張傳靜，吳 婷，任紅鑫，張玲帆，杜一平

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

研究報告

基于MALDI-TOF MS的串聯(lián)富集策略在磷酸化蛋白組學(xué)中的應(yīng)用

張傳靜，吳 婷*，任紅鑫，張玲帆，杜一平

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

提出一種除鹽-富集串聯(lián)用于磷酸肽富集研究的思路。選用C18柱和鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料進(jìn)行脫鹽實驗，以制備的基于聚合物基體螯合Fe3+的親和色譜材料為富集材料。將直接富集和串聯(lián)策略應(yīng)用到標(biāo)準(zhǔn)品和血清中，研究結(jié)果表明，該富集材料具有高選擇性和高靈敏度(1.6 fmol)，鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料前提下的串聯(lián)策略能明顯降低樣品的復(fù)雜性。相比直接富集方法，能夠提高磷酸化肽的覆蓋率。

脫鹽；固定金屬離子親和色譜；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜；磷酸肽；串聯(lián)富集

蛋白質(zhì)的磷酸化是一個可逆過程，是極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式之一，調(diào)控著很多的生理過程，諸如基因表達(dá)、細(xì)胞的增殖與分裂、新陳代謝以及信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-3]。因此，關(guān)于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究備受關(guān)注。

生物質(zhì)譜技術(shù)具備反映生物信息的能力，現(xiàn)已被廣泛用于蛋白質(zhì)的磷酸化分析。然而，在磷酸化蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物中，磷酸化肽段的含量低，與此同時離子化效率也低。在進(jìn)行質(zhì)譜檢測時，磷酸化肽段的信號會被高豐度的非磷酸化肽段的信號干擾和抑制[4]，甚至無法進(jìn)行檢測。所以，在檢測之前，需從樣品中將磷酸化肽選擇性地分離富集出來。目前，固定金屬離子親和色譜法(IMAC)的操作過程最簡單方便，是磷酸化肽段分離富集中使用最為頻繁的重要技術(shù)之一，其基本原理是利用金屬離子與磷酸肽中的磷酸基團(tuán)之間形成強(qiáng)的螯合作用力，從而實現(xiàn)磷酸肽的分離與富集。IMAC材料主要由色譜基質(zhì)、連接臂和金屬離子組成。傳統(tǒng)的固定Fe3+、Ga3+和Al3+的IMAC材料[5-7]以亞氨基二乙酸和次氮基三乙酸為連接臂，連接臂和金屬離子間的親和作用力較弱，在使用過程中易丟失金屬離子，限制了材料的富集效率。近年來，固定Zr4+和Ti4+的IMAC材料[8-10]基于磷酸肽的磷酸根與金屬離子間牢固的親和作用力實現(xiàn)磷酸肽富集；固定Ce4+的IMAC材料[11]金屬離子固載量豐富且可重復(fù)使用性好，實驗室現(xiàn)有的鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料(Ce-MCM)不僅具備上述優(yōu)點，還具有寬泛的使用范圍，在pH 3.0～11.0下均可使用，在一般的有機(jī)介質(zhì)中也很穩(wěn)定，能夠耐受離心和超聲處理。

一般直接采用IMAC方法來實現(xiàn)磷酸化肽的富集。但由于一些鹽分和污染物的存在，造成加合峰過多形成峰包，給質(zhì)譜分析帶來不便。為解決實際問題，相關(guān)的研究致力于串聯(lián)策略[12]。二維色譜的完美結(jié)合，諸如強(qiáng)陰離子交換-金屬氧化物親和色譜法(SAX-MOAC)[13]、強(qiáng)陽離子交換-固定金屬離子親和色譜法(SCX-IMAC)[14]、固定金屬離子親和色譜-親和作用色譜(IMAC-HILIC)[15]、固定金屬離子親和色譜- C18(IMAC-C18)[16]柱和固定金屬離子親和色譜(IMAC-IMAC)[17]已成為趨勢并在磷酸化肽的識別上表現(xiàn)出各自的特性。

為改善質(zhì)譜檢測結(jié)果[18]，通常需對肽和蛋白樣品進(jìn)行除鹽。本文提出一種除鹽-富集串聯(lián)策略用于研究磷酸化肽的分離富集，分別選用商品化的C18柱和Ce-MCM進(jìn)行除鹽實驗，以制備的一種基于聚合物基體螯合Fe3+的IMAC材料為富集材料。綜合比較了兩者的除鹽能力以及串聯(lián)之后富集磷酸化肽的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

