王遲早，文少卿，石美森，俞雪兒，萬雪嬌，潘伊凌，張?jiān)骑w，李 輝，譚婧澤

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438；2.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100088；3.上?？萍拣^自然史研究中心，上海200127）

淮海戰(zhàn)役士兵遺骸的Y染色體遺傳類型鑒定

王遲早1，文少卿1，石美森2，俞雪兒1，萬雪嬌3，潘伊凌3，張?jiān)骑w3，李 輝1，譚婧澤1

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438；2.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100088；3.上?？萍拣^自然史研究中心，上海200127）

目的 鑒定淮海戰(zhàn)役士兵遺骸的Y染色體遺傳類型，為尋找其父系親屬提供線索。 方法 采用古DNA的方法提取遺骸DNA，使用Yfiler試劑盒進(jìn)行17個(gè)Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增，推測(cè)樣本的單倍群，并根據(jù)最新Y染色體譜系樹挑選Y-SNP位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)分型，再基于Y-SNP和Y-STR數(shù)據(jù)進(jìn)行共享單倍型分析，獲得與遺骸遺傳關(guān)系最近的現(xiàn)代個(gè)體信息。 結(jié)果8份男性樣本中的17個(gè)Y-STR基因座總共觀察到8種Y-STR單倍型，進(jìn)一步Y(jié)-SNP分析得出6種Y-SNP單倍群，分別是O2a1-M95+、O1a1-P203+、O3*-M122+/M234-、D1-M15+、C3*-ST和R1a1-M17+。 結(jié)論 本次對(duì)淮海戰(zhàn)役士兵遺骸進(jìn)行的Y染色體遺傳類型鑒定對(duì)于推斷陳年檢材的地理來源具有一定的借鑒價(jià)值。

法醫(yī)遺傳學(xué)；Y染色體；軍事人員；個(gè)體識(shí)別；淮海戰(zhàn)役

淮海戰(zhàn)役是著名的三大戰(zhàn)役之一，其勝利使長江中下游以北的廣大地區(qū)獲得解放，為解放軍渡江作戰(zhàn)奠定了基礎(chǔ)，加快了全國解放的進(jìn)程。在淮海戰(zhàn)役中人民解放軍共70多萬人參戰(zhàn)，僅華東野戰(zhàn)軍就傷亡10.5萬人[1]。近年來，我國政府逐步加大了國內(nèi)外戰(zhàn)爭(zhēng)（如二戰(zhàn)和朝鮮戰(zhàn)爭(zhēng)等）的遺骸搜尋和鑒定工作，旨在將烈士遺骨統(tǒng)一安葬，給予應(yīng)有的尊重，并逐步完善對(duì)傷亡士兵及其親屬的撫恤體系。

根據(jù)人體遺骸的保存情況，法醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)的個(gè)體識(shí)別方法有人臉識(shí)別、掌形識(shí)別、虹膜識(shí)別、文身和傷疤鑒定、指紋圖譜[2]、牙齒形態(tài)及咬痕鑒定[3，4]、骨骼形態(tài)識(shí)別[5]等。然而，在缺乏記錄和難以辨認(rèn)體表特征（如腐敗、爆炸、火災(zāi)導(dǎo)致體表特征喪失，僅存少量骨骼）的情況下，分子鑒定愈發(fā)顯示出傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)手段難以超越的優(yōu)勢(shì)[6]。如在2001年“9·11”恐怖襲擊之后，技術(shù)人員通過提取牙髓中的DNA，為最終確定遇難者的身份做出了重要的貢獻(xiàn)[7]。另外，分子鑒定在陳年檢材的個(gè)體識(shí)別方面也取得了卓越的成就，如法國國王路易十六[8]、拿破侖[9]、俄國羅曼諾夫朝沙皇[10]、英王理查三世[11]、曹操叔祖父曹鼎[12]等遺骸的身份判定。

