凌天孝，陳健，薛延豐，周涵君，張曉帆，付仲毅，秦燚鶴，馬靜，韓秋靜，葉協(xié)鋒

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；

2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，南京 210014

肉桂醛對煙草疫霉菌的體外抑制作用

凌天孝1，陳健2，薛延豐2，周涵君1，張曉帆1，付仲毅1，秦燚鶴1，馬靜1，韓秋靜1，葉協(xié)鋒1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；

2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，南京 210014

【目的】為探討肉桂醛對煙草疫霉菌的體外抑制作用?！痉椒ā恳詿煵菀呙咕鸀檠芯繉ο?，研究肉桂醛作用下煙草疫霉菌菌絲的徑向生長和細(xì)胞膜透性，通過菌絲ROS和PI熒光染色，進(jìn)一步測定菌絲丙二醛和甘油含量。【結(jié)果】（1）肉桂醛能夠有效地抑制煙草疫霉菌菌絲的徑向生長和破壞菌絲形態(tài)，抑制菌絲徑向生長的EC50值約為0.93 mmol/L；（2）煙草疫霉菌菌絲ROS和PI熒光染色結(jié)果顯示，經(jīng)肉桂醛處理的菌絲，其活性氧含量增加并出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，并表現(xiàn)出濃度效應(yīng)；（3）隨著肉桂醛處理濃度的升高，煙草疫霉菌菌絲MDA和甘油含量以及細(xì)胞膜透性均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢?！窘Y(jié)論】肉桂醛可能通過增加煙草疫霉菌胞內(nèi)ROS含量，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，刺激丙二醛產(chǎn)生，從而使細(xì)胞膜受損，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡，達(dá)到抑菌效果。

肉桂醛；煙草疫霉菌；活性氧；細(xì)胞膜；抑菌

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一，由煙草疫霉菌引起，該病害發(fā)病率高，分布范圍廣，對煙草具有極強的破壞性[1-3]。據(jù)報道，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達(dá)76373 hm2，產(chǎn)量損失約2.87×107kg，產(chǎn)值損失超過1.23億元人民幣[4]。防治煙草黑脛病已經(jīng)成為我國煙草行業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題。

植物含有豐富的天然抗菌物質(zhì)[5]，這些物質(zhì)不僅與環(huán)境相容性好，有順暢的降解途徑，而且不易使病菌產(chǎn)生抗藥性[6]，已成為當(dāng)下研究熱點。前人研究表明中草藥提取物[7]、大蒜水提物和乙醇浸出物[8]以及桉樹、蘭香和萎葉葉片的提取物[9]對煙草黑脛病菌具有一定的抑制作用。肉桂醛（Cinnamaldehyde）是樟屬植物精油的重要組成部分，具有抗菌活性[10]、抗病毒活性[11]、抗癌活性[12]、抗氧化性和抗炎活性[13-14]等，其藥用價值已被高度認(rèn)可。王帆等[15]采用肉湯稀釋法研究了肉桂醛對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10.0 mmol/L的肉桂醛處理2 h和3 h后，大腸桿菌和綠膿桿菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)完全受到抑制，測得肉桂醛對大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC分別為2.5 mmol/L和5 mmol/L。目前，肉桂醛應(yīng)用于辣椒疫霉菌的研究報道較多，劉麗等[16]通過體外抑制試驗發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠有效地抑制辣椒疫霉菌菌絲的徑向生長和孢子萌發(fā)，并引起孢子內(nèi)ROS含量上升，李麗娜等[17]用肉桂醛處理后的辣椒疫霉菌孢子接種辣椒幼苗，與接種致病性菌株的植株相比，其植株長勢良好，鮮重、葉綠素含量、抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量等指標(biāo)顯著優(yōu)于后者。

本研究應(yīng)用不同濃度肉桂醛處理煙草疫霉菌，探索肉桂醛對菌絲ROS含量及質(zhì)膜透性等方面的影響，確定其抑菌作用，以期為煙草黑脛病的防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