真空掃描電子顯微鏡(SEM，型號：HITACHI-S3400N)，傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，型號：6700)，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(AB SCIEX 4800 plus MALDI-TOF/TOF MS)。美國Millipore公司Milli-Q(Millipore，Bedford，MA)水處理系統(tǒng)。

甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、2，2′-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、三氟乙酸(TFA，99%)購自阿拉丁試劑有限公司。乙氧化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(SR454)、α-酪蛋白(α-Casein)、β-酪蛋白(β-Casein)、牛血清白蛋白(BSA)、2，5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、二硫蘇糖醇(DTT，99%)、碘代乙酰胺(IAA，99%)、亞氨基二乙酸(IDA)和乙腈(ACN，高效液相色譜級別)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。無水碳酸鈉、六水合氯化鐵、氯化鈉、濃氨水和碳酸氫銨購自國藥控股有限公司。人血清為100例健康人血清混合樣品，樣品存儲于-80 ℃冰箱待用。實驗用水由Milli-Q水處理系統(tǒng)處理。

1.2 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的制備

GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA的合成流程如圖1所示。

圖1 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的制備示意圖Fig.1 Synthesis of GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA material

粉末狀GMA-co-SR454材料的合成：稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯1.9 g，乙氧化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯2.9 g，2，2′-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)0.12 g，置于10 mL離心管中。移取環(huán)己醇6.234 mL和甲醇1.517 mL于上述離心管中，使用渦旋振蕩器加速固體完全溶解。轉(zhuǎn)移上述溶液于8 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，用波長為365 nm的便攜式紫外燈照射10 min，促使自由基聚合反應(yīng)發(fā)生。聚合反應(yīng)完成后，關(guān)閉紫外燈，分別用甲醇和超純水洗去致孔劑和未反應(yīng)完的單體，得到整體柱材料。將所合成的整體柱材料通過研磨、篩分后，獲得一定大小的粉末狀GMA-co-SR454材料。

GMA-co-SR454-IDA材料的合成：根據(jù)已有報道[19]，對GMA-co-SR454材料進(jìn)行羧基改性。將1.5 g上述合成的粉末狀GMA-co-SR454材料置于100 mL圓底燒瓶中，加入0.50 g 20 mL IDA 的碳酸鈉溶液(pH 10.0)，再加入0.25 g氯化鈉，置于75 ℃水浴中，攪拌反應(yīng)6 h。之后離心，棄去上清液，將材料用超純水洗至中性。

GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的合成：根據(jù)方法[8]，對GMA-co-SR454-IDA材料固定金屬離子。取適量的上述材料于100 mL圓底燒瓶中，隨后加入40 mL 50 mmol/L的三氯化鐵溶液，常溫下攪拌反應(yīng)3 h。減壓抽濾，用超純水洗至中性，自然環(huán)境下晾干，即得粉末狀的GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶解及人血清樣品制備

1）部分街道名稱標(biāo)注不清。如創(chuàng)新街和創(chuàng)業(yè)街，兩條街的地理位置接近，老百姓極易混淆。個別街道名稱后來經(jīng)過更名，而更名后的街道名稱反而給老百姓帶來記憶上的混亂。如北宮街的其中一段在2014年更名為通亭街，新、老北宮街沒有實現(xiàn)實際的對接，給老百姓出行帶來一定困擾。

稱取1.00 mg 標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)(α-/β-酪蛋白)，溶解于500 μL 25 mmol/L碳酸氫銨溶液(pH 8.2)，按照酶與蛋白質(zhì)量比1∶50的比例加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解18 h。

稱取2.00 mg牛血清白蛋白，溶于1 mL含8 mol/L尿素和50 mmol/L碳酸氫銨(pH 8.3)的溶液中，加入20 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇，于60 ℃孵育1 h。隨后加入7.20 mg碘代乙酰胺，置于室溫和暗室的環(huán)境下烷基化反應(yīng)45 min，用50 mmol/L碳酸氫銨(pH 8.3)溶液稀釋10倍。按照酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37 ℃酶解18 h。酶解結(jié)束后，分裝凍干，存儲于-20 ℃冰箱備用。

