趙鶴進，宋曉光

（1．河南省鶴壁市人民醫(yī)院，河南 鶴壁 458030；2．河南省鶴壁職業(yè)技術(shù)學院，河南 鶴壁 458030）

論著

兒童碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制及同源性相關(guān)分析

趙鶴進1，宋曉光2

（1．河南省鶴壁市人民醫(yī)院，河南 鶴壁 458030；2．河南省鶴壁職業(yè)技術(shù)學院，河南 鶴壁 458030）

目的：探討兒童碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制及同源性。方法：收集2014年1月－2016年2月從小兒肺炎患者中分離的8株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，采用VITEK-32全自動細菌分析儀進行藥敏分析，改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶，PCR擴增耐藥基因，脈沖場凝膠電泳進行同源性分析。結(jié)果：藥敏試驗結(jié)果顯示菌株對多黏菌素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率較低，分別為0，12.50%和25.00%；對美羅培南、厄他培南、頭孢噻肟、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、環(huán)丙沙星和氨芐西林的耐藥率最高，均為100.00%；改良Hodge試驗顯示8株菌株均為陽性；所有菌株均攜帶blaNDM-1、blaCMY-6或blaDHA-1基因；8株實驗菌分別屬于6個不同克隆。結(jié)論：兒童耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇合理藥物治療，攜帶碳青霉烯酶基因是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗菌藥的原因；耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌存在多個克隆，分布較分散。

碳青霉烯類；肺炎克雷伯菌；耐藥機制；同源性；兒童

小兒肺炎是嬰幼兒多發(fā)疾病之一，也是嬰幼兒死亡的重要原因。肺炎克雷伯菌是本病重要的致病菌，發(fā)病患兒臨床癥狀除了煩躁、拒食、寒戰(zhàn)、腹瀉、咳嗽等一般癥狀外，還出現(xiàn)胸膜、心包受累，引起組織壞死、液化、膿腫等，嚴重影響患兒生命健康[1]。碳青霉烯酶類藥物具有極高的廣譜β-內(nèi)酰胺抗菌能力，對肺炎克雷伯菌具有較高殺菌能力[2]。但隨著抗菌藥的大規(guī)模使用，耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌感染案例日益增多，臨床對這一問題的關(guān)注程度也越高[3]。為探究兒童耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌耐藥機制及同源性，本文收集2014年1月－2016年2月從小兒肺炎患者中分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2014年1月－2016年2月從小兒肺炎患者中分離的菌株，經(jīng)VITEK-32全自動細菌分析儀鑒定為肺炎克雷伯菌，采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）藥敏試驗證實為耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌，共計8株（剔除同一患者相同部位重復分離株），其中痰液5株，血液2株和尿液1株。

1.2 儀器和試劑

VITEK-32型全自動微生物分析儀（Bio-merieux公司）；MG48G型PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；GelDoc EQ型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；PCR實驗過程試劑、電泳用DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 藥敏試驗菌株常規(guī)復蘇后，選用VITEK-32型全自動微生物分析儀進行鑒定，并選用K-B法進行藥敏試驗，同時參照2012年美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）文件中的M100-S22條款進行解讀[4]。

1.3.2 改良Hodge試驗將ATCC25922大腸埃希菌濃度設(shè)置為0.5麥氏單位，并15倍稀釋，而后涂抹于平皿內(nèi)，皿中間貼有10 μg/片美羅培南紙，將樣本菌株由紙邊角向紙張內(nèi)擴散，室溫孵化12 h，美羅培南抑菌圈內(nèi)凹者提示為試驗陽性，即菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.3.3 耐藥基因PCR檢測菌株樣本復蘇后，接至100 μL無菌蒸餾水內(nèi)，離心，將上清轉(zhuǎn)移至玻璃管內(nèi)，冷藏備用。所有分類PCR反應(yīng)體系均相同，20 μL PCR反應(yīng)體系內(nèi)含有正向、反向以及DNA模板，反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共30循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并選用凝膠成像儀進行結(jié)果分析，同時根據(jù)BLAST與GenBank的已知序列進行對比。