本研究檢測(cè)的8份淮海戰(zhàn)役士兵遺?。ㄑ例X）均來自上海科技館（原上海自然博物館）。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到了一些困難：（1）由于樣本年代較久，埋葬環(huán)境比較復(fù)雜，常規(guī)方法提取DNA效果較差；（2）提取出的DNA伴隨的抑制劑較多，復(fù)合擴(kuò)增時(shí)效果不太理想。針對(duì)上述問題，本實(shí)驗(yàn)將古DNA提取和純化方法引入遺骸DNA處理中，獲得檢驗(yàn)結(jié)果后，運(yùn)用單倍型數(shù)據(jù)推測(cè)樣本的單倍群歸屬，再通過Y-SNP分型確定遺傳類型，以測(cè)試較少的位點(diǎn)達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。此外，由于缺少可供樣本比?duì)的親屬參考數(shù)據(jù)庫，本研究選擇了Y-STR和Y-SNP父系遺傳標(biāo)記體系，期望利用Y染色體譜系，為尋找這些烈士的父系親屬提供線索。

1 材料與方法

1.1 樣本預(yù)處理

取8份牙齒樣本［分別來自8份淮海戰(zhàn)役士兵遺骸，上海科技館（原上海自然博物館）］，分別編號(hào)為xz55、xz56、xz100、xz121、xz122、xz143、xz144、xz154，用手術(shù)刀片刮凈牙齒表面，浸泡于5%NaClO溶液15 min，70%乙醇溶液沖洗一遍。將樣本置于超凈臺(tái)，紫外照射30 min，晾干。

1.2 DNA提取

用6750冷凍研磨機(jī)（美國SPEX公司）粉碎樣品，參照硅膠法提取DNA[13，14]。每個(gè)樣品稱取粉末200 mg，與10 mL提取液（0.45 mol/L EDTA，0.25 mg/mL蛋白酶K，pH=8.0）混合于50 mL離心管中，密封37℃150 r/min振搖過夜（16～24 h）；5 000×g離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的50 mL離心管，加入40 mL結(jié)合緩沖液（5 mol/L GuSCN，25 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris）和100μL硅膠，濃鹽酸調(diào)pH值至4.0，避光室溫150 r/min震搖2～3 h；5 000×g離心2 min，棄上清液；1 mL結(jié)合緩沖液洗滌1次，1 mL洗滌液（50%乙醇溶液，125 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）洗滌3次，自然干燥，溶于100μL溶解液（10 mmol/L Tris，pH=8.0），16 000×g離心2 min，吸取上清液80μL。

1.3 DNA純化

針對(duì)質(zhì)量較差的樣本［Nanodrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定DNA濃度低于5 ng/μL，D260/D280低于1.6］[15]，使用QIAquick PCR純化試劑盒（德國QIAGEN公司）對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。每個(gè)樣品均進(jìn)行兩次獨(dú)立DNA提取。

1.4 DNA擴(kuò)增

1.4.1 Y-STR擴(kuò)增

采用Yfiler試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對(duì)8例樣本的17個(gè)Y-STR基因座（DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、GATA H4、DYS385a/b）進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后在3730基因分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper?ID 3.1軟件對(duì)電泳產(chǎn)物進(jìn)行分析比對(duì)。

1.4.2 Y-SNP擴(kuò)增

參考最新的Y染色體譜系樹[16，17]，挑選出包含21個(gè)SNP位點(diǎn)的5個(gè)檢板（panel）。每個(gè)樣本的實(shí)際檢測(cè)位點(diǎn)將依據(jù)單倍型推測(cè)的結(jié)果，結(jié)合譜系樹的拓?fù)潢P(guān)系，選取最少的測(cè)試集合。5個(gè)檢板為：（1）核心檢板，M145、P143、L15、M214、M45；（2）單倍群O檢板，M175、M268、PK4、M95、M119、P203、M122、KL1；（3）單倍群C檢板，M130、M217、P2613、F1396；（4）單倍群D檢板，M174、M15；（5）單倍群R檢板，M207、M17。基因分型采用SNaPshot（美國Thermo Fisher Scientific公司，SNaPshot?多重試劑盒）和熒光引物PCR相結(jié)合的方法，PCR產(chǎn)物純化后在3730基因分析儀上分析。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和防止污染，均設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 單倍群預(yù)測(cè)