供試菌株：煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院惠贈。

主要試劑：肉桂醛（Cinnamicaldehyde, CA）購于Aladdin公司，純度大于95%，用二甲基亞砜（DMSO）溶解并配制成母液；微量丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物試劑公司；胞內(nèi)甘油含量的測定試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PI熒光染料和ROS熒光染料購于碧云天公司；其他常規(guī)試劑（分析純）均購于中國國藥集團(tuán)。

培養(yǎng)基：利馬豆液體培養(yǎng)基：稱取利馬豆60 g，用蒸餾水沖洗，加入1 L去離子水煮沸30 min，四層紗布過濾，上清液定容至1 L，滅菌后常溫保存。利馬豆固體培養(yǎng)基：每升上清過濾液再加15～20 g瓊脂，滅菌。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 肉桂醛對煙草疫霉菌絲徑向生長的影響

采用固體平板培養(yǎng)法，用打孔器（直徑5 mm）從利馬豆平板上菌落邊緣截取菌餅，將菌絲面接種到含有終濃度為0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、和2.0 mmol/L肉桂醛的利馬豆固體培養(yǎng)基中央，封口、倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3 d。對照平板菌落直徑大于6 cm時，采用十字交叉法測各處理平板的菌落直徑，以0 mmol/L肉桂醛濃度處理為對照，計算肉桂醛對菌絲徑向生長的抑制率。

生長抑制率=[(對照菌落直徑-菌餅直徑)-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]／(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.2 菌絲形態(tài)顯微觀察

從新活化的利馬豆固體培養(yǎng)基（不添加肉桂醛）上的菌落邊緣截取數(shù)塊菌餅（0.5 cm × 0.5 cm），將菌餅轉(zhuǎn)入100 mL利馬豆液體培養(yǎng)基中（每份液體培養(yǎng)基中裝5個菌餅），搖培（28℃，175 rpm）24 h后，向液體培養(yǎng)基中添加肉桂醛，使肉桂醛終濃度分別為0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L。以不加肉桂醛處理作為對照，繼續(xù)搖培（28℃，175 rpm）24 h，然后用雙層紗布過濾菌絲，剔除菌碟，去離子水沖洗3次，即完成菌絲的收集過程。置于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.3 菌絲ROS染色

參照1.2.2的方法收集菌絲，在菌絲中加入2 μmol/L的ROS熒光探針,裝載20 min后，用蒸餾水漂洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)波長535 nm，發(fā)射波長615 nm）。

1.2.4 細(xì)胞膜透性測定

參照1.2.2的方法收集菌絲，稱取0.5 g菌絲于20 mL蒸餾水中攪拌均勻，分別在0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min時測定溶液電導(dǎo)率值，180 min后，將菌絲置于沸水中煮5 min，待冷卻后測定其電導(dǎo)率值，根據(jù)以下公式計算其相對電導(dǎo)率值。

相對電導(dǎo)率（%）=不同時間電導(dǎo)率/最終電導(dǎo)率×100%[18]。

1.2.5 菌絲MDA含量測定

菌絲培養(yǎng)方法參照1.2.2。將菌絲置于預(yù)冷的研缽中，加適量液氮充分研磨，稱0.1 g菌絲粉于2mL離心管中，加入1mL丙二醛提取液，渦旋混勻，5000g離心20 min，取上清液以微量丙二醛（MDA）試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)品，測定待測樣MDA含量。MDA含量（mmol/L）=［（測定OD值-對照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）。

1.2.6 菌絲胞內(nèi)甘油含量測定

采用甘油銅比色法測定菌絲中甘油的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將甘油溶于無菌蒸餾水中配成濃度為0、0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.008、0.01 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液移取上述甘油標(biāo)準(zhǔn)液10 mL于50 mL離心管中，依次加入1 mL 0.05 g/L CuSO4溶液和3.5 mL 0.05 g/mL NaOH溶 液，100 r/min震 蕩12 min，4層擦鏡紙過濾后，測定濾液中甘油銅在630 nm處的吸光度值。以甘油濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌絲甘油含量的測定：采用1.2.2的方法收集菌絲，稱取磨碎后的菌絲0.5 g于50 mL離心管中，加入20 mL無菌水，80℃水浴15 min，8500 r/min離心10 min，取上清液，以無菌水作為參比液，測定630 nm的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算菌絲中甘油的含量。

