丁陳君，陳方，陳云偉，鄭穎，鄧勇

中國科學(xué)院成都文獻(xiàn)情報(bào)中心，成都 610041

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納米孔測序技術(shù)發(fā)展態(tài)勢分析

丁陳君，陳方，陳云偉，鄭穎，鄧勇

中國科學(xué)院成都文獻(xiàn)情報(bào)中心，成都 610041

納米孔測序技術(shù)以其快捷、低成本和可測長片段DNA等優(yōu)勢而備受矚目。為了解該技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展態(tài)勢，利用文獻(xiàn)計(jì)量和專利分析的方法對納米孔測序技術(shù)的學(xué)術(shù)研究和專利申請情況進(jìn)行定量分析。在應(yīng)用前景方面，納米孔測序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，在即時(shí)檢測傳染源、基因組組裝、基因診斷和太空應(yīng)用方面都有不錯(cuò)的表現(xiàn)，但未來該技術(shù)在錯(cuò)誤率和平行能力方面仍需改進(jìn)。

納米孔；基因測序；文獻(xiàn)計(jì)量；專利分析

自2003年“人類基因組計(jì)劃”完成之后，測序技術(shù)發(fā)展迅猛，測序讀長不斷加長、通量不斷提升、時(shí)間不斷縮短，基因組測序技術(shù)成本大大降低，逐漸成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，測序物種數(shù)量和物種多樣性與日俱增。2005年，第二代測序技術(shù)即高通量測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并得到廣泛應(yīng)用[1]。

納米孔測序技術(shù)是近年來在基因測序領(lǐng)域興起的一項(xiàng)新技術(shù)，起源于1996年哈佛大學(xué)的Daniel Branton、加州大學(xué)的David Deamer等用膜通道檢測多核苷酸序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]。其主要原理是讓單鏈DNA的堿基逐個(gè)穿過1nm的小孔，檢測不同堿基組合的特有結(jié)構(gòu)在穿過時(shí)產(chǎn)生的電流變化來進(jìn)行測序。該測序技術(shù)無需預(yù)先擴(kuò)增或標(biāo)記DNA，可以降低測序成本，且可以連續(xù)讀取長片段的DNA序列，分析速度也大大提高，基于這些優(yōu)勢該技術(shù)已受到廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是最有可能成為下一代基因測序的技術(shù)之一。2016年，《科學(xué)》雜志已將基于納米孔的便攜式檢測技術(shù)評為十大科技突破之一。2014年6月，瑞士羅氏集團(tuán)收購納米孔測序公司Genia Technologies。該次收購將加強(qiáng)羅氏新一代測序平臺。幾乎同期，羅氏還收購了另一家納米孔測序公司Stratos Genomics。此外，作為牛津納米孔技術(shù)公司早期的主要股東之一的Illumina公司迫于競爭壓力不得不與牛津納米孔技術(shù)公司對簿公堂，以搶占該領(lǐng)域的核心專利。Illumina和羅氏公司加緊在納米孔測序技術(shù)領(lǐng)域的布局凸顯了該技術(shù)廣闊的發(fā)展前景。

納米孔測序技術(shù)自其理論誕生以來已發(fā)展了20年，最初的理念非常直觀，但實(shí)施過程中遇到很多問題。在美國國立衛(wèi)生研究院“1000美元基因組計(jì)劃”的激勵(lì)下，越來越多的研究人員加入到解決堿基穿過納米孔時(shí)的檢測手段、穿過速度以及納米孔本身的改良等技術(shù)難題的行列。

2005年，由于IP集團(tuán)種子基金的資助，英國牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies）成立，并于2012年發(fā)布其納米孔測序平臺——MinION。該平臺只有U盤大小，價(jià)格僅1000美元左右，能對很長的DNA進(jìn)行測序，由此開啟了納米孔測序技術(shù)的商業(yè)化新篇章。2013年11月，該公司啟動MinION測序儀的早期試用計(jì)劃。2014年的基因組生物技術(shù)進(jìn)展大會上，首批試用數(shù)據(jù)公布于眾。隨后其他各試驗(yàn)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)陸續(xù)發(fā)布。英國?？巳卮髮W(xué)研究小組對MinION的性能進(jìn)行了評估，他們認(rèn)為作為首個(gè)基于納米孔的單分子測序儀，MinION前景值得期待，但目前約38%的錯(cuò)誤率則限制了其競爭力[3]。瑞典于默奧大學(xué)研究小組利用MinION構(gòu)建細(xì)菌基因組骨架，序列讀取還有待改進(jìn)，但未來在組裝基因組、現(xiàn)場快速檢測生物體方面的應(yīng)用令人期待[4]。