使用Vadim Urasin’s YPredictor（http://predictor. ydna.ru/）、Whit Atheys’Haplogroup Predictor（http:// www.hprg.com/hapest5/）以及本實(shí)驗(yàn)Y染色體數(shù)據(jù)庫（每個(gè)個(gè)體同時(shí)包含Y-STR和Y-SNP信息）對(duì)8例樣本進(jìn)行單倍群預(yù)測(cè)。Vadim Urasin’s YPredictor的預(yù)測(cè)基于遺傳標(biāo)記數(shù)值、突變速率、上游位點(diǎn)突變時(shí)間的差異；Whit Atheys’Haplogroup Predictor的預(yù)測(cè)基于遺傳距離和貝葉斯等位基因頻率的方法[18]。本實(shí)驗(yàn)室的Y染色體數(shù)據(jù)庫[19]包括37 754份Y-SNP（YSTR）數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)原理基于貝葉斯等位基因頻率法。

1.5.2 共享單倍型分析

利用Y染色體單倍型參考數(shù)據(jù)庫（Y chromosome Haplotype Reference Database，YHRD）尋找與淮海戰(zhàn)役士兵遺骸共享單倍型的個(gè)體，并通過本實(shí)驗(yàn)室Y染色體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行共享單倍型分析。該數(shù)據(jù)庫采取兩步對(duì)比程序：第一步，檢索相同單倍型；第二步，檢索所有三步突變以內(nèi)的單倍型。

2 結(jié) 果

2.1 單倍群推測(cè)和實(shí)驗(yàn)確認(rèn)

8份遺骸的Y-STR數(shù)據(jù)見表1所示，共檢測(cè)出8種Y-STR單倍型。其中兩個(gè)樣本檢測(cè)出的等位基因較少，樣本xz122檢測(cè)出7個(gè)、xz143檢測(cè)出8個(gè)，且DNA純化后效果仍不理想，其余樣本檢測(cè)到的YSTR基因座數(shù)量為10～15。

分別使用Vadim Urasin’s YPredictor、Whit Atheys’Haplogroup Predictor以及本實(shí)驗(yàn)室Y染色體數(shù)據(jù)庫對(duì)樣本的單倍型類型進(jìn)行預(yù)測(cè)，并根據(jù)每種單倍群內(nèi)部的拓?fù)潢P(guān)系和核心檢板的分型情況，挑選2～4個(gè)微檢板標(biāo)記對(duì)每個(gè)樣本做進(jìn)一步的分型測(cè)試，確定8個(gè)樣本分別屬于4種Y染色體遺傳類型，即單倍群C（C3*-ST）、D（D1-M15+）、O（O1a1-P203+、O2a1-M95+、O3*-M122+，M234-）和R（R1a1-M17+），結(jié)果見表2。

表1 淮海戰(zhàn)役士兵遺骸Y-STR數(shù)據(jù)集

表2 淮海戰(zhàn)役遺骸樣本的單倍群預(yù)測(cè)及SNaPshot分型情況

2.2 共享單倍型分析

利用YHRD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行共享單倍型分析，進(jìn)一步在本實(shí)驗(yàn)室自有的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合最新的Y染色體譜系樹[16，17]構(gòu)建了譜系樹。圖1顯示只含本次鑒定中各個(gè)樣本遺傳譜系的簡化樹，以及最終推測(cè)所檢驗(yàn)的牙齒樣本來源地。

