王瑞飛+康春曉+許圓圓+楊清香

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.023[HT9.]

摘要：從藥用植物懷地黃的根中分離出32株內(nèi)生細(xì)菌，并選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃斑枯病和地黃根腐病5種菌作為供試菌株，采用點(diǎn)菌法、平板對(duì)峙法和菌餅法測(cè)定抗菌活性。結(jié)果顯示，懷地黃中分離的32株內(nèi)生菌對(duì)5種供試菌具有不同的抑制能力，其中有8株細(xì)菌對(duì)供試的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用，顯示出廣譜的抗菌性；有2株細(xì)菌DH-10和DH-11對(duì)選取的5種供試菌都有抑制作用，且抗菌活性較強(qiáng)，具有生防菌開發(fā)潛力。所分離的活性內(nèi)生菌通過16S rRNA基因序列分析，主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希氏菌屬，其中對(duì)地黃斑枯病和根腐病都具有拮抗作用的內(nèi)生菌主要集中在芽孢桿菌屬中。

關(guān)鍵詞：懷地黃；內(nèi)生細(xì)菌；抑菌活性；生物防治

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0082-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-09-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21277041、21477035）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（編號(hào)：13IRTSTHN009）。

作者簡(jiǎn)介：王瑞飛（1983—），男，河南汝州人，博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)資源與微生物學(xué)研究。E-mail：wswrf@163.com。

通信作者：楊清香，博士，教授，主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：yangqx66@163.com。[HJ]

[ZK）]

植物內(nèi)生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]。它們能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性物質(zhì)，有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制、抗氧化等生物學(xué)活性[2-5]。已有的報(bào)道顯示，從內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)新活性化合物的比例為51%，超過土壤微生物的38%[6]，因此，利用植物內(nèi)生菌篩選高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)潛力巨大。除了能夠促進(jìn)植物生長和賦予植物抗逆性[7-8]之外，植物內(nèi)生菌還可以通過分泌抗生物質(zhì)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[9]等不同機(jī)制，來減輕和防治植物病蟲害。植物內(nèi)生菌的以上特性使其成為醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)研究的一個(gè)新起點(diǎn)[10]。

懷地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，主產(chǎn)于河南、遼寧、河北、山東、浙江等地。它以根入藥，具有多種藥效，常用于治病養(yǎng)生、滋補(bǔ)保健、清熱涼血、養(yǎng)陰生津[11]，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是，對(duì)于懷地黃內(nèi)生菌的研究并不深入。本研究對(duì)采自河南省焦作市武陟地區(qū)的懷地黃進(jìn)行內(nèi)生菌的分離篩選，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、地黃斑枯病菌和地黃根腐病菌為供試菌株，對(duì)所得菌株進(jìn)行抗菌活性的初步研究，探討懷地黃內(nèi)生菌對(duì)不同病原菌的拮抗作用，為開發(fā)利用地黃植物內(nèi)生菌資源提供了初步的試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

[HTK]1.1材料[HT]

1.1.1植物材料懷地黃于2012年11月采自河南省焦作市武陟地區(qū)。

1.1.2供試菌種大腸桿菌（Escherichia coli，革蘭氏陰性）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革蘭氏陽性）和黑曲霉（Aspergillus niger，霉菌）均由河南師范大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存，地黃斑枯病病菌（Septoris digitalis）和地黃根腐病病菌（Fusarium silani）2種病原真菌購自河南科技學(xué)院。

1.1.3培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[12]。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生菌的分離純化與保存[11]

取新鮮的懷地黃塊根，用清水洗去表面泥土，在無菌條件下去除表皮，依次用70%乙醇浸泡3 min、0.1%HgCl2溶液浸泡3 min、70%乙醇分別浸泡1 min，然后用無菌水清洗5～7次，放置在無菌吸水紙上晾干；取最后1次清洗水涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 2 d，檢測(cè)表面消毒是否徹底。用無菌刀片將消毒后的懷地黃塊根切成1 cm見方的小塊，接種于LB培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng) 2 d。待平板上懷地黃塊周圍長出菌后，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分純。再等培養(yǎng)基上有菌長出后，立即挑選新的菌落進(jìn)行純化，直到平板上菌落外觀形態(tài)一致為止，將純化后的單一菌株在試管斜面中劃線，并于4 ℃條件下保藏。