對于人血清，收集血液樣品5 mL于室溫下凝結(jié)1 h，離心，保留上清液并分裝，存儲于-20 ℃冰箱備用。

1.4 樣品脫鹽處理

C18柱除鹽步驟比較成熟，可參考已有文獻(xiàn)[20]。而Ce-MCM脫鹽的流程如下：首先用60% ACN/1.0% TFA體系將樣品稀釋至所需濃度，加入0.10 mg Ce-MCM，室溫下振蕩10 min。離心，移去上清液，用50% ACN/0.1% TFA體系清洗殘留物3次，將殘留在材料表面的鹽分、干擾物或結(jié)合不牢固的肽段清洗下來。最后，使用5%(體積分?jǐn)?shù))NH3·H2O作為洗脫液，將結(jié)合在材料上的肽段洗脫下來，待用。

1.5 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料分離富集磷酸肽

將樣品溶液用上樣液(80% ACN/0.1% TFA或1.0% TFA)稀釋至所需濃度，加入0.50 mg GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料，室溫下振蕩30 min。于8 000 r/min下離心5 min，棄去上清液。依次用上樣液和80% ACN溶液進(jìn)行清洗，前者洗2次，后者洗1次。加入10 μL 15% NH3·H2O洗脫2次，收集洗脫液，待用。

取0.5 μL洗脫液點覆于不銹鋼靶板的圓點處，室溫自然揮干，再將0.5 μL DHB基質(zhì)溶液點覆在樣品表面，室溫下自然揮干；將制備好的樣品送入MALDI-TOF MS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的合成與表征

圖1為GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA的合成過程。首先，GMA單體在交聯(lián)劑和紫外光的共同作用下，發(fā)生聚合反應(yīng)，制備出GMA-co-SR454整體柱材料。其次，整體柱材料上的環(huán)氧基與IDA發(fā)生親電取代反應(yīng)而開環(huán)，生成GMA-co-SR454-IDA材料。最后，通過Fe3+與雜原子氧之間的螯合作用，而成功將Fe3+固載在材料上。

采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析GMA與SR454的聚合情況以及亞氨基二乙酸與該聚合物的反應(yīng)情況(圖2)。如圖2a所示，908 cm-1處的峰對應(yīng)于GMA中環(huán)氧基的對稱伸縮振動，說明聚合反應(yīng)生成了GMA-co-SR454。圖2b中3 425 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于締合的O—H的伸縮振動，1 129 cm-1處的峰對應(yīng)于C—OH的伸縮振動，608 cm-1處的峰對應(yīng)于締合狀態(tài)的醇類中O—H的面外變形振動，說明亞氨基二乙酸接到GMA-co-SR454聚合物上，從而使環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)。

掃描電鏡圖(圖3)顯示，GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA呈堆積的球形結(jié)構(gòu)，直徑約為100 nm。

圖2 GMA-co-SR454(a)與GMA-co-SR454-IDA(b)的傅立葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of GMA-co-SR454(a) and GMA-co-SR454-IDA(b)

圖3 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的掃描電鏡圖Fig.3 SEM image of GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA material

2.2 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料用于標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)酶解液中磷酸化肽的富集

為考察GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對磷酸化肽段的富集性能，首先使用磷酸化的β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(通常含有α-酪蛋白)的酶解液進(jìn)行評價。如圖4A所示，直接分析時，僅能檢測到2條弱信號強(qiáng)度和低信噪比的目標(biāo)肽段，這是由于磷酸化肽的豐度低、離子化效率低，以及高豐度的非磷酸化肽對磷酸化肽有強(qiáng)烈的信號抑制作用。然而，經(jīng)GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料富集后(圖4B)，非磷酸化肽段的質(zhì)譜峰幾乎消失，檢測到4條高信號強(qiáng)度和高信噪比β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段以及4條低信號強(qiáng)度的α-酪蛋白中的磷酸化肽段。其中有一系列特征性的片段，如丟失磷酸基團(tuán)的肽段，信號強(qiáng)度比較可觀。另外，評估了該材料對α-酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集能力，成功捕捉到21條目標(biāo)肽段。以上富集到的目標(biāo)肽段的詳細(xì)信息見表1。

圖4 直接分析β-酪蛋白酶解液(A)以及經(jīng)GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-casein direct analysis(A) and after enrichment with GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA(B)the phosphopeptides and their dephosphorylated fragments of the metastable losses of phosphoric acid were marked with β and -nH3PO4,respectively

為進(jìn)一步評價GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的富集選擇性，將該材料用于β-酪蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液的混合體系。當(dāng)兩者的摩爾比為1∶10時，在未富集之前有2條信號強(qiáng)度很低的磷酸化肽段，非磷酸化肽段的峰占主導(dǎo)位置。而經(jīng)該材料富集后，在洗脫液中檢測到4條β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段。即使將兩者的摩爾比降至1∶500，該材料仍能高效地富集到3條目標(biāo)肽段。