1.2.7 菌絲PI染色

菌絲培養(yǎng)方法參照1.2.2。在菌絲中加入2 μmol/L的PI熒光探針，染色20 min后，用蒸餾水漂洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)波長535 nm，發(fā)射波長615 nm）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛對煙草疫霉菌絲徑向生長的影響

由圖1可以看出，肉桂醛對煙草疫霉菌絲徑向生長有顯著的抑制作用，并且這種抑制效果呈現(xiàn)濃度效應(yīng)。用0.2 mmol/L肉桂醛處理煙草疫霉菌絲時，其徑向生長開始出現(xiàn)抑制，生長抑制率為9.66%。肉桂醛濃度為0.8 mmol/L時的菌絲生長抑制率為48.91%。肉桂醛濃度增大到2.0 mmol/L時，菌絲基本停止生長，抑制率高達(dá)94.79%。通過線性回歸分析可得，當(dāng)菌絲生長抑制率達(dá)50%時，肉桂醛的濃度為0.93 mmol/L，即EC50值為0.93 mmol/L。

圖1 肉桂醛對煙草疫霉菌絲徑向生長的影響Fig.1 Effect of CA on radial growth ofP.nicotianae

2.2 肉桂醛處理后的煙草疫霉菌絲形態(tài)變化

如圖2所示，與對照相比，經(jīng)肉桂醛處理的煙草疫霉菌菌絲發(fā)生變形，隨肉桂醛濃度增大，菌絲變形嚴(yán)重。肉桂醛濃度為1.2 mmol/L時，菌絲發(fā)生明顯的皺縮、扭曲甚至斷裂。

圖2 肉桂醛對煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effect of CA on morphology ofP.nicotianae

2.3 肉桂醛處理后的煙草疫霉菌絲ROS染色效果

經(jīng)ROS染色后，未經(jīng)肉桂醛處理的對照菌絲僅出現(xiàn)輕微綠色熒光，肉桂醛處理的菌絲有不同程度的染色，其亮度均強于對照，且綠色熒光亮度隨肉桂醛濃度的增大而增強（圖3），表明肉桂醛引起了煙草疫霉菌菌絲體內(nèi)ROS含量增加。

圖3 肉桂醛對煙草疫霉菌絲ROS含量的影響Fig.3 Effect of CA on ROS content ofP.nicotianaemycelial

2.4 肉桂醛對煙草疫霉細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性變化如圖4所示，肉桂醛處理的煙草疫霉菌菌絲溶液的電導(dǎo)率明顯高于對照菌絲，且隨著處理時間的延長和肉桂醛濃度的升高，其電導(dǎo)率呈上升趨勢。未經(jīng)肉桂醛處理的菌絲，其電導(dǎo)率增長速度較慢，在80 min后基本趨于穩(wěn)定，而肉桂醛處理后菌絲電導(dǎo)率的增長速度明顯較快，且在80 min后也有明顯增長。這表明肉桂醛處理后破壞了菌絲細(xì)胞膜的完整性，隨著細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲增多，從而引起細(xì)胞膜透性增大。

圖4 肉桂醛對煙草疫霉菌絲相對導(dǎo)電率的影響Fig.4 Effect of CA on relative conductivity ofP.nicotianaemycelial

2.5 肉桂醛對煙草疫霉菌絲丙二醛（MDA）含量的影響

隨著肉桂醛處理濃度的升高，煙草疫霉菌菌絲MDA含量呈逐漸上升趨勢。肉桂醛處理濃度分別為0.4、0.8、1.2 mmol/L時，菌絲MDA含量分別比對照增加了21.73%、56.07%、77.92%（圖5），說明肉桂醛誘發(fā)了菌絲膜脂損傷。

圖5 肉桂醛對煙草疫霉菌絲丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of CA on MDA content ofP.nicotianae

