陳 慶，白 潔，張文芳

（北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192）

應用iTRAQ-LC-MS/MS方法篩選大鼠DAI后腦組織差異表達蛋白質

陳 慶，白 潔，張文芳

（北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192）

目的 應用相對和絕對定量同位素標記結合液相色譜-串聯質譜法（isobaric tag for relative and absolute quantification-liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，iTRAQ-LC-MS/MS）篩選SD大鼠彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）后腦組織差異表達的蛋白質，尋找診斷DAI的潛在生物標志物。 方法 參照Marmarou法建立DAI動物模型，分為空白對照組（n=4）、假打擊組（n=4）和打擊致死組（n=4），采用iTRAQ-LC-MS/MS技術對大鼠腦組織蛋白質進行檢測，并對檢測結果進行生物信息學分析及驗證，篩選出差異表達的蛋白質。 結果 定量檢測出2 016種蛋白質，生物信息學分析顯示其在細胞中分布廣泛、功能多樣，并且參與了多種生物過程，16種蛋白質在打擊致死組具有差異表達，包括1種表達上調蛋白質和15種下調蛋白質；Western印跡法驗證了iTRAQ-LC-MS/MS的結果。 結論iTRAQ-LC-MS/MS的檢測技術篩選出大鼠DAI后腦組織中多個差異表達的蛋白質，不僅為深入探討DAI后軸索損傷的發(fā)病機制提供了研究方向，也為DAI的診斷提供了潛在生物標志物。

法醫(yī)病理學；蛋白質組學；彌漫性軸索損傷；同位素標記；串聯質譜法；色譜法，反相；大鼠

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）是指頭部遭受外力作用后發(fā)生加（減）速運動所造成的彌漫性分布于腦白質、以軸索損傷為主要改變的一種原發(fā)性腦實質損傷[1]，具有高植物狀態(tài)生存率、高死亡率的損傷特點。由于目前DAI的具體發(fā)病機制不詳，單純依據臨床癥狀、體征和影像學結果，漏診率和假陽性率較高，病理診斷中DAI的特征性改變軸索收縮球（axomal retraction ball，ARB）難以早期形成[2]，同時，已知的生物分子標志物存在特異性不高的缺陷[3]。因此，深入研究DAI中軸索損傷的機制，尋找診斷DAI的生物標志物，早期、準確診斷DAI是當前臨床醫(yī)學和法醫(yī)學研究的難點和重點[3]。

相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是近年來發(fā)展的一項新的體外同位素標記技術，該技術可以對1個基因組表達的全部蛋白質或1個復雜的混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定；同時，也可以尋找多個組間差異表達的蛋白質，篩選潛在分子標志物并分析其功能。該技術已在尋找疾病潛在生物標志物、探索病理生理機制等醫(yī)學領域中得到了極其廣泛的應用[4，5]。本研究利用iTRAQ結合LC-MS/MS（iTRAQLC-MS/MS）的檢測技術，通過對大鼠DAI后死亡組和對照組腦組織的蛋白質表達譜進行比較分析，篩選出差異表達的蛋白質，尋找診斷DAI的潛在生物標志物，為進一步研究軸索損傷的病理生理機制、臨床治療及法醫(yī)學鑒定提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年雄性SD大鼠（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供）38只，體質量250～350 g。

1.2 主要試劑與儀器

20%硝酸銀、0.2%氯化金及連苯三酚（成都市科龍化工試劑廠），胰蛋白酶（美國Promega公司），iTRAQ試劑盒（美國AB SCIEX公司），蛋白質濃度測定試劑盒（美國BIO-RAD公司）；Triple TOF?5600+系統(tǒng)、ProteinPilot 4.0軟件（美國AB SCIEX公司），Image Lab軟件（美國BIO-RAD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 DAI模型的建立

參照Marmarou法[6]建立DAI動物模型。隨機抽取30只SD大鼠，用10%水合氯醛溶液以0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，生效后除去頭頂部毛發(fā)，碘附消毒，沿中線切開頭皮、分離骨膜，將打擊墊片（直徑10 mm、厚3 mm）粘于顱頂的冠狀縫與人字縫之間的中央部，再將大鼠俯臥位固定于致傷裝置的海綿床上，然后將450 g重錘（正對打擊墊片中央）提升至1.5 m高度后放松懸線，使重錘自由下落、打擊大鼠頭頂部的墊片，然后立即撤離海綿床，防止重錘二次打擊，檢查打擊后SD大鼠是否有顱骨骨折，如存在則剔除該大鼠，隨后取出墊片，消毒、縫合手術切口，常規(guī)進食進水。