1.2.2內(nèi)生菌抗菌活性測(cè)定

本試驗(yàn)采用平板點(diǎn)接法、平板對(duì)峙法[11]和菌餅法[13]來測(cè)定內(nèi)生菌的抗菌活性。

平板點(diǎn)接法應(yīng)用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，將經(jīng)平板活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配置成一定濃度的菌懸液，細(xì)胞濃度一般為105～106 CFU/mL之間。將懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，將分離出的內(nèi)生菌點(diǎn)接于平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，看是否有抑菌圈的出現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)抑菌強(qiáng)度大小。

平板對(duì)峙法用于黑曲霉，將分離出的內(nèi)生菌和黑曲霉分別接種于PDA平板上，兩者相間隔2 cm，于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，看分離出的內(nèi)生菌是否對(duì)黑曲霉有抑制效果。處理組菌絲生長速度慢于對(duì)照組則表明此內(nèi)生菌對(duì)黑曲霉有抑制效果。

菌餅法應(yīng)用于地黃根腐病菌（Fusarium silani）和地黃斑枯病菌（Fusarium wilt）拮抗內(nèi)生菌的篩選。將分離出的內(nèi)生菌配置成一定濃度的菌懸液，細(xì)胞濃度一般為105～106 CFU/mL 之間。將懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，地黃病原菌分別接種于PDA平板上，在接菌的PDA平板上打孔挑取直徑為5 mm地黃枯萎病菌和地黃根腐病菌菌餅接種于LB平板中，挑取菌餅于空白LB平板作對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長情況及抑制效果。按下列公式計(jì)算抑制率：菌絲生長抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。endprint

1.2.3內(nèi)生細(xì)菌鑒定將純化后的菌株進(jìn)行DNA提取[14]、16S rRNA的擴(kuò)增和測(cè)序。采用16S rRNA通用引物27f （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。將提取的DNA送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列檢測(cè)，利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，通過MEGA 4.1軟件對(duì)同源序列以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，運(yùn)用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，初步確定菌株的分類地位。

2結(jié)果與分析

2.1活性內(nèi)生細(xì)菌分離和抑菌活性測(cè)定

采用嚴(yán)格的組織表面消毒法，對(duì)地黃塊根進(jìn)行了內(nèi)生細(xì)菌的分離，共獲得32株內(nèi)生細(xì)菌。利用大腸桿菌、金黃色球菌、黑曲霉、地黃斑枯病病菌和地黃根腐病病菌作為供試菌種對(duì)所分離的內(nèi)生菌的抑菌效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，32株地黃內(nèi)生細(xì)菌對(duì)5種供試菌有不同程度的抑制效果。抑制大腸桿菌的活性菌占分離總菌數(shù)的56.3%，抑制金黃色葡萄球菌的活性菌占分離總菌數(shù)的53.1%，抑制黑曲霉的活性菌株占分離總細(xì)菌數(shù)的比例高達(dá)75.0%，抑制地黃斑枯病病菌的活性菌株占分離總細(xì)菌數(shù)的18.8%，抑制地黃根腐病病菌的活性菌株占分離總細(xì)菌數(shù)的9.4%。在這些具有抗菌活性的菌株中，DH-10和DH-11這2株細(xì)菌對(duì)5種供試菌均能有效抑制（表1）；1株細(xì)菌DH-01對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和地黃斑枯病病菌均能有效抑制（表1）；1株細(xì)菌 DH-23 對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃斑枯病病菌和地黃根腐病病菌均能有效抑制（表1）；8株菌（DH-01、DH-10、DH-11、DH-17、DH-26、DH-27、DH-28和DH-29）對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉均能有效抑制（表1）。活性內(nèi)生菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制效果舉例見圖1。這些結(jié)果表明，地黃內(nèi)生菌中的部分菌株具有較為廣譜的抗菌活性。