2.6 肉桂醛對煙草疫霉菌絲甘油含量的影響

當(dāng)真菌受到外界滲透壓力脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會積累甘油來維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡[19]。煙草疫霉菌菌絲甘油含量隨肉桂醛處理濃度升高而增加，肉桂醛濃度分別為0.4、0.8、1.2 mmol/L時，菌絲甘油含量分別為對照的1.94倍、2.59倍和3.39倍，各處理間差異達(dá)顯著水平（圖6）。由此可以推測肉桂醛引發(fā)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡，從而刺激了菌絲細(xì)胞積累甘油，以此維持滲透壓平衡。

圖6 肉桂醛對煙草疫霉菌絲甘油含量的影響Fig.6 Effect of CA on Glycerol content ofP.nicotianae

2.7 肉桂醛處理后的煙草疫霉菌絲PI染色效果

與對照相比，0.4 mmol/L肉桂醛處理的煙草疫霉菌菌絲輕度染色，隨肉桂醛濃度增大，菌絲紅光亮度呈增強趨勢（圖7）。表明肉桂醛能夠破壞煙草疫霉菌菌絲的細(xì)胞膜，誘發(fā)菌絲細(xì)胞凋亡。

圖7 肉桂醛對煙草疫霉菌絲細(xì)胞死亡的影響Fig.7 Effect of CA on cell death ofP.nicotianae

3 討論

大量研究表明肉桂醛具有廣譜抗菌作用[20-24]，它能預(yù)防和治療多種細(xì)菌或真菌引起的疾病。薛延豐等[25]研究指出肉桂醛不僅可以對辣椒苗期灌根進(jìn)行辣椒疫病預(yù)防，還可以有效防治疫病的蔓延。肉桂醛是樟屬植物精油的重要組成部分[26-27]，它對人體無毒或低毒，被美國食品和藥物管理局認(rèn)定為一個安全的食品級化學(xué)品[28-29]。目前有關(guān)植物源化合物抗菌活性方面的研究很多[30-31]，但是抑菌機理研究尚少，且尚無定論。在本研究中，用一定濃度的肉桂醛處理煙草疫霉菌后，其菌絲的徑向生長受到顯著的抑制作用，菌絲形態(tài)發(fā)生明顯的皺縮與扭曲，肉桂醛抑制菌絲徑向生長的EC50值約為0.93 mmol/L。熒光顯微鏡觀察顯示胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞死亡率隨肉桂醛濃度增大而呈現(xiàn)上升趨勢。肉桂醛還可以引起菌絲MDA、甘油含量以及細(xì)胞膜透性增大，且呈濃度效應(yīng)。

ROS可以是細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物，也可由外源性因素產(chǎn)生，易與周圍分子反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷。在真菌代謝中，ROS與真菌程序性死亡有很大的關(guān)系[32]。過量的ROS會刺激MDA大量產(chǎn)生[33]，MDA是生物膜中不飽和脂肪酸分解的一種產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等物質(zhì)交聯(lián)，形成不溶性化合物沉淀，從而造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷[34]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)肉桂醛處理后，煙草疫霉菌菌絲ROS大量積累，MDA含量顯著升高，細(xì)胞膜透性增大，這與戴向榮等[35]的研究結(jié)果一致。我們推測ROS的積累引起了脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞膜透性增大，MDA的產(chǎn)生又進(jìn)一步加劇了膜損傷，菌絲形態(tài)受破壞而發(fā)生皺縮、扭曲，這很有可能引起菌體內(nèi)大分子代謝紊亂、細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抑菌效果。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肉桂醛顯著增加了煙草疫霉菌胞內(nèi)甘油含量。甘油是微生物滲透調(diào)節(jié)的主要因子[36]。在外界環(huán)境的刺激下菌株會激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在菌絲體內(nèi)合成積累甘油等滲透壓穩(wěn)定劑，這將引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞外部的水會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)維持滲透壓平衡，外部水的大量涌入會造成細(xì)胞膨脹，甚至破裂死亡。煙草疫霉菌經(jīng)肉桂醛處理后，胞內(nèi)甘油大量合成并積累，胞內(nèi)膨壓增大，有可能導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞死亡。這進(jìn)一步說明了肉桂醛對煙草疫霉菌菌絲體細(xì)胞膜有一定影響，可引起細(xì)胞膜損傷。

