曹 禹，鄒凱南，黃江平，馬 克，平 原

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海200083；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200438；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海200083）

·論 著·

基于Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)的人mtDNA全測序分析

曹 禹1，2，鄒凱南1，黃江平1，馬 克3，平 原1

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海200083；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200438；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海200083）

目的 應(yīng)用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)對人線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）全序列進(jìn)行分析檢測，研究不同組織間mtDNA序列差異情況。 方法 通過法醫(yī)尸體檢驗采集6名無關(guān)個體的組織樣本，包括胸腔血液、頭發(fā)、肋軟骨、指甲、骨骼肌和口腔上皮。使用4對引物對線粒體全序列進(jìn)行擴增，應(yīng)用Ion ShearTMPlus Reagents試劑盒和Ion Plus Fragment Library試劑盒等構(gòu)建文庫，并在Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)上進(jìn)行線粒體基因組全序列測序，并針對異質(zhì)性位點和在HVⅠ區(qū)域突變位點，進(jìn)行Sanger測序驗證。 結(jié)果 所有樣本的全基因組mtDNA都擴增成功，6名無關(guān)個體分屬于6種不同的單倍型，同一個體不同組織之間mtDNA存在異質(zhì)性差異。異質(zhì)性位點和HVⅠ區(qū)域突變位點采用Sanger測序結(jié)果均得到驗證。通過Kappa統(tǒng)計方法進(jìn)行一致性檢驗后發(fā)現(xiàn)，相同個體不同組織的mtDNA序列檢驗結(jié)果仍具有較好的一致性。 結(jié)論 本研究所采用的人線粒體基因組全序列的測序檢驗方法，可以檢測出同一個體不同組織間mtDNA的異質(zhì)性差異，該差異具有較高的一致性，該結(jié)果對mtDNA在法庭科學(xué)中的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA，線粒體；遺傳異質(zhì)性；Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)；高通量核苷酸序列分析

人類線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）檢驗在法醫(yī)生物學(xué)領(lǐng)域可為母系關(guān)系、同母異父半同胞關(guān)系、姨-外甥關(guān)系、舅-外甥關(guān)系、外祖母-外孫女關(guān)系等特殊親緣鑒定案件提供遺傳信息，亦可用于陳舊降解的骨、牙、毛干等檢材的身份信息識別[1，2]。在以往的研究[3]中，對mtDNA的研究僅局限于占序列全長7%的控制區(qū)域，限制了mtDNA在法庭科學(xué)中的應(yīng)用。同時，mtDNA異質(zhì)性（heteroplasmy）的存在[4，5]，也加大了mtDNA的分析難度，給結(jié)果判定帶來不確定性。為了更好地闡明mtDNA序列在同一個體不同組織之間的差異性，本研究采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)，通過檢測人類線粒體基因組全序列，研究不同組織間mtDNA序列的差異情況，進(jìn)一步提升mtDNA在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的價值。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

在征求家屬同意基礎(chǔ)上，通過尸體檢驗采集6名無關(guān)個體的組織樣本，由于本實驗取樣的6具尸體大部分涉及傷害致死案件，胸腔內(nèi)器官均有破損情況，故采集胸腔積血作為血液樣本，其他檢材為頭發(fā)、肋軟骨、指甲、骨骼肌、口腔上皮，每類檢材取1份。

1.2 DNA提取

應(yīng)用EZ1 DNA Investigator試劑盒（德國QIAGEN公司）在BioRobot EZ1工作站（德國QIAGEN公司）上提取基因組DNA，操作按照說明書進(jìn)行。用Qubit? 2.0熒光計（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行DNA定量。

1.3 PCR擴增

根據(jù)線粒體基因組全序列設(shè)計4對引物，引物序列如表1所示。

在DNA模板中分別加入上述4對不同引物，采用KOD FX Neo擴增酶（日本TOYOBO公司）分別進(jìn)行擴增，反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)體系如下：引物（5μmol/L）各0.5μL，2×緩沖液12.5μL，dNTP 2μL，DNA模板5 ng，擴增聚合酶0.5μL，加水補齊至25μL。反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性2 min；94℃10 s，60℃30 s，68℃5 min，32個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 用于線粒體基因組全序列擴增的4對引物序列