2.3 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集靈敏度

將GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料分別用于富集不同稀釋濃度的β-酪蛋白酶解液。結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS可以檢測出4 fmolβ-酪蛋白酶解液中的4條磷酸化肽；當(dāng)β-酪蛋白酶解液的濃度降低至1.6 fmol時，質(zhì)譜圖上有β1和β5峰，β5峰的強(qiáng)度隨蛋白酶解液濃度的降低發(fā)生規(guī)律性地變化。由于在β-酪蛋白酶解液的濃度降于1.6 fmol的情況下，質(zhì)譜儀未檢測到任何峰。因此，當(dāng)選用β5峰來定義檢出限時，GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對磷酸化肽的檢出限為1.6 fmol。優(yōu)于文獻(xiàn)[18-19]中其他IMAC材料的檢出限(如chitosan-GMA-IDA-Fe3+為5 fmol，NPs poly(AGE/DVB)-Fe3+wafer為2 fmol)。

圖5 直接分析β-酪蛋白酶解液(A)，經(jīng)C18吸附材料除鹽后(B)，以及經(jīng)Ce-MCM除鹽后(C)的質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-caseinA.no desalting;B.desalted by C18;C.desalted by Ce-MCM;NPP:non-phosphopeptide(非磷酸肽);PP:phosphopeptide(磷酸肽)

2.4直接IMAC富集與串聯(lián)策略分離富集比較

為考察除鹽效果，首先檢測了脫鹽后的酶解液。如圖5A所示，直接分析β-酪蛋白的酶解液時，由于碳酸氫銨的干擾，僅能檢測到10條肽段。而經(jīng)過除鹽后，得到的質(zhì)譜圖有明顯改善，肽段的數(shù)目及信號強(qiáng)度有所增加(圖5B、C)。通過比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Ce-MCM除鹽后，質(zhì)譜儀能檢測出20條肽段數(shù)，其中磷酸化肽段有9條；而經(jīng)C18柱處理后的質(zhì)譜結(jié)果是15條肽段中有4條磷酸化肽段。這是由于Ce-MCM是一種IMAC材料，在使用的ACN/TFA體系下，對特定的肽段沒有選擇性，能保留更多的肽段，在堿性條件下，保留的肽段能被有效地洗脫下來；而C18吸附材料易使一些親水性的肽段丟失或者在鹽濃度高的情況下，作用效率低。由此可知，Ce-MCM的除鹽效果更為理想。

另外，將串聯(lián)策略分離富集的質(zhì)譜圖與直接富集的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)C18柱和Ce-MCM的脫鹽對富集產(chǎn)生不同影響。如圖6所示，前者(圖A)使磷酸化肽的數(shù)目及信號強(qiáng)度減弱。后者(圖B)卻恰恰相反，單磷酸化肽段(β1，β4)的峰明顯增強(qiáng)，1條新的單磷酸化肽段(β3)被富集到，而在多磷酸化肽段中，β5肽段減弱，β2肽段幾乎不見。

為進(jìn)一步說明問題，將串聯(lián)策略應(yīng)用到α-酪蛋白酶解液中。如圖7所示，相比直接IMAC富集，Ce-MCM/IMAC(圖7A)能捕捉到更多的目標(biāo)肽段(24條)，并且有不同的目標(biāo)肽段。而C18/IMAC(圖7B)表現(xiàn)效果不佳。通過比較圖7A與圖7B發(fā)現(xiàn)，圖7A中，單磷酸化肽段的峰如α3、α4、α6、α7、α10、α11從無到有，而且峰α8的信號強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。但在一些多磷酸肽段的峰中，峰α21、α23、α25、α27、α29減弱，峰α18、α24、α26、α30消失不見。這些現(xiàn)象歸因于脫鹽材料各自不同的特性，Ce-MCM是一種金屬螯合親和色譜材料，在60% ACN/1.0% TFA上樣液體系下，非磷酸化肽和磷酸化肽在材料上產(chǎn)生共吸附，保留的肽段經(jīng)5% NH3·H2O洗脫液洗脫后，其質(zhì)譜響應(yīng)信號明顯改善，此外，Ce-MCM上的鈰(Ⅳ)金屬離子對磷酸酯鍵的水解作用[21]，使一些多磷酸肽的含量降低，甚至使含量不高的多磷酸肽達(dá)不到質(zhì)譜檢測時需求的濃度。而C18吸附材料是反相色譜材料，易造成一些親水性的肽段如磷酸肽的丟失[22]。綜上可知，Ce-MCM/IMAC串聯(lián)策略中的Ce-MCM的親和色譜性質(zhì)有利于磷酸化肽數(shù)目的增加。以上富集到的目標(biāo)肽段的詳細(xì)信息見表1。