2009年3月，美國納米孔測序公司Genia Technologies成立，其傳感器技術(shù)及其專有的NanoTag化學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確讀取，克服了早期納米孔測序工作面臨的諸多限制。

2015年，牛津納米孔技術(shù)公司創(chuàng)始人Hagan Bayley和牛津大學(xué)等研究人員在高通量檢測納米孔離子流變化情況方面取得突破性進(jìn)展。他們開發(fā)了光傳感納米孔芯片，將納米孔離子流變化轉(zhuǎn)化為熒光變化，從而進(jìn)行高通量檢測[5]。2016年3月，美國哈佛大學(xué)和哥倫比亞大學(xué)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于納米孔的單分子邊合成邊測序（SBS）系統(tǒng)，可以在單分子水平上對多個(gè)DNA模板進(jìn)行平行測序，分辨率達(dá)到了單堿基水平[6]。

1 研發(fā)現(xiàn)狀分析

1.1 文獻(xiàn)計(jì)量

以科學(xué)引文索引擴(kuò)展版（science citation index expanded，SCI-E）作為數(shù)據(jù)源對納米孔測序技術(shù)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，文獻(xiàn)類型不限，相關(guān)論文共1091篇（檢索時(shí)間2017年4月5日）。

通過對納米孔測序技術(shù)的論文進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)論文數(shù)量增長較為緩慢，說明其技術(shù)發(fā)展較為慢熱（圖1）。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，商業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，納米孔測序技術(shù)也將日益受到關(guān)注。

1.1.1 國家分布

圖1 納米孔測序技術(shù)論文發(fā)表年度分布

從發(fā)文量TOP10國家來看，美國具有絕對的優(yōu)勢，共發(fā)表納米孔測序技術(shù)領(lǐng)域的論文548篇，是排名第二的中國的近3倍。英國排名第三，排名第4～10的國家發(fā)文量差異不明顯（表1）。

從被引情況來看，發(fā)文量TOP10國家中，篇均被引次數(shù)前三的分別是英國、加拿大和美國，分別為50.37、48.63和38.08次，篇均被引次數(shù)最少的是瑞典，為11.3次（表1）。將被引次數(shù)50以上的論文作為高被引論文進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，美國、英國和中國的高被引論文發(fā)文量居于前三；加拿大、荷蘭和瑞士高被引論文量占發(fā)文總量的比例最大，其次是美國和英國（表2）。結(jié)合發(fā)文量和被引情況可以看出，美國、英國和加拿大在納米孔測序技術(shù)領(lǐng)域相對具有較強(qiáng)的研發(fā)實(shí)力。

1.1.2 主要研究機(jī)構(gòu)

在開展納米孔測序技術(shù)研究的機(jī)構(gòu)中，美國加州大學(xué)系統(tǒng)發(fā)表相關(guān)論文數(shù)量最多（78篇），美國伊利諾伊大學(xué)系統(tǒng)和中國科學(xué)院分別發(fā)表65篇和46篇，位列第二和第三（圖2）。在發(fā)文量前十位研究機(jī)構(gòu)中，有7家美國機(jī)構(gòu)，2家中國機(jī)構(gòu)和1家英國機(jī)構(gòu)。

1.1.3 國際合作

從開展納米孔測序技術(shù)研究的機(jī)構(gòu)合作情況來看，位于前十的機(jī)構(gòu)除加州大學(xué)圣克魯茲分校與華盛頓大學(xué)和加州大學(xué)圣克魯茲分校與哈佛大學(xué)之間的合作較頻繁之外，其余幾所機(jī)構(gòu)之間的合作并不緊密。美國猶他大學(xué)幾乎獨(dú)立開展研究（圖3）。包括中國科學(xué)院在內(nèi)的這些機(jī)構(gòu)都位于小的合作網(wǎng)絡(luò)中心，說明這些機(jī)構(gòu)都具有較強(qiáng)的研發(fā)水平，開展以各自為主導(dǎo)的國際合作研究。

表1 發(fā)文量TOP10國家及其論文被引情況

表2 高被引論文發(fā)文量TOP10國家

圖2 納米孔測序技術(shù)論文發(fā)文量TOP10機(jī)構(gòu)