1.3.4 脈沖場凝膠電泳將1.5 mL細胞懸濁液滴入試管內(nèi)，對應(yīng)標記名稱，對接種環(huán)進行CSB浸潤，取4.0麥氏單位新鮮培養(yǎng)細菌滴入試管內(nèi)。每管滴入15 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，混勻，56℃水浴，滴入400 μL的1% Seakem Gold瓊脂糖粉，混勻，將混合倒入模具內(nèi)，去除氣泡，室溫下凝固20 min。將5 mL細胞裂解液滴入含25 μL蛋白酶K的試管內(nèi)，混勻備用。削去凝膠多余膠體，保證表面齊整，將膠塊放入含細胞裂解液的試管內(nèi)，保證膠塊至于液體內(nèi)，而不是附著于試管壁，54℃水浴孵化2 h，加入15 mL經(jīng)預(yù)熱的TE（Tris和EDTA混合液），50℃水浴10 min，去掉TE，重復3次，加入150 μL緩沖液H的稀釋液，加入1.5 mL酶切緩沖液，37℃水浴10 min，電泳，參數(shù)為：14℃，6 V/cm，120°角，溴化乙錠染色30 min，紫外線投射凝膠成像觀察結(jié)果[5]。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示：對多黏菌素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率較低，分別為0，12.50%和25.00%；對美羅培南、厄他培南、頭孢噻肟、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢吡肟和頭孢西丁、環(huán)丙沙星、氨芐西林的耐藥率最高，均為100.00%。見表1。

表1 8株分離菌藥敏試驗結(jié)果

2.2 改良Hodge試驗

對8株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌進行改良Hodge試驗，結(jié)果均為陽性，提示產(chǎn)碳青霉烯酶。見圖1。

2.3 耐藥基因檢測

經(jīng)PCR擴增檢測和測序比對確認，1～4號菌株均攜帶blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因，5號菌株攜帶blaNDM-1和blaDHA-1基因，6～7號菌株攜帶blaCMY-6和blaDHA-1基因，8號菌株攜帶blaNDM-1和blaCMY-6基因。見表2，圖2。

2.4 脈沖場凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)脈沖場凝膠電泳結(jié)果，8株共分為A、B、C、D、E和F群，C和D克隆群分別有2株，A、B、E和F克隆群各1株。見圖3。

圖1 部分菌株檢測結(jié)果

表2 耐藥基因檢測

圖2blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖3 8株P(guān)FGE聚類分析結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌是革蘭陰性桿菌，主要存在于人呼吸道及腸道內(nèi)，當人體因各種因素出現(xiàn)抵抗力降低時，肺炎克雷伯菌就會經(jīng)呼吸道進入肺部，并誘發(fā)大葉或小葉融合性實變，最終引發(fā)肺炎等一系列癥狀[6]。及早給予抗菌藥是肺炎克雷伯菌感染治療的核心內(nèi)容，常用的抗菌藥有碳青霉烯類、氨基苷類以及頭孢菌素等。

碳青霉烯類抗菌藥作為廣譜β-內(nèi)酰胺抗菌藥，具有較高的酶穩(wěn)定性，為臨床廣泛應(yīng)用的小兒肺炎治療藥物[7]。在抗菌藥濫用日益嚴重的今天，肺炎克雷伯菌等菌屬對碳青霉烯類抗菌藥耐藥的報道日益增多，并逐年上升[8]。本次研究中藥敏試驗結(jié)果顯示菌株對多黏菌素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率較低，分別為0，12.50%和25.00%；對美羅培南、厄他培南、頭孢噻肟、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、環(huán)丙沙星和氨芐西林的耐藥率最高，均為100.00%，提示在碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌小兒肺炎治療工作中，美羅培南、厄他培南等藥物需謹慎使用，推薦使用多黏菌素。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的多重耐藥特征與其合成的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）以及AmpC β-內(nèi)酰胺酶合成能力有關(guān)，其中ESBLs具有的質(zhì)粒介導能力，對第三、四代頭孢類抗菌藥具有水解能力，而AmpC酶則可水解β-內(nèi)酰胺，這使得碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌具有更為復雜的耐藥表型[9]。本次研究中，改良Hodge試驗顯示8株菌株均為陽性，這也證明肺炎克雷伯菌具有碳青霉烯類耐藥特征。改良Hodge試驗是實驗室標準化協(xié)會（CLIS）公認的碳青霉烯酶表型檢測方式[10]。