圖1 本研究相關(guān)的Y染色體譜系簡化樹及共享單倍群分析

3 討 論

Y染色體上存在SNP和STR兩種重要的遺傳標(biāo)記。Y-SNP突變率低，不易受重組和回復(fù)突變影響，可反映人類歷史上的單一突變事件且可鑒別Y染色體較久遠(yuǎn)的譜系關(guān)系，用于辨別遺傳背景或某一地域中Y染色體的單倍群，反映群體歷史[16，20，21]。Y-STR是Y染色體上另一類重要的遺傳標(biāo)記，較高的突變率可以填補(bǔ)Y-SNP留下的空缺，用以繪制進(jìn)化的網(wǎng)絡(luò)圖及計(jì)算Y-SNP的產(chǎn)生時(shí)間等，故適合于研究短期進(jìn)化事件和較近人群之間的遺傳關(guān)系[22，23]。將Y-SNP與Y-STR信息相結(jié)合，通過不同單倍群在不同民族中的頻率分布和組合就可能找到各個(gè)民族特有的遺傳標(biāo)記，提示各現(xiàn)代人群間或多或少的血緣交流[24-27]，并推斷未知DNA的來源和地理分布。近年來，本實(shí)驗(yàn)室將Y染色體DNA檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用到多種科學(xué)問題的探索中，如研究不同族群的遺傳結(jié)構(gòu)[28]、建立東亞人群的遺傳歷史[29]、鑒定歷史名人的遺傳家系等[12，30]。

本實(shí)驗(yàn)室建立了一套基于Y染色體分子鑒定技術(shù)的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別新方法，本次成功地將該法運(yùn)用于淮海戰(zhàn)役士兵遺骸的鑒定。近期，該方法也被應(yīng)用于中國赴緬遠(yuǎn)征軍的遺骨鑒定，為尋找遺骨的父系親屬提供了重要線索[31]。在本次研究中，由于遺骸在未知環(huán)境中保存了60多年，一些樣本的DNA提取效果并不理想。我們參照古DNA提取的方法，增加了DNA純化的步驟，提高了樣本檢測(cè)效率。

本研究檢測(cè)了8份淮海戰(zhàn)役士兵遺骸的Y染色體遺傳類型，獲得了8種Y-STR類型和6個(gè)主要的遺傳類型，分別是O2a1-M95+、O1a1-P203+、O3*-M122+、M234-、D1-M15+、C3*-ST、R1a1-M17+。其中xz55、xz121、xz144三個(gè)樣本屬于單倍群O2a1-M95+。O2a1-M95+是O2下的主要支系，在華南、南方少數(shù)民族、中南半島及印度門噠人群中分布較多[32]，為南亞語系諸族群的優(yōu)勢(shì)單倍群。樣本xz100屬于單倍群O1a1-P203+，這是一個(gè)在中國東南沿海的侗傣和中國臺(tái)灣原住民中高頻出現(xiàn)的類型[33]，為澳泰族群中最為常見的單倍群。樣本xz143屬于單倍群O3*-M122+、M324-。O3單倍群是東亞最為常見的單倍群，在中國漢族中比例高達(dá)50%～60%。單倍群O3*-M122+、M234-在漢族人群中只占1.7%[17]，遠(yuǎn)低于O3下的3大主要支系（O3a1c-002611、O3a2c1-M134和O3a2c1a-M117），且分布比較零散。樣本xz122屬于單倍群D1-M15+，這是一個(gè)在東亞的藏緬、侗傣和苗瑤人群中廣泛分布的類型[28]，在東亞的各個(gè)人群中也有著低頻分布。樣本xz56屬于單倍群C3*-ST，這是一個(gè)從西伯利亞到里海廣泛分布的遺傳類型，在蒙古和西伯利亞人群中有著高頻分布，由于其擴(kuò)張年代較為晚近，有些研究認(rèn)為該支系與蒙古擴(kuò)張有關(guān)[34]。樣本xz154屬于單倍群R1a1-M17+，這一類型主要存在于歐洲及俄羅斯，尤其是東歐[35]，在我國西北也有一定分布。研究者認(rèn)為該類型與印歐語人群相關(guān)，融入東亞的時(shí)間較為晚近[36]。

