiàn)下降趨勢, 而二硫鍵含量則呈上升趨勢, 且–20℃和–40℃兩組之間差異顯著(<0.05)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明, 組成肌原纖維蛋白的各種蛋白質(zhì)均有不同程度降解, 且–20℃比–40℃組降解更明顯。因此, –40℃凍藏對梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)生化特性的影響較小。

三疣梭子蟹(); 肌肉; 蛋白質(zhì); 生化特性

三疣梭子蟹, 學名, 屬于甲殼綱(Curstacea)十足目(Decapoda)梭子蟹科(Portunidae)梭子蟹屬, 廣泛分布于我國山東、浙江、廣西、廣東、福建以及日本、朝鮮及馬來西亞群島等海域[1]; 在中國山東、江蘇、浙江等省的養(yǎng)殖規(guī)模很大[2]。三疣梭子蟹肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富、水分含量高, 與其他魚、蝦、貝等水產(chǎn)品一樣極易腐敗變質(zhì), 而其上市量高度集中, 鮮銷受到一定限制。凍藏因其成本低、保存時間長成為較好的保鮮方法[3]。但凍藏條件下蛋白質(zhì)極易變性, 導致梭子蟹品質(zhì)劣變, 這是造成凍藏蟹產(chǎn)品并不普遍的重要原因之一。

目前, 國內(nèi)外對水產(chǎn)品凍藏過程中品質(zhì)的變化進行了大量的研究, 如凍藏中海灣扇貝()閉殼肌蛋白性質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)的變化[3]、微凍與凍藏對烏鱧(Cantor)品質(zhì)的影響[4]、基圍蝦()凍藏過程中品質(zhì)變化[5]、軟殼和硬殼鋸緣青蟹()肌肉特性在凍藏中的變化[6]等。對梭子蟹的研究集中在遺傳特性[7]、繁殖發(fā)育[1]、病理毒理[8]、低溫保存[9]等方面, 而低溫保存方面的研究更側(cè)重于鮮度品質(zhì), 針對梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)冷凍變性的報道并不多。本研究通過對不同溫度下凍藏的梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)生化指標的測定, 探討了凍藏中梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)的降解規(guī)律。以期為梭子蟹冷凍產(chǎn)品的貯藏和保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活三疣梭子蟹購于青島市團島海鮮市場, 平均質(zhì)量120 g左右。

電泳標準蛋白樣液(寶生物工程有限公司); 牛血清蛋白、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(上海索萊寶生物科技有限公司); 氯化鉀、考馬斯亮藍G250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等(國藥集團化學試劑有限公司); 乙醚、順丁烯二酸、硫酸亞鐵、三氯乙酸, 鉬酸銨、氯化鈣以及鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。

KJELTECTM 8400全自動凱氏定氮儀(丹麥FOSS有限公司); IKA高速分散機(德國IKA公司); UV-2102C型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司); Sorvall ST 16R臺式冷凍高速離心機(美國THERMO SCIENTIFIC公司); DYY-6D型電腦三恒多用電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

新鮮的三疣梭子蟹冰水致死, 用蒸餾水沖洗干凈, 用濾紙吸干表面水分, 用熱封袋熱封包裝后分別貯存于(–20±0.5)℃和(–40±0.5)℃的冰箱中, 每隔15 d進行一次蛋白質(zhì)生化特性的測定。

1.2.2 三疣梭子蟹肌肉基本營養(yǎng)成分的測定

水分含量的測定方法參照: GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥法;

粗蛋白含量的測定方法參照: GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法;

粗脂肪含量的測定方法參照: GB/T 14772— 2008《食品中粗脂肪的測定》索式提取法;

灰分的測定方法參照: GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.2.3 各組分蛋白質(zhì)含量的測定

肌肉各組分蛋白質(zhì)的提取參照Visessanguan W等[10]介紹的方法進行, 并稍作修改。

精確稱取蟹肉樣品2 g, 加入10倍體積于4℃預冷的磷酸緩沖液(15.6 mmol/L Na2HPO4, 3.5 mmol/L KH2PO4, pH7.5), 于10 000 r/min均質(zhì)1 min, 將均質(zhì)液于4℃、8 000 r/min離心20 min, 取沉淀重復上述操作, 將兩次上清液合并即為水溶性蛋白。于上述所得沉淀中加入10倍體積于4℃預冷的磷酸緩沖液(0.45 mol/L KCl, 15.6 mmol/L Na2HPO4, 3.5 mmol/L KH2PO4, pH 7.5), 于10 000 r/min均質(zhì)1 min, 間隔20 s。將均質(zhì)液于4℃、10 000 r/min離心30 min, 取沉淀重復上述操作, 將兩次上清液合并即為鹽溶性蛋白。所得沉淀加入10倍體積的0.1 mol/L NaOH, 室溫攪拌4 h, 于8 000 r/min離心20 min, 所得上清液即為堿溶性蛋白, 沉淀為不溶性蛋白。