針對(duì)能夠?qū)е碌攸S斑枯病和根腐病的病原菌的進(jìn)一步分析顯示，32株地黃內(nèi)生細(xì)菌中有6株內(nèi)生細(xì)菌（DH-01、DH-06、DH-08、DH-10、DH-11和DH-23）對(duì)地黃斑枯病有抑制作用（圖2），DH-8和DH-10抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)95%以上；有3株內(nèi)生菌DH-10、DH-11和DH-23對(duì)地黃根腐病病菌表現(xiàn)出明顯的抑制（圖2），其抑菌率依次為94.2%、71.4%、85.7%。值得關(guān)注的是，具有抑制地黃根腐病病菌作用的3株內(nèi)生菌同時(shí)也具備抑制地黃斑枯病的作用，尤其是DH-10對(duì)2種病原真菌的抑制率均達(dá)到了94%以上，有望被用作生物防治菌種進(jìn)行開發(fā)利用。

2.2活性內(nèi)生菌的鑒定

對(duì)所分離的32株內(nèi)生菌分別進(jìn)行16S rRNA基因序列分析和BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果顯示，這32株內(nèi)生菌主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希氏菌屬。

在這些內(nèi)生菌中，分布于芽孢桿菌屬的25株占總分離菌株數(shù)的78.1%。其中，2株活性菌DH-10和DH-11分別與Bacillus tequilensis和Bacillus vallismortis有99%和84%的相似性，且對(duì)5種供試菌都有抑制作用。除了這2株菌外，還有2株菌對(duì)地黃根腐病病菌有抑制作用。分布于假單胞菌屬的4株菌占總分離菌株的12.5%，主要集中在Pseudomonas brassicacearum和Pseudomonas fluorescens。其中有3株菌不同程度的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉，有1株菌DH-23對(duì)地黃斑枯病病菌和根腐病病菌有抑制作用。分布于大腸埃希菌屬的3株菌占總分離菌株的9.4%，其中DH-08對(duì)地黃斑枯病病菌有一定的抑制作用，DH-17對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用，對(duì)于該屬菌的生

[FK（W21][TPWRF1.tif][FK）]

防抗菌作用還未曾見報(bào)道。

3結(jié)論與討論

從懷地黃根中分離得到32株內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用，其中8株內(nèi)生菌對(duì)革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌以及霉菌都有抗性，顯示抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)的特性；其中有2株細(xì)菌DH-10和DH-11對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃枯萎病病菌和地黃根腐病病菌5種供試菌株都有拮抗作用，且抗菌活性較強(qiáng)。

采用細(xì)菌16S rRNA基因序列對(duì)分離出的32株細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，這些內(nèi)生菌主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希菌屬中。其中對(duì)懷地黃枯萎病和根腐病病菌都有抑制作用的菌株主要分布在芽孢桿菌屬中。本研究發(fā)現(xiàn)具有最廣譜抗菌活性的DH-10和DH-11分別與芽孢桿菌屬中的Bacillus vallismortis 和Bacillus tequilensis具有密切的親緣關(guān)系。Michael等于1996年首次從土壤中分離得到Bacillus vallismortis，證明這株菌與枯草芽孢桿菌密切相關(guān)[16]。Gatson等于2006年首次發(fā)現(xiàn)Bacillus tequilensis 16S rRNA基因序列與枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出

[FL）]

[FK（W11][TPWRF2.tif][FK）]

[FL（2K2]99%的相似性[17]。已有的報(bào)道顯示，枯草芽孢桿菌廣泛應(yīng)用于植物根部、枝干、葉、花部以及果蔬采后病害防治方面[18]，甚至用于人和動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防。因此，本研究首次從地黃內(nèi)生菌中分離到的這2種芽孢桿菌可能與枯草芽孢桿菌在一些生理活性上具有密切關(guān)聯(lián)性，比如它們的抑菌活性。除此之外，本研究中分離得到的芽孢桿菌屬內(nèi)生菌中存在大量抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的活性菌。目前，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為芽孢桿菌主要通過營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、抗菌物質(zhì)產(chǎn)生、溶菌作用、誘導(dǎo)植物抗病性等方面來發(fā)揮其防病促生作用[19-20]。正是通過這些相關(guān)機(jī)制，芽孢桿菌殺菌劑對(duì)多種植物病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗作用，并同時(shí)具備環(huán)境兼容性好、抗逆性強(qiáng)、對(duì)人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[21]。endprint