我們發(fā)現(xiàn)基于西方歐亞人群的Whit Atheys’Haplogroup Predictor準(zhǔn)確性較差，數(shù)據(jù)集Vadim Urasin’s YPredictor的預(yù)測(cè)結(jié)果可以接受，本實(shí)驗(yàn)室基于東亞人群的數(shù)據(jù)庫效果最好。由此可見，數(shù)據(jù)庫所采用的數(shù)據(jù)來源在單倍型預(yù)測(cè)中起著至關(guān)重要的作用。

在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別鑒定中，直系親屬的遺傳信息非常重要。由于缺乏親屬信息數(shù)據(jù)庫，我們采用基于Y-SNP和Y-STR共享單倍型的分析，預(yù)測(cè)這些樣本及其親屬的可能來源地?；春?zhàn)役中，人民解放軍參戰(zhàn)部隊(duì)主要是華東野戰(zhàn)軍和中原野戰(zhàn)軍，華東野戰(zhàn)軍由原山東野戰(zhàn)軍和華中野戰(zhàn)軍合編而成[37]，中原野戰(zhàn)軍是以抗日戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期的晉冀魯豫邊區(qū)八路軍為基礎(chǔ)逐步發(fā)展起來的[38]。我們的推測(cè)結(jié)果和實(shí)際的兵源地相比，來自西北和華南地區(qū)的數(shù)據(jù)可能有所高估，原因在于本次檢測(cè)的樣本容量較小，存在一定的抽樣誤差。

近期，本實(shí)驗(yàn)室將建立一個(gè)整合烈士及其現(xiàn)代親屬DNA信息的網(wǎng)站，為烈士親屬尋找親人遺骸提供技術(shù)支持。

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Identification of Y-chromosomal Genetic Types for the Soldier’s Remains from Huaihai Campaign

WANG Chi-zao1,WEN Shao-qing1,SHI Mei-sen2,YU Xue-er1,WAN Xue-jiao3,PAN Yi-ling3,ZHANG Yun-fei3,LI Hui1,TAN Jing-ze1
（1.MOE Key Laboratory of Contemporary Anthropology,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200438,China;2.Key Laboratory of Evidence Law and Forensic Science,Ministry of Education,China University of Political Science and Law,Beijing 100088,China;3.Natural History Research Center,Shanghai Science and Technology Museum,Shanghai 200127,China）

Objective To identify the Y-chromosomal genetic types for the soldier’s remains from Huaihai Campaign,and to offer a clue for search of their paternal relatives.Methods DNA of the remains were extracted by the ancient DNA extraction method.Yfiler kit was used for the multiplex amplification of 17 Y-STR loci.The haplogroups of the samples were speculated.Detailed genotyping of the selected Y-SNP was performed based on the latest Y-chromosome phylogenetic tree.Haplotype-sharing analysis was done based on the data of Y-SNP and Y-STR,the closest modern individual information to the genetic relationship of remains was gained.Results A total of 8 Y-STR haplotypes were observed on 17 Y-STR loci of 8 male individuals.Furthermore,6 Y-SNP haplogroups were identified,which were O2a1-M95+,O1a1-P203+,O3*-M122+/M234-,D1-M15+,C3*-ST and R1a1-M17+.Conclusion Identification of Y-chromosomal genetic types for the soldier’s remains from Huaihai Campaign shows a reference value on inferring the geographical origins of old materials.

forensic genetics;Y chromosome;military personnel;personal identification;Huaihai Campaign

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.005

1004-5619（2017）04-0357-06

2016-03-18）

（本文編輯：李 莉）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31222030，31371266）；教育部科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（113022A）；曙光計(jì)劃資助項(xiàng)目（14SG05）；復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（SKLGE-1401）；中國科學(xué)院計(jì)算生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目

王遲早（1990—），女，碩士研究生，主要從事分子人類學(xué)研究；E-mail：wangchizao@126.com

李輝，男，教授，主要從事分子人類學(xué)研究；E-mail：LHCA@fudan.edu.cn

通信作者：譚婧澤，女，副教授，主要從事體質(zhì)人類學(xué)研究；E-mail：jztan@fudan.edu.cn