各種蛋白含量用半微量凱氏定氮法進行測定。

1.2.4 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照Huang[11]等的方法, 并稍作修改。

取新鮮和階段性凍藏的梭子蟹肌肉, 精確稱量5 g, 加入10倍體積于4℃預冷的Tris-maleate緩沖液(50 mmol/L KCl, 20 mmol/L Tris-maleate, pH 7.0), 將均質(zhì)液于4℃、8 000r/min離心20 min, 棄去上清液, 取沉淀重復上述操作兩次, 以洗去肌肉中的肌漿蛋白。在洗滌后的沉淀中加入6倍體積于4℃預冷的Tris-maleate 緩沖液(0.6 mol/L KCl, 20 mmol/L Tris-maleate, pH 7.0), 充分均質(zhì), 在4℃條件下提取60min, 提取液于4℃、10000 r/min離心30 min, 得到的上清液即為肌原纖維蛋白溶液, 加入10倍體積預冷的去離子水稀釋使蛋白沉淀下來, 4℃、10 000 r/min離心30 min, 所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.2.5 肌原纖維蛋白含量的測定

肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L KCl溶液稀釋100倍, 取1mL加入5 mL考馬斯亮藍溶液, 在595 nm下測定其吸光度, 對照標準曲線得到肌原纖維蛋白的濃度, 計算出含量。

1.2.6 肌原纖維蛋白生化特性的測定

Ca2+-ATPase活性的測定、總巰基含量的測定參考Benjakul等[6]的方法; 二硫鍵含量的測定參考Thannhauser等[12]的方法。

1.2.7 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳

用0.6 mol/L KCl將肌原纖維蛋白溶液稀釋到約1.0g/L。參考Chomnawang等[13]的方法并稍作修改。按照1︰1的比例在稀釋的肌原纖維蛋白溶液中加入樣品緩沖液, 沸水浴5min后上樣。采用5%的濃縮膠和12%的分離膠, 用考馬斯亮藍染色液進行染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用軟件Excel 2007和SPSS 22, 所有指標結(jié)果均取3次平行試驗的平均值, 并進行了差異性分析(<0.05); 曲線繪制軟件采用OriginPro 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹肌肉基本營養(yǎng)成分

新鮮的三疣梭子蟹肌肉的主要營養(yǎng)成分如表1所示?？梢钥闯? 三疣梭子蟹肌肉中蛋白質(zhì)含量非常豐富, 折合干重高達83.97%, 粗脂肪的含量很低, 折合干重僅為5.96%, 屬高蛋白低脂肪食品。

表1 三疣梭子蟹主要營養(yǎng)成分分析

2.2 肌肉各組分蛋白質(zhì)含量的變化

三疣梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)可根據(jù)溶解性分為4種。由圖1可見, 對于新鮮的三疣梭子蟹, 鹽溶性蛋白占總蛋白的52.15%, 是最主要的蛋白質(zhì), 其次, 分別是水溶性蛋白、堿溶性蛋白和不溶性蛋白。隨著凍藏時間的延長, 鹽溶性蛋白和不溶性蛋白含量逐漸下降, 是由于凍藏過程中兩者發(fā)生不同程度的變性或降解。堿溶性蛋白含量有所上升, 可能是水溶性和鹽溶性變性聚集或降解所致。而水溶性蛋白在凍藏的0~30 d含量有所上升, 可能是由于鹽溶性蛋白降解引起的, 之后也呈現(xiàn)下降趨勢是因為其自身也發(fā)生降解。該結(jié)果與李姣等[14]研究中國對蝦在0℃和4℃冷藏條件下蛋白組成的變化趨勢相似, 但水溶性蛋白和鹽溶性蛋白含量均比中國對蝦低, 這是因為中國對蝦比三疣梭子蟹總蛋白含量高, 而水分含量低。–20℃凍藏的梭子蟹樣品各組分蛋白質(zhì)含量下降或上升的幅度較–40℃更大一些, 這說明–20℃比–40℃凍藏的樣品蛋白質(zhì)變性程度大。凍藏過程中產(chǎn)生的冰晶是影響蛋白質(zhì)變性的主要因素之一, 劉藝杰等[15]研究表明凍藏溫度越低, 冰晶顆粒越小, 蛋白質(zhì)變性程度越低, 同本研究中蛋白質(zhì)變性規(guī)律相符合。