已有研究證明，產(chǎn)碳青霉烯酶是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥的重要機制，該酶具有A、D類絲氨酸碳青霉烯酶以及B類金屬β-內(nèi)酰胺酶3種分型，其中A類分型是主要的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥誘因[11]。本次研究中，8株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌攜帶的基因為blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因，這表明blaNDM-1、blaCMY-6或blaDHA-1基因與碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥存在密切相關(guān)。國內(nèi)最早的blaNDM-1基因攜帶耐藥菌為鮑曼不動桿菌，該金屬酶具有較強水解活性，并且其基因編碼位于質(zhì)粒，這使得本基因可在細菌間進行廣泛復制、傳播[12]。blaCMY-6基因是腸桿菌科細菌攜帶的最廣的耐藥基因，在陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌等耐藥菌內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)[13-14]。blaDHA-1基因攜帶菌除具有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的敏感性，并對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥也存在耐藥，如頭霉素類、硫霉素類β-內(nèi)酰胺類抗菌藥[15]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)8株試驗菌分別屬于6個不同克隆，這表明碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制極其復雜，分布較散亂，涉及基因較多，臨床抗感染治療難度面臨巨大挑戰(zhàn)。

本研究通過改良Hodge試驗、耐藥基因PCR檢測以及脈沖場凝膠電泳等試驗對耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌的作用機制及同源性進行初步的分析，研究具有可信性。但已有研究證明耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌具有地區(qū)基因多態(tài)性，這可能是本研究的不足之處，這需要下一步的大范圍菌株研究。

綜上所述，耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌小兒肺炎推薦藥物可選多黏菌素，攜帶碳青霉烯酶基因是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素的原因；耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌存在多個克隆，分布較分散，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果，選擇合理藥物治療。

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本文編輯：魯守琴

Resistance Mechanism and Homology Analysis of Carbapenem Resistant Klebsiella pneumoniae in Children

Zhao He-jin1, Song Xiao-guang2
(1. The People’s Hospital of Hebi City , Henan Province, Henan Hebi 458030,China；2 . Hebi Vocational and Technical College ， Henan Province，Henan Hebi 458030,China)

Objective：To investigate the resistance mechanism and homology of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniaein children.Methods：8 strains of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniawas isolated from children with pneumonia from January 2014 to February 2016, VITEK-32 automatic bacterial analyzer was used for drug sensitivity analysis, modified Hodge assay was used to detect carbapenems and PCR amplification was used to amplify resistance genes, and homology analysis was carried out by pulsed field gel electrophoresis.Results：The drug sensitivity test showed that the resistance rate of the strains to polymyxin, amikacin and gentamicin was 0, 12.50%and 25.00%; the resistant rates of meropenem, ertapenem, cefotaxime, amoxicillin, ceftazidime, cefepime, cefoxitin,ciprofloxacin and mpicillin were highest that all reached 100.00%. The modified Hodge test showed that all 8 strains were positive; all strains carried blaNDM-1, blaCMY-6 or blaDHA-1 gene, and 8 strains belonged to 6 different clones.Conclusion：The carbapenem resistantKlebsiella pneumoniaof children should base on the results of drug sensitivity to use reasonable medication. The carbapenem gene is the cause of carbapenem resistance inKlebsiella pneumonia.There are several clones of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniae, and the distribution is dispersed.

Carbapenemases;Klebsiella pneumoniae; Resistance Mechanism; Homology; Children

R446.5

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.08.001

2017 - 05 - 22

趙鶴進，男，副主任技師。研究方向：微生物免疫專業(yè)。E-mail：383670116@qq.com

宋曉光，男，主管技師（講師）。研究方向：臨床檢驗技術(shù)。E-mail：99320729@qq.com