1.4 文庫構(gòu)建

PCR產(chǎn)物純化后采用Qubit?dsDNA HS Assay試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）用Qubit? 2.0熒光計進(jìn)行定量檢測，根據(jù)結(jié)果將單個樣本的4段擴增產(chǎn)物等量混合。用Ion ShearTMPlus Reagents試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），37℃溫浴9 min將PCR產(chǎn)物酶切成200 bp左右片段；采用Ion Plus Fragment Library試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）和Ion Xpress Barcode Adapter試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），對酶切后的PCR產(chǎn)物兩端分別連接有標(biāo)簽序列的接頭（Barcode，約40 bp）和公用接頭（P1 adapter，約40 bp）構(gòu)建文庫；通過E-Gel SizeSelect 2%Agarose（美國Thermo Fisher Scientific公司）凝膠電泳回收300 bp左右文庫片段（200 bp左右的酶切產(chǎn)物加上Barcode和P1 adapter）?；厥蘸蟮腄NA片段加入測序通用擴增引物進(jìn)行擴增富集，磁珠純化后用Qubit?dsDNA HS Assay試劑盒定量。

1.5 模板制備和測序

The Smiths need a car garage twice larger than this one.（史密斯夫婦需要一個比這個大兩倍的車庫。）

乳化PCR：根據(jù)本次實驗?zāi)繕?biāo)片段為200 bp，因此采用Ion PGM Template OT2 200試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）在Ion OneTouchTM2系統(tǒng)上進(jìn)行乳化PCR（emulsion PCR，emPCR），將反應(yīng)文庫與測序微珠連接，反應(yīng)完成后通過Ion OneTouchTM富集系統(tǒng)進(jìn)行微珠富集，同時去除未連接文庫的空微珠。根據(jù)測序通量選擇相應(yīng)的Ion Torrent芯片：Ion 316 V2（美國Thermo Fisher Scientific公司），采用Ion PGMTMSequencing Solutions 200試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）按照產(chǎn)品說明書配制測序體系，利用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)進(jìn)行測序反應(yīng)，共500個測序循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)配套的Torrent Suite v4.2.1軟件對電信號進(jìn)行捕獲和轉(zhuǎn)換，并結(jié)合Variant Caller 4.2和Integrative Genomics Viewer（IGV）軟件對測序結(jié)果進(jìn)行初步分析，參照標(biāo)準(zhǔn)為修訂的劍橋參考序列（revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，NC_012920.1）[6]，得到整體數(shù)據(jù)量、變異信息、平均測序深度和參考序列匹配程度等數(shù)據(jù)。根據(jù)ZHOU等[7]的報道，將本研究線粒體全基因組序列中異質(zhì)性位點的堿基百分比定在15%至85%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗將6名無關(guān)個體各組織樣本的線粒體全序列各堿基位置出現(xiàn)的異質(zhì)性位點情況進(jìn)行歸一化處理，并進(jìn)行兩兩比較，通過SPSS 19.0軟件對其進(jìn)行Kappa值計算。

1.8 Sanger測序驗證

針對高通量測序過程中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性位點和部分突變位點，采用Sanger測序法進(jìn)行驗證。測序反應(yīng)體系及反應(yīng)條件遵照BigDye?Terminator v3.1 Cycle Sequencing試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）的說明書進(jìn)行，PCR產(chǎn)物使用3130xl基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié) 果

本研究采用Torrent PGMTM測序系統(tǒng)對6塊Ion 316 V2芯片進(jìn)行了測序，所有樣本的mtDNA全基因組都擴增成功。以其中一張芯片的結(jié)果為例（圖1），芯片中有效區(qū)域達(dá)78%，其中文庫連接率為100%。除去44%的多克隆、5%的低質(zhì)量文庫和0%的測試片段，最終的有效文庫為53%，共2.6×106個讀取片段，片段平均讀長為216 bp。產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)總量為488 Mb。

2.2 測序結(jié)果遺傳學(xué)分析

本研究通過對6名無關(guān)個體的胸腔血液、頭發(fā)、肋軟骨、指甲、骨骼肌、口腔上皮進(jìn)行線粒體基因組全測序，并與rCRS（NC_012920.1）進(jìn)行比對，記錄出現(xiàn)不同堿基的位置及堿基類型。6名無關(guān)個體分屬于6種不同的單倍型，在88個位點檢測到堿基序列突變，序列變異包括堿基轉(zhuǎn)換和顛換，其中85個位點發(fā)生了轉(zhuǎn)換，占96.59%；發(fā)生顛換的位點共有3個，分別是13524（A→C）、5178（C→A）、3209（A→T），占3.41%。88個突變位點中，21個位于高變區(qū)（23.86%），67個位于編碼區(qū)（76.14%）。此外，在測序結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了缺失和插入的現(xiàn)象，缺失主要是523～524d（缺失2 bp）、nt8281～8289d（缺失9 bp），插入發(fā)生在311～319 poly C區(qū)域，多了一個胞嘧啶，記為319.1C。