因此，利用所獲得的具有抗菌活性的芽孢桿菌進(jìn)一步深入進(jìn)行研究，開發(fā)相關(guān)微生物菌劑是筆者后續(xù)要進(jìn)行的重要工作之一。

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]Zhang H W，Song Y C，Tan R X. Biology and chemistry of endophytes[J]. Nature Product Reports，2006，23（5）：753-771.

[2]Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J]. Nature，1994，372（6505）：425-432.[HJ1.8mm]

[3]Stierle A，Strobel G，Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.

[4]姚玉秀，魏希穎. 藥用植物內(nèi)生真菌生物活性及其成分研究[J]. 藥用生物技術(shù)，2011，18（2）：185-188.

[5]Strobel G，Daisy B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67（4）：491-502.

[6]Yu H S，Zhang L，Li L，et al. Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes[J]. Microbiological Research，2010，165（6）：437-449.

[7]朱峰，林永成，周世寧，等. 紅樹內(nèi)生真菌#2526和#1850中[XCZ111.tif；%88%88]酮類代謝產(chǎn)物的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，15（6）：406-409.

[8]Chaintreuil C，Giraud E，Prin Y，et al. Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata[J]. Applied[KG*1]and[KG*1]Environmental[KG*1]Microbiology，2000，66（12）：5437-5447.

[9][ZK（#]Chen C，Bauske E M，Musson G，et al. Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria[J]. Biological Control，1995，5（1）：83-91.[ZK）]

[10][ZK（#]Harish S，Kavino M，Kumar N，et al. Induction of defense-related proteins by mixtures of plant growth promoting endophytic bacteria against Banana bunchy top virus[J]. Biological Control，2009，51（1）：16-25.

[11]楊清香，謝永生，張昊，等. 懷地黃活性內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌抗腫瘤活性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（10）：1467-1474.

[12]沈萍. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，1999：49.

[13]單文榮，劉花粉，李俊霞，等. 菌餅法篩選不同活性物對(duì)棉花黃萎病菌抑制效果研究[J]. 中國棉花，2010，37（8）：16-18.

[14]Stahl D A，F(xiàn)lesher B，Mansfield H R，et al. Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology[J]. Applied and Environmental Microbiology，1988，54（5）：1079-1084.

[15]Yang Q X，Zhang J，Zhu K F，et al. Influence of oxytetracycline on the structure and activity of microbial community in wheat rhizosphere soil[J]. Journal of Environmental Sciences，2009，21（7）：954-959.

[16]Roberts M S，Nakamura L K，Cohan F M. Bacillus[KG*2/3]vallismortis[KG*2/3]sp.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[KH*4D]

[HT8.][ZK（#]nov.，a close relative of Bacillus subtilis，isolated from soil in Death Valley，California[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1996，46（2）：470-475.

[17]Gatson J W，Benz B F，Chandrasekaran C，et al. Bacillus tequilensis sp. nov.，isolated from a 2000-year-old Mexican shaft-tomb，is closely related to Bacillus subtilis[J]. International Journal of [JP2]Systematic and Evolutionary Microbiology，2006，56（7）：1475-1484.[JP]

[18]黃海嬋，裘娟萍. 枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：213-215，219.

[19]Bais H P，F(xiàn)all R，Vivanco J M. Biocontrol subtilis against infection of arabidopsis roots by pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production[J]. Plant Physiology，2004，134（1）：307-319.

[20]Julkowska D，Obuchowski M，Holland I B，et al. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type：critical effects of surfactin and the composition of the medium[J]. Journal of Bacteriology，2005，187（1）：65-76.

[21]朱明妍，劉姣，杜春梅. 芽孢桿菌生物防治植物病害研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（34）：16635-16638.endprint