2.3 肌原纖維蛋白含量的變化

由圖2可知, 凍藏前期45 d, 隨著凍藏時間的延長, 不同溫度凍藏的樣品肌原纖維蛋白含量的變化差異較大(<0.05)。–20℃凍藏的三疣梭子蟹中肌原纖維蛋白含量顯著下降, 而–40℃凍藏的樣品則無顯著變化。45d之后兩種溫度凍藏的樣品肌原纖維蛋白含量均有所下降, 但下降幅度較小。–20℃凍藏的樣品肌原纖維蛋白含量降至新鮮樣品的47.9%, –40℃凍藏的樣品下降至81.1%。凍藏過程中蛋白質(zhì)變性導致形成不溶性大分子蛋白凝集體是肌原纖維蛋白含量下降的重要因素[16]。目前, 解釋其變性機理的學說主要有三種: 結(jié)合水分離學說、細胞液濃縮學說以及水化作用學說[17]。研究表明, 凍藏低于冰結(jié)晶點時, 凍藏溫度越低, 蛋白質(zhì)變性越慢, 凍藏時間越長, 肌肉蛋白質(zhì)的鹽溶性越差[18]。凍藏中氫鍵、二硫鍵以及鹽鍵的形成會導致蛋白質(zhì)的溶解性下降, 而下降程度則與水產(chǎn)品的種類有關(guān), 如大西洋鱈魚魚糜在–20℃凍藏14 d和42 d后肌原纖維蛋白的含量分別下降了23%和47.5%[19]。

2.4 肌原纖維蛋白中Ca2+-ATPase活性的變化

肌原纖維蛋白是含有多種蛋白質(zhì)的復雜蛋白體系, 其中最主要的為肌球蛋白和肌動蛋白。肌球蛋白頭部具有ATPase活性, 而Ca2+能夠激活其活性, 因此Ca2+-ATPase活性可以反映肌球蛋白的完整性[20]。如圖3所示, 在整個90 d的冷凍存儲期間, 不同溫度凍藏的樣品Ca2+-ATPase活性均下降(<0.05)。在最初30 d凍藏期間, Ca2+-ATPase活性降低顯著, 之后仍呈下降趨勢, 但趨勢減緩。–20℃與–40℃凍藏的樣品之間差異明顯(<0.05)。凍藏90 d時, –20℃凍藏的樣品Ca2+-ATPase活性降低47.8%, –40℃凍藏的樣品Ca2+-ATPase活性降低28.3%。Benjakul等[8]研究表明, 鋸緣青蟹硬殼蟹在–20℃凍藏過程中肌肉中Ca2+-ATPase活性顯著降低, 與本研究結(jié)果相一致。曾名勇等[21]研究得出, 鳙魚肌肉蛋白質(zhì)中Ca2+-ATPase活性在–20℃凍藏至第60天時幾乎降低為0, 這可能是由于不同類型肌肉Ca2+-ATPase活性受蛋白變性的影響程度不同。在延長凍藏時間情況下, 活性的下降表明肌球蛋白發(fā)生變性, 尤其是球狀頭部部位。ATPase活性降低可能與肌球蛋白球狀頭部巰基的氧化有關(guān)[22]。

2.5 肌原纖維蛋白中總巰基含量的變化

由圖4可以得出, 隨著貯藏時間的延長, 不同凍藏溫度下的總巰基含量均顯著下降(<0.05)。在–20℃凍藏條件下, 最初15 d巰基含量急劇下降27.6%, 15 d之后, 巰基含量的下降趨勢減緩。–40℃凍藏的樣品中巰基含量則下降較緩慢, 30~45 d下降較快, 45 d后有輕微降低。與–40℃凍藏三疣梭子蟹相比, –20℃凍藏的三疣梭子蟹肌肉的巰基含量下降程度更大, 凍藏時間越長, 下降程度越大。凍藏過程中的活性巰基量普遍降低[22]。巰基含量的降低可能是由于巰基氧化形成二硫鍵, 或者由于氫鍵和疏水鍵的形成, 掩蓋了肌動球蛋白分子上的活性巰基的結(jié)構(gòu)[23]。Benjakul等[6]研究了軟殼蟹–20℃下貯藏12周, 第一周總巰基含量顯著下降, 2~12周只有輕微下降。Ramirez等[24]報道了羅非魚在–20℃下貯藏15 d, 其總巰基含量持續(xù)下降, 下降了初始值的33%, 比梭子蟹總巰基含量下降幅度更大, 這可能是由于肌原纖維蛋白巰基氧化易感性的差異。