在對同一個體不同組織全測序結(jié)果的比較中發(fā)現(xiàn)，突變、缺失、插入的情況是一致的，僅在組織間異質(zhì)性方面有差異，各組織間異質(zhì)性位點位置及其所在區(qū)域情況見表2～3。測序結(jié)果表明，在HVⅠ區(qū)域內(nèi)線粒體異質(zhì)性位點出現(xiàn)較集中，包括16092、16189、16261這幾個位點，其中16092位點異質(zhì)性在1號、3號、5號個體中均有檢測到。在6個個體中，并沒有在HVⅡ區(qū)域中發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性位點。在編碼區(qū)，異質(zhì)性位點的出現(xiàn)比較分散。通過Kappa值計算，各組織樣本兩兩比較Kappa值均大于0.6，說明同一個體不同組織間異質(zhì)性差異不明顯（表4）。

圖1 Ion Torrent PGMTM測序結(jié)果

表2 6名無關(guān)個體各組織間線粒體測序異質(zhì)性位點分布情況

表3 線粒體測序異質(zhì)性位點所在區(qū)域統(tǒng)計結(jié)果

表4 6名無關(guān)個體各組織樣本歸一化后Kappa值

2.3 Sanger測序驗證

本實驗采用Sanger測序法對高通量測序過程中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性位點以及HVⅠ區(qū)域突變位點進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果均與采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)檢測得到的結(jié)果一致。驗證引物序列見表5。以1號樣本各組織間線粒體12242異質(zhì)性位點為例（圖2），紅色箭頭所指為用Sanger測序法檢測出的異質(zhì)性位點，黑色箭頭所指的括號內(nèi)數(shù)字代表采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)檢測到各堿基的具體reads數(shù)，相比Sanger測序法，采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)對異質(zhì)性位點的檢測更為準(zhǔn)確。

表5 異質(zhì)性位點以及HVⅠ區(qū)域突變位點Sanger測序驗證引物序列

表5 （續(xù)）

圖2 1號樣本各組織間線粒體12242號異質(zhì)性位點的Ion Torrent PGMTM測序和Sanger測序結(jié)果

3 討 論

人類mtDNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)（控制區(qū)）組成，全長為16 569 bp，目前對mtDNA序列的研究往往局限在控制區(qū)，mtDNA控制區(qū)占mtDNA全序列的7%，國內(nèi)外主要采用DNA序列分析方法對這兩個高變區(qū)進(jìn)行分型，建立了基于高變區(qū)序列的mtDNA數(shù)據(jù)庫[8，9]。然而MARUYAMA等[10]對日本人群進(jìn)行mtDNA序列分析后發(fā)現(xiàn)，高變區(qū)的隨機匹配概率僅為0.86%。這就意味著僅僅依靠高變區(qū)難以將兩個無關(guān)個體進(jìn)行區(qū)分?；诟咄繙y序技術(shù)的mtDNA全基因組測序技術(shù)，可以獲得更多的線粒體遺傳信息[11]。本研究通過對6名無關(guān)個體的組織樣本進(jìn)行線粒體基因組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有21個突變位點位于高變區(qū)，67個突變位點位于編碼區(qū)，相比以往僅在控制區(qū)進(jìn)行測序，采用Ion Torrent PGMTM測序系統(tǒng)可以額外提供多達(dá)319%的堿基變異信息，可幫助識別控制區(qū)測序檢驗無法鑒別的樣本，從而提高了mtDNA的個體識別能力。在針對同一個體不同組織全測序結(jié)果的比較中發(fā)現(xiàn)，序列突變、缺失、插入的情況是一致的，僅在異質(zhì)性的位點分布和異質(zhì)性堿基百分比上略有區(qū)別。為了更好地反映組織間異質(zhì)性差異情況，本實驗選用Kappa統(tǒng)計方法，Kappa值是用來評價一致性程度的指標(biāo)[12]，本實驗用其評價各組織樣本線粒體全測序結(jié)果的一致性。通過Kappa統(tǒng)計方法對其進(jìn)行一致性檢驗后發(fā)現(xiàn)，Kappa值均大于0.6，說明同一個體不同組織間異質(zhì)性差異不明顯，表明同一個體不同組織間線粒體序列檢驗結(jié)果仍具有較好的一致性，這為今后檢案中檢材的選取提供了一定的參考。