SD大鼠在打擊后即刻出現昏迷；6只SD大鼠打擊后死亡，死亡率為20%，平均存活時間為（4.80± 1.48）min。24只打擊存活大鼠于打擊3 d后斷頭處死，取出腦組織，置于10%中性甲醛溶液中固定1周后，石蠟包埋，制成5.0μm厚的切片進行嗜銀染色觀察，驗證模型建立成功與否。

1.3.2 實驗分組

打擊后死亡的6只大鼠按照隨機抽樣法抽取4只，為打擊致死組；未打擊的8只大鼠按照隨機抽樣法分為假打擊組與空白對照組；假打擊組4只大鼠給予1.3.1部分同樣的手術和打擊前準備，但不給予打擊；空白對照組4只大鼠不做任何處理。

1.3.3 標本

大鼠打擊死亡后立即取出腦組織，隨機取3只置于無菌無酶凍存管后迅速放入液氮罐中暫時保存，用于iTRAQ-LC-MS/MS檢測；取1只的腦組織置于10%中性甲醛溶液中固定1周后，石蠟包埋，制成5.0μm厚的切片進行嗜銀染色觀察。空白對照組和假打擊組大鼠于相應操作后5 min斷頭處死，取出腦組織，后續(xù)操作同打擊致死組。

1.3.4 嗜銀染色

將切片置入37℃濕盒中，用銀A（20%硝酸銀）涂片2 h，后在還原劑A（連苯三酚100 mg，甲醛10 mL，80%乙醇1 200 mL）中沖洗5 min，蒸餾水沖洗3次后置入銀B（20%硝酸銀5 mL，40%氫氧化鈉200μL，蒸餾水20 mL，氨500μL）中30 s，蒸餾水沖洗后還原劑B液（甲醛5 mL，蒸餾水95 mL）沖洗5 min，蒸餾水沖洗，用0.2%氯化金上色3 min，蒸餾水沖洗，5%硫代硫酸鈉固定5 min，自來水沖洗后脫水、透明、封片。

1.3.5 腦組織蛋白質提取與標記

將凍存的各組大鼠全腦，分別放入研缽中，于冰上迅速碾磨。各組分別提取100 g腦組織勻漿用于iTRAQ-LC-MS/MS檢測。向各組腦組織勻漿中加入預冷的裂解液（0.2%兩性電解質，0.001%溴酚藍，8 mol尿素，4%CHAPS，65 mmol DTT），于4℃條件下，以離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心60 min去除細胞碎片。Bradford法[4]測定各組蛋白質濃度，并提取250 mg蛋白質加入胰蛋白酶消化（50μg/mL），于37℃條件下，孵育過夜。3份上述樣本中分別加入50μL異丙酚后再次離心，條件同上，分別收集管底部的酶解后樣品100μL。取出iTRAQ試劑，恢復至室溫，離心，將iTRAQ試劑內容物甩至管底部；在每份iTRAQ試劑中加入150μL乙醇；在3份上述樣本中加入iTRAQ試劑；室溫下孵育2 h，分別標記為113、114、115。

1.3.6 LC-MS/MS檢測

樣品經反相液相色譜柱（Gemini-NX C18；4.6 mm× 250mm）、納米柱（Acclaim PepMap C18；75μm×150 mm，200μm×0.5 mm）分離，分離條件參照WEI等[7]的方法；質譜鑒定采用Triple TOF?5600+系統(tǒng)，MS掃描范圍為350～1 250 m/z，一個譜圖選擇4個最強的母離子進行串級掃描，MS/MS掃描范圍100～1 500 m/z。