目前的研究普遍認(rèn)為植物源化合物作用于微生物時，主要是通過破壞細(xì)胞膜、增大膜的選擇通透性、降低微生物膜的穩(wěn)定性來達(dá)到抑菌效果的[37-40]。本研究印證了這一點，推測肉桂醛主要通過引起煙草疫霉菌細(xì)胞膜透性增大，加劇膜損傷，造成細(xì)胞死亡從而達(dá)到抑菌效果。而且，本研究從MDA含量（脂質(zhì)過氧化）、甘油含量（膨壓）、電導(dǎo)率（膜透性）等多個方面討論了膜損傷情況，不同指標(biāo)共同驗證了肉桂醛能夠?qū)е戮z膜受損。但目前的研究都只集中在一些表面的生理現(xiàn)象，肉桂醛抑制煙草疫霉菌的機制尚未清楚。曾有報道指出肉桂醛破壞細(xì)胞質(zhì)膜的抑菌機制可能存在兩個作用靶點：一是質(zhì)膜ATPase活性，另一個是麥角甾醇的生物合成[41]。而煙草疫霉菌屬于卵菌綱疫霉屬真菌，細(xì)胞膜上不含麥角甾醇，故而沒有麥角甾醇合酶。這就表明肉桂醛可能是通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜ATPase的活性來達(dá)到抑菌效果的，但肉桂醛具體的作用靶標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

肉桂醛能夠有效抑制煙草疫霉菌的生長，抑制菌絲徑向生長EC50值約為0.93 mmol/L。肉桂醛可能通過增加胞內(nèi)ROS含量，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，刺激MDA的生成，造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抑菌效果。

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Inhibition effect of cinnamaldehyde againstPhytophthora nicotiance in vitro

LING Tianxiao1, CHEN Jian2, XUE Yanfeng2, ZHOU Hanjun1, ZHANG Xiaofan1, FU Zhongyi1, QIN Yihe1, MA Jing1,
HAN Qiujing1,YE Xiefeng1*
1 Tobacco Science College, Henan Agricultural University, National Tobacco Cultivation and Physiology and Biochemistry Research Centre, Key Laboratory for Tobacco Cultivation of Tobacco Industry, Zhengzhou 450002, China;
2 Institute of Food Quality and Safety, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China

[Purpose]The aim of current study was to explore the inhibitory effects of Cinnamaldehyde (CA) onPhytophthora nicotiance in vitro.[Methods]P.nicotiancewas used in this study.The effects of CA were investigated by measuring mycelial radial growth, mycelia membrane permeability, reactive oxygen species (ROS) and propidium (PI) fl uorescence staining, malondialdehyde (MDA) and glycerol content.[Results](1) CA ef fi ciently inhibited theP.nicotiancemycelial radial growth and destroyed mycelial morphology, with an EC50value of 0.93mmol/L.(2) CA increased mycelial ROS level and cell death incidence in a dose-dependent manner, according to ROS and PI staining results.(3) The concentration increase in CA treatment led to the increment of mycelia membrane permeability and the content of mycelial MDA and glycerol.[Conclusion]CA may exhibit an antifungal effect onP.nicotiancethrough increasing ROS level, inducing lipid peroxidation, stimulating MDA production, damaging the mycelia membrane, and leading to cell death.

cinnamaldehyde;Phytophthora nicotiance; ROS; cell membrane; antifungal

凌天孝，陳健，薛延豐，等.肉桂醛對煙草疫霉菌的體外抑制作用[J].中國煙草學(xué)報，2017, 23（4）

煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室資助項目（30800665），重慶市煙草公司“云煙品牌導(dǎo)向型生態(tài)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)模式構(gòu)建研究與推廣”（NY20140401070010）

凌天孝（1992—），碩士研究生，煙草栽培與生理生化，Tel：0371-63555713，Email：18837103304@163.com

葉協(xié)鋒（1979—），博士，副教授，煙草栽培及土壤保育，Tel：0371-63555713，Email：yexiefeng@163.com

2017-01-05；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-03-14

：LING Tianxiao, CHEN Jian, XUE Yanfeng, et al.Inhibition effect of cinnamaldehyde againstPhytophthora nicotiance in vitro[J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：yexiefeng@163.com