mtDNA的異質(zhì)性是影響法醫(yī)線粒體分析系統(tǒng)效能的因素之一[13]。目前對異質(zhì)性的出現(xiàn)及其形成原因、匹配判斷標(biāo)準(zhǔn)、法醫(yī)學(xué)意義都未統(tǒng)一，相關(guān)報道[14-16]表明，mtDNA異質(zhì)性的存在對于線粒體基因相關(guān)的疾病、衰老、進(jìn)化和法醫(yī)鑒定等方面有著重要的影響和意義，精確檢測mtDNA突變和極低水平的mtDNA異質(zhì)性極為重要。有文獻(xiàn)[17]報道，高通量測序技術(shù)能夠檢測到低至0.1%的突變，這就要求在日常mtDNA檢驗鑒定時檢材取樣應(yīng)避免組織間的相互污染，盡可能取同一組織進(jìn)行鑒定，此外在實驗時要注意以下幾點：（1）進(jìn)行線粒體全基因組擴增時，選用高保真的擴增酶，減少擴增錯配；（2）加大測序的深度，通過增加測序深度能夠更加準(zhǔn)確地反映位點的異質(zhì)性情況；（3）改進(jìn)測序數(shù)據(jù)的判讀和分析方法，從而使結(jié)果更加精確，減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；（4）隨著高通量測序技術(shù)在法醫(yī)物證學(xué)方面的應(yīng)用，可以將同一樣品在不同平臺間進(jìn)行測序驗證，這樣既確保樣品測序的準(zhǔn)確性又能獲得大量的生物信息。

就目前而言，高通量測序技術(shù)在法醫(yī)mtDNA全基因組測序中的應(yīng)用時間并不長，mtDNA異質(zhì)性位點的判定尚未有公認(rèn)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，本研究也是根據(jù)ZHOU等[7]的報道來劃定異質(zhì)性位點。受樣本收集的限制，本研究樣本量較小，今后仍需要大量的研究工作以闡明異質(zhì)性位點在體內(nèi)的水平和組織分布規(guī)律、發(fā)生頻率、不同組織不同年齡段的人群異質(zhì)性的特點，作出更科學(xué)的評估，拓展mtDNA在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

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Whole Genome Sequencing of Human mtDNA Based on Ion Torrent PGMTMPlatform

CAO Yu1,2,ZOU Kai-nan1,HUANG Jiang-ping1,MA Ke3,PING Yuan1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083,China;2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200438,China;3.Shanghai Research Institute of Criminal Science and Technology,Shanghai 200083,China）

Objective To analyze and detect the whole genome sequence of human mitochondrial DNA（mtDNA）by Ion Torrent PGMTMplatform and to study the differences of mtDNA sequence in different tissues.Methods Samples were collected from 6 unrelated individuals by forensic postmortem examination,including chest blood,hair,costicartilage,nail,skeletal muscle and oral epithelium.Amplification of whole genome sequence of mtDNA was performed by 4 pairs of primer.Libraries were constructed with Ion ShearTMPlus Reagents kit and Ion Plus Fragment Library kit.Whole genome sequencing of mtDNA was performed using Ion Torrent PGMTMplatform.Sanger sequencing was used to determine the heteroplasmy positions and the mutation positions on HVⅠregion.Results The whole genome sequence of mtDNA from all samples were amplified successfully.Six unrelated individuals belonged to 6 different haplotypes.Different tissues in one individual had heteroplasmy difference.The heteroplasmy positions and the mutation positions on HVⅠregion were verified by Sanger sequencing.After a consistency check by the Kappa method,it was found that the results of mtDNA sequence had a high consistency in different tissues.Conclusion The testing method used in present study for sequencing the whole genome sequence of human mtDNA can detectthe heteroplasmy difference in different tissues,which have good consistency. The results provide guidance for the further applications of mtDNA in forensic science.

forensic genetics;DNA,mitochondrial;genetic heterogeneity;Ion Torrent PGMTMsequencing system;high-throughput nucleotide sequencing

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.007

1004-5619（2017）04-0368-06

2016-10-09）

（本文編輯：張素華）

法醫(yī)現(xiàn)場物證快速性別判斷及DNA信息綜合獲取資助項目（14JG0500400）

曹禹（1984—），男，碩士研究生，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證檢驗鑒定；E-mail：e1195850@163.com

平原，男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：pingyuan803@gmail.com