1.3.7 生物信息學分析

所得質譜數據采用ProteinPilot 4.0軟件檢索SwissProt數據庫，以質荷比（m/z）113為對照，篩選條件：置信度大于等于95%，差異倍數大于1.3或小于0.7（P＜0.05），從打擊致死組中篩選出與空白對照組及假打擊組相比有明顯差異的蛋白質。蛋白質注釋和分類使用DAVID[8]，其中選擇基因本體論（Gene ontology，GO）的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白質進行分類。

1.3.8 Western印跡法檢測各組微管相關蛋白1b（Map1b）的表達

每組取30μg蛋白質，加入5×SDS上樣緩沖液煮沸10 min變性；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干式電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。依次滴加兔抗大鼠Map1b一抗（1∶2 000，英國Abcam公司），4℃過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL試劑，暗室中曝光于X線膠片上，顯影、定影。采用Image Lab軟件進行圖像掃描和分析，β-actin作為內參對蛋白質條帶進行校正。

1.4 統(tǒng)計學方法

Western印跡法所得數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 嗜銀染色驗證DAI動物模型成功

大鼠致傷3 d后軸索腫脹、扭曲、斷裂，可見ARB形成；打擊致死組軸索腫脹、扭曲、斷裂，未見典型ARB形成；空白對照組與假打擊組軸索走行自然、光滑，粗細基本均勻，排列緊密（圖1）。說明本方法制作的DAI模型建立成功。

2.2 蛋白質譜鑒定及表達差異分析

通過iTRAQ-LC-MS/MS分析，在3組樣品中定量檢測到2 016種蛋白質；以空白對照組進行相對定量，共有16種蛋白質在打擊致死組差異表達，包括1個表達上調蛋白和15個下調蛋白（表1）。其中，代表性差異蛋白質肌酸激酶B型（creatine kinase B-type，Ckb）的二級質譜圖以及肽段的標記定量信息見圖2。

2.3 蛋白質功能聚類分析

通過GO注釋對蛋白質的生物過程、細胞成分和分子功能進行聚類分析，結果顯示所定量檢測的2 016種蛋白質在細胞中分布廣泛、功能多樣，并且參與了多種生物過程（圖3），這提示基于iTRAQ的定量蛋白質組學技術在腦組織中的研究方法是可行的。GO分析發(fā)現，16個差異表達的蛋白質中15個表達下調的蛋白質主要參與了細胞的能量代謝、微管轉運及細胞骨架的組成等過程。

2.4 Western印跡法驗證iTRAQ-LC-MS/MS結果

Western印跡法結果顯示，打擊致死組Map1b的表達量（目的蛋白質條帶與內參的灰度值之比為0.68± 0.12）較空白對照組（1.08±0.03）、假打擊組（1.04± 0.10）降低。經統(tǒng)計學分析，打擊致死組與空白對照組、假打擊組之間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片 嗜銀染色×400

表1 打擊致死組大鼠腦組織中差異表達蛋白質

圖2 代表性差異蛋白質Ckb多肽質譜圖

圖3 iTRAQ-LC-MS/MS定量分析出的2 016種蛋白質的GO分析

3 討 論

DAI作為一種常見的重要的創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI），因其致殘率、植物狀態(tài)生存率和致死率高，診斷困難的特點而日益得到臨床醫(yī)學和法醫(yī)學的重視。目前，CT和常規(guī)MRI等影像學檢查對DAI的診斷能力有限（尤其是損傷早期、輕型損傷和死亡過程迅速的DAI），單純的組織病理學方法也難以早期診斷DAI[3]。目前大多數學者認為，腦震蕩實際上是一種輕型的DAI，其發(fā)生機制與DAI是一致的，只是軸索損傷程度較輕、范圍較小，以軸索腫脹為主[1]。

β淀粉樣前體蛋白質（β-amyloid precursor protein，β-APP）常被認為是DAI早期診斷的重要標志物[9]。β-APP是一種快速順軸漿運輸蛋白質，可在軸索損傷后快速聚集，最早可在傷后0.5 h檢見，但最近研究[3]發(fā)現，在缺血缺氧性腦損傷、創(chuàng)傷性腦水腫、腦疝等亦可引起軸索損傷的疾病或病理改變中，β-APP也會聚集，從而難與DAI相鑒別，因此，應用β-APP診斷DAI時需謹慎以免誤診。其他生物標志物，如相對分子質量為145 000的血影蛋白裂解產物（spectrin breakdown products，SBDP）、tau、髓鞘堿性蛋白質（myelin basic protein，MBP）、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白質（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）、2′，3′環(huán)核苷酸磷酸二酯酶3′（2′，3′-cyclic nucleotide 3′phosphodiesterase，CNPase）、微管相關蛋白質（microtubule-associated protein-2，MAP-2）等在診斷DAI時也存在類似的缺陷[10]。因此，尋找診斷DAI新的生物標志物，客觀準確地早期診斷DAI成為當前臨床醫(yī)學和法醫(yī)學所要解決的難點。