圖3 納米孔測序技術(shù)研究機(jī)構(gòu)合作網(wǎng)絡(luò)

1.2 專利分析

以湯森路透Web of Science平臺中Derwent Innovations IndexSM數(shù)據(jù)庫（DII數(shù)據(jù)庫）作為數(shù)據(jù)源，分析納米孔測序技術(shù)專利的發(fā)展情況（數(shù)據(jù)下載日期為2017年5月31日）。

1.2.1 時(shí)間趨勢

從圖4可以看出納米孔測序技術(shù)相關(guān)專利保護(hù)情況的年度發(fā)展趨勢，1999～2016年該技術(shù)發(fā)明專利數(shù)量總體呈緩慢增長趨勢，1999～2004年主要處于技術(shù)引入期，2005～2009年專利公開數(shù)量沒有大的突破，處于技術(shù)瓶頸期，許多技術(shù)仍處于研發(fā)階段，2010年以后納米孔測序技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展階段，尤其是2012年首臺測序儀問世標(biāo)志著技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，專利公開數(shù)量激增，至2016年已達(dá)到101件（圖4）。這一趨勢說明納米孔測序技術(shù)已逐漸受到各界重視。

1.2.2 專利受理國家/地區(qū)分布

由相關(guān)專利受理國家/地區(qū)分布情況可以看出，美國、歐洲、中國是納米孔測序技術(shù)專利申請人最重視的市場保護(hù)地，其次是日本、加拿大、澳大利亞（圖5）。

圖4 納米孔測序技術(shù)相關(guān)專利公開量年度趨勢

圖5 納米孔測序技術(shù)專利受理國家/地區(qū)分布

1.2.3 主要申請機(jī)構(gòu)

由納米孔測序技術(shù)的主要申請機(jī)構(gòu)可以看出，英國牛津納米孔技術(shù)公司、美國Genia Technologies公司和美國Paci fi c Biosciences公司的專利申請數(shù)量居全球前三。專利申請數(shù)量TOP10機(jī)構(gòu)中，除英國牛津納米孔技術(shù)公司和瑞士羅氏公司以外，其余8家機(jī)構(gòu)均為美國機(jī)構(gòu)，其中6家為美國公司，還有2家為加州大學(xué)和哈佛大學(xué)，可見美國在該領(lǐng)域具有壟斷優(yōu)勢（圖6）。

1.2.4 相關(guān)專利的研發(fā)重點(diǎn)

將納米孔測序技術(shù)專利根據(jù)國際專利分類號進(jìn)行分類，專利申請數(shù)量最多的10個(gè)分類號如表3所示。根據(jù)分類號對應(yīng)的注釋可知，目前納米孔測序技術(shù)相關(guān)專利主要集中在包含酶或微生物的測定或檢驗(yàn)方法；其所用的組合物或試紙；組合物的制備方法；在微生物學(xué)方法或酶學(xué)方法中的條件反應(yīng)控制（C12Q）領(lǐng)域，其次是借助于測定材料的化學(xué)或物理性質(zhì)來測試或分析材料（G01N）領(lǐng)域等。

2 應(yīng)用前景

2.1 即時(shí)檢測傳染源

第二代測序平臺的廣泛使用，填補(bǔ)了之前在傳染病爆發(fā)時(shí)診斷檢測方面的缺口，但與PCR、ELISA技術(shù)一樣，存在檢測時(shí)間過長的問題，而納米孔測序技術(shù)能很好地彌補(bǔ)這方面的不足。

2015年4月，歐洲移動實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（EMLP）成員和美國NIH的團(tuán)隊(duì)利用MinION測序儀在48h內(nèi)讀取了14名患者的埃博拉基因組，由此幫助醫(yī)生診斷患者病因，并快速繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定感染的源頭。2016年2月3日，Nature首次報(bào)道了利用納米孔測序技術(shù)對埃博拉病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)測序的成功例子[7]。

2.2 基因組組裝

圖6 納米孔測序技術(shù)專利申請TOP10機(jī)構(gòu)

英國?？巳卮髮W(xué)在評估MinION系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合Illumina MiSeq數(shù)據(jù)，并依靠其長讀長的優(yōu)勢在基因組復(fù)雜區(qū)域組裝方面具有良好的效果[3]。