2.6 肌原纖維蛋白中二硫鍵含量的變化

由圖5可知, 在–20℃和–40℃凍藏條件下, 三疣梭子蟹肌原纖維蛋白中的二硫鍵隨著凍藏時間的延長逐漸增加(<0.05), 不同凍藏溫度下的樣品間差異明顯。在0~15 d的凍藏過程中, 不同溫度下的樣品二硫鍵含量均明顯增加。然而, 在凍藏45 d后, –40℃凍藏的樣品中二硫鍵含量無明顯增加, –20℃凍藏的樣品中二硫鍵含量仍持續(xù)上升, 但上升趨勢較0~15 d有所減緩。綜合分析圖4與圖5, 可以看出二硫鍵增加與巰基減少是一致的, 這表明在凍藏過程中, 巰基會氧化產(chǎn)生二硫鍵。Benjakul等[25]的研究表明, 在–18℃環(huán)境下凍藏24周內(nèi), 隨著石首魚(白花魚)、狗母魚、馬鲅鯛以及大眼鯛的肌肉中形成二硫鍵時, 巰基含量會減少。Ramirez[24]等的研究也表明, 在凍藏條件下, 尼羅羅非魚肌球蛋白的巰基含量也會減少, 同期有二硫鍵的形成。

2.7 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳

由圖6可知, 三疣梭子蟹的肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜中可以清晰地分辨出10條左右蛋白條帶, 主要包括肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)、肌動蛋白(actin)、原肌球蛋白(actomyosin)和肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)等, 其中最主要的是肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶。隨著貯藏時間的延長, 主要的蛋白質(zhì)條帶信號均有減弱, 說明肌原纖維蛋白中各種蛋白質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的降解, 且–20℃組比–40℃組降解更明顯。值得注意的是約27 kDa的位置有一條帶信號隨著凍藏時間的延長略有加強, 推測為大分子蛋白質(zhì)降解所得。此外, 凍藏會引起肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變和蛋白分子間的交聯(lián)、聚合, 在電泳圖譜上也呈現(xiàn)為蛋白條帶信號的減弱[26]。

3 結(jié)論

通過對不同溫度下凍藏的三疣梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)生化特性的研究, 可以看出, 不同溫度凍藏對梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)的影響很大。梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)根據(jù)溶解性分類的四種蛋白質(zhì)中, 水溶性蛋白含量先增加后減少, 鹽溶性和不溶性蛋白含量逐漸減少, 堿溶性蛋白含量則有所增加。肌原纖維蛋白含量總體呈下降趨勢, 且–20℃和–40℃兩組之間差異顯著(<0.05)。Ca2+-ATPase活性凍藏前期顯著下降(<0.05), 30 d后下降趨勢減緩?？値€基含量凍藏時間延長逐漸減少, 同期二硫鍵含量增加, 且–20℃比–40℃組變化幅度大。由此可見, 凍藏溫度對三疣梭子蟹肌肉蛋白質(zhì)影響顯著, 溫度越低, 保藏效果越好, 保藏時間也越長。

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Changes in the biochemical properties of muscle protein of swimming crab () during frozen storage

HUANG Lin, ZHANG Li, WU Dan-lu

(Ocean University of China, College of Food Science and Engineering, Qingdao 266003, China)

This study analyzed the changes in the biochemical characteristics of muscle protein during frozen storage at –20℃ or –40℃ based on nutrient composition, protein composition, myofibrillar protein content, Ca2+-ATPase activity, sulfhydryl group content, disulfide bond content, and SDS-PAGE analysis of myofibrillar protein of swimming crab. Results showed that the muscle of the swimming crab was a typical food with a high protein content. With extension of the duration of frozen storage, the water-soluble protein content increased and then decreased, the salt-soluble protein and -insoluble protein contents decreased, and the content of alkaline-soluble protein increased gradually. Myofibrillar protein content, Ca2+-ATPase activity, and sulfhydryl group content decreased with prolongation of the duration of frozen storage, whereas the disulfide bond content showed an increasing trend, with a significant difference between the two groups at –20℃ and –40℃(< 0.05). The SDS-PAGE results showed that all types of proteins of myofibrillar protein were degraded to different degrees, and the degradation was more apparent at ?20℃ than at ?40℃. Therefore, frozen storage at –40℃ has minimal effect on the biochemical characteristics of muscle protein.

swimming crab (); muscle; protein; biochemical properties

(本文編輯: 康亦兼)

October 7, 2016

[Province Natural Science Foundation of Shandong, NO.ZR2015CM010]

TS254.1

A

1000-3096(2017)06-0041-07

10.11759/hykx20151224003

2016-10-07;

2016-12-19

山東省自然科學基金項目(ZR2015CM010)

黃琳(1991-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)食品化學研究, 電話: 18765907071, E-mail: huanglin0126@163.com; 張莉, 通信作者, E-mail: qdzhangli@ouc.edu.cn