iTRAQ結合液相色譜-串聯質譜技術，因其靈敏度高、分離能力強、高通量、結果可靠等優(yōu)勢，在定量蛋白質組學中得到了廣泛的應用，已成為發(fā)現生物標志物的重要途徑[11]。

本研究采用iTRAQ-LC-MS/MS的檢測技術，通過對大鼠DAI后死亡組和對照組腦組織的蛋白質表達譜進行比較分析，共篩選出16個差異表達的蛋白質，其中Ckb在SD大鼠DAI后死亡組的腦組織中表達明顯升高，另有15個蛋白質表達下調。在16個差異表達的蛋白質中，Aco2、Myh10及Map1b等蛋白質已有相關報道[11]表明與DAI過程中軸索的損傷相關，其結果與本研究一致，這也提示iTRAQ-LC-MS/MS檢測技術在DAI后腦組織中尋找差異蛋白質是可靠的。

本研究同時發(fā)現，15個表達下調的蛋白質主要參與了細胞的能量代謝、微管轉運及細胞骨架的組成等過程，其中Dync1h1、Atp5a1、Hk1、Gapdh、Ckb等蛋白質主要參與能量的代謝，Sptbn2、Map1a、Ina、Tubb5等蛋白質主要參與微管轉運及細胞骨架的組成，這提示DAI后細胞能量的供應不足可能是軸索損傷、斷裂的另一個重要原因。

綜上所述，本研究采用iTRAQ-LC-MS/MS檢測技術，篩選出DAI后腦組織中多個差異表達的蛋白質，不僅為深入探討DAI后軸索損傷的發(fā)病機制提供了新的研究方向，為臨床DAI治療靶點的確定提供了重要參考，同時，也為DAI的診斷提供了潛在生物標志物。

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Screening of Differential Expression Proteins in Rat Brain Tissues after DAI by iTRAQ-LC-MS/MS

CHEN Qing,BAI Jie,ZHANG Wen-fang
（Forensic Medical Examination Center of Beijing Public Security Bureau,Beijing 100192,China）

Objective To screen for the differential expression proteins in brain tissues of SD rat after diffuse axonal injury（DAI）by isobaric tag for relative and absolute quantification-liquid chromatographmass spectrometer/mass spectrometer（iTRAQ-LC-MS/MS）,and to explore potential biomarkers available for the diagnosis of DAI.Methods Animal models of DAI were established with the Marmarou method as reference,and the subjects were divided into blank control group（n=4）,sham strike group（n=4）and fatal strike group（n=4）,respectively.The proteins in rat brain tissues were detected by iTRAQ-LC-MS/MS, and bioinformatics analysis and verification were performed on the results and screened for the differential expression proteins.Results A total of 2 016 proteins were identified and quantified.The bioinformatics analysis revealed that the proteins had wide distribution and function,and participated in different biological processes.There were 16 proteins showed differential expression in fatal strike group,including one up-regulated expression protein and 15 down-regulated expression proteins.The results of iTRAQLC-MS/MS were confirmed by Western blotting method.Conclusion Multiple differential expression proteins in rat brain tissues after DAI can be screened by iTRAQ-LC-MS/MS.This not only indicates a research direction for exploring the pathogenesis of DAI,but also provides potential biomarkers available for the diagnosis of DAI.

forensic pathology;proteomics;diffuse axonal injury;isobaric labeling;tandem mass spectrometry;chromatography,reverse-phase;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.003

1004-5619（2017）04-0348-05

2016-10-08）

（本文編輯：鄒冬華）

陳慶（1976—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理鑒定及研究；E-mail：cq7q7q7q7@163.com