2016年12月初，牛津納米孔技術(shù)公司主辦的行業(yè)交流會上宣布首次使用Oxford Nanopore掌上測序儀完成了對一個(gè)人類標(biāo)準(zhǔn)樣本NA12878的測序和一位牛津生物醫(yī)學(xué)研究中心的患者的測序，由此打開了大規(guī)模使用納米孔測序技術(shù)的大門。

2.3 基因診斷

哈佛大學(xué)研究小組開發(fā)了一種基于納米孔的電子DNA測序平臺。這個(gè)新的測序機(jī)器包括7個(gè)蛋白質(zhì)亞基，共同組成了1個(gè)復(fù)雜的納米孔，其中只有1個(gè)可以在正確的孔道開放時(shí)間、正確的位置特異性地與DNA聚合酶共軛[8]。該成果將生物大分子機(jī)器與合成膜結(jié)合在一起，然后整合到常規(guī)電子機(jī)器中，創(chuàng)造了一種全新的低成本基因診斷技術(shù)。

表3 納米孔測序技術(shù)相關(guān)專利前十位國際分類號

2.4 太空應(yīng)用

2016年7月，一臺MinION測序儀搭乘SpaceX 9號進(jìn)入國際空間站，對細(xì)菌、病毒和小鼠DNA進(jìn)行測序，所得數(shù)據(jù)發(fā)回地球，在此基礎(chǔ)上研究人員對MinION在不同環(huán)境下的工作狀態(tài)進(jìn)行評估，以驗(yàn)證MinION在微重力下的性能，并為下一步探索做好準(zhǔn)備，為未來更多科學(xué)研究提供支持。

此外，小型便攜式DNA測序儀還在科研、藥物定制、食品安全檢測、農(nóng)作物科學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測以及安全防護(hù)等許多方面具有應(yīng)用潛力，在推進(jìn)基于基因組技術(shù)的個(gè)性化醫(yī)學(xué)方面也將做出巨大貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

通過文獻(xiàn)計(jì)量和專利分析來看，目前納米孔測序技術(shù)仍處于發(fā)展初期，許多技術(shù)還在研發(fā)階段，受關(guān)注程度不太高。美國、中國和英國在納米孔測序技術(shù)領(lǐng)域發(fā)文量方面居前三位。美國和英國在高被引論文發(fā)表數(shù)量和發(fā)文總量占比方面處于領(lǐng)先地位。在專利申請方面，產(chǎn)業(yè)界的申請人占多數(shù)，美國專利權(quán)人在納米孔測序技術(shù)專利申請方面具有壟斷優(yōu)勢。加州大學(xué)和哈佛大學(xué)在論文發(fā)表和專利申請方面都居于世界前列。中國科學(xué)院和東南大學(xué)是發(fā)表相關(guān)論文總數(shù)進(jìn)入TOP10機(jī)構(gòu)。由發(fā)文量、發(fā)文質(zhì)量和專利申請數(shù)量的機(jī)構(gòu)排名可以看出，美國和歐洲都具有很強(qiáng)的研發(fā)實(shí)力，并且這些國家/地區(qū)的市場也十分受重視。

目前，納米孔測序技術(shù)正向著長讀長、高通量、低成本和小型化的方向發(fā)展，與其他主流測序技術(shù)相比，在速度和成本方面已顯現(xiàn)一定的優(yōu)勢，并且應(yīng)用領(lǐng)域相當(dāng)廣泛。未來，該技術(shù)在從測序原理到制造工藝，尤其是序列讀取錯(cuò)誤率和平行測序能力方面還有很大的改進(jìn)空間。

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Analysis on development trend of nanopore sequencing technology

DING Chenjun，CHEN Fang，CHEN Yunwei，ZHENG Ying，DENG Yong
Chengdu Library and Information Center, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China

Nanopore sequencing technology with its fast, low cost and measuring long DNA fragments and other advantages has attracted much interest. Combined with bibliometric and patent analysis methods, the present situation of research and patent application status of the technology were analyzed in this paper. It shows a great application prospect in real-time detection of infection, genome assembly, genetic diagnosis and space applications, but the technology need to be improved in sequencing error rate and parallel capacity.

nanopore; gene sequencing; bibliometrics; patent analysis

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.001

丁陳君，博士，副研究員。主要從事生物技術(shù)及生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域情報(bào)研究工作，包括領(lǐng)域態(tài)勢分析、引文網(wǎng)絡(luò)分析、熱點(diǎn)主題挖掘等。E-mail：dingcj@clas.ac.cn