圖6 β-酪蛋白酶解液經(jīng)C18/IMAC富集后(A)，經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-casein after enrichment by C18/IMAC(A) and Ce-MCM/IMAC(B)-nHPO3 ：the metastable losses of metaphosphoric acid(-nHPO3為脫亞磷酸基團(tuán)肽段)

圖7 α-酪蛋白酶解液經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(A)，以及經(jīng)C18/IMAC富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.7 MALDI-TOF MS of tryptic digest of α-casein after enrichment by Ce-MCM/IMAC(A) and C18/IMAC(B) *multi-phosphopeptides(多磷酸肽)

表1 直接IMAC方法和串聯(lián)策略從α-/β-酪蛋白酶解液中富集到的磷酸化肽段的磷酸化位點及序列Table 1 Phosphorylation sites and the sequence of identified peptides in tryptic digest of α-/β-casein enriched by direct IMAC and tandem desalting/IMAC

a:phosphorylated residue,b:oxidation on methionine,c:pyroglutamylation on the N-terminal

圖8 正常人的血清經(jīng)IMAC材料富集后(A)，經(jīng)C18/IMAC富集后(B)以及經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(C)的質(zhì)譜圖Fig.8 MALDI-TOF MS of the diluted human serum sample after enrichment with direct IMAC(A)，with C18/IMAC(B) and with Ce-MCM/IMAC(C)F：phosphopeptides；-nHPO3 ：dephosphorylated fragments of the metastable losses of metaphosphoric acid

以健康人血清為實際樣品，Ce-MCM/IMAC(圖8C)能捕捉到與直接IMAC方法(圖8A)等同的4條目標(biāo)肽段(1 389.5，1 460.5，1 545.6，1 616.6)，此外還檢測到多余的峰，即去亞磷酸基團(tuán)的峰，這是鈰(Ⅳ)離子催化磷酸酯鍵發(fā)生水解作用的結(jié)果。但在C18/IMAC(圖8B)的情況下，僅能富集到3條目標(biāo)肽段，并且肽段F2和F3的峰強(qiáng)相對變?nèi)酢?/p>

3 結(jié) 論

制備了基于聚合物的GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA富集材料，并提出除鹽-富集串聯(lián)策略。通過考察標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品，發(fā)現(xiàn)該材料能選擇性地富集到β-酪蛋白酶解液中的4條目標(biāo)肽段和血清中的4條目標(biāo)肽段，檢出限達(dá)1.6 fmol。另外，Ce-MCM/IMAC串聯(lián)的結(jié)果優(yōu)于C18/IMAC和直接IMAC富集，能顯著降低樣品的復(fù)雜性和增加磷酸化肽的富集數(shù)目，方法重現(xiàn)性好。因此，該串聯(lián)富集策略可為增加磷酸化肽的覆蓋率提供一種新思路。

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Application of Tandem Enrichment Strategy by MALDI-TOF MS in Phosphorylated Proteomics

ZHANG Chuan-jing,WU Ting*,REN Hong-xin,ZHANG Ling-fan,DU Yi-ping

(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

A scheme was presented for the tandem purification of phosphopeptide using desalting prior to immobilized metal ion affinity chromatography(IMAC).Both C18tip and the cerium(Ⅳ)-modified chitosan material(Ce-MCM) were used in the desalting experiments.GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA was synthesized,and used as an excellent phosphopetides enrichment material.They were applied to selectively capture the phosphopeptides in standards and human serum.Results demonstrated that C18/IMAC and Ce-MCM/IMAC have different performances because of their hydrophobic or hydrophilic properties.Ce-MCM/IMAC tandem strategy notably decreased the complexity of peptides,and yielded a far greater coverage for phosphopeptides than single IMAC.

desalting; IMAC; matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS); phosphopeptides; tandem enrichment

O657.7；O657.63

：A

：1004-4957(2017)09-1061-08

2017-03-19；

：2017-05-20

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2015IK201)

*

：吳 婷，博士，高級工程師，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)，Tel:021-64252107，E-mail:wu_ting@ecust.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.001