周 雍， 靳曉慧， 李炳曉， 景亞星， 韓 麗， 張利衛(wèi)，2， 魏戰(zhàn)勇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬細(xì)小病毒感染PK-15細(xì)胞后TLRs轉(zhuǎn)錄時(shí)相的變化

周 雍1,2， 靳曉慧1,2， 李炳曉1,2， 景亞星1， 韓 麗1， 張利衛(wèi)1，2， 魏戰(zhàn)勇1,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

研究豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)感染豬腎傳代細(xì)胞(PK-15 cells)后Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)表達(dá)水平變化情況，為探明PPV感染機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)利用熒光定量PCR方法檢測(cè)PPV感染PK-15細(xì)胞后TLR1-10的轉(zhuǎn)錄時(shí)相變化。結(jié)果顯示，PPV感染PK-15細(xì)胞后，TLR1在PPV感染后3h表達(dá)上調(diào)，約為對(duì)照組細(xì)胞的3.1倍，其他時(shí)段均低于正常水平；TLR3和TLR7 mRNA表達(dá)水平在病毒感染早期均低于正常水平；TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表達(dá)上調(diào)，TLR10分別在在3h和36 h表達(dá)上調(diào)，其他時(shí)段均不同程度的降低；而TLR2和TLR9 mRNA表達(dá)水平在感染后24 h開(kāi)始升高，并于48 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞上TLR2和TLR9 在mRNA水平顯著上調(diào),PPV感染可能通過(guò)TLR2和TLR9受體介導(dǎo)感染。

豬細(xì)小病毒；Toll樣受體；PK-15細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄時(shí)相

豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙為主要特征的重要病原體之一，與其他病原混合感染率極高，增強(qiáng)其他病原的感染性，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前，該病在歐洲、美洲、亞洲的多個(gè)國(guó)家均有流行，中國(guó)已先后在北京、上海、吉林、黑龍江、四川和浙江等地分離到該病毒，血清學(xué)調(diào)查陽(yáng)性率為80%[3]。目前對(duì)于其感染致病機(jī)制了解甚少，特別是通過(guò)何種受體介導(dǎo)感染更是不甚了解。Toll樣受體 ( Toll-like receptor, TLR )是TLRs家族的重要成員之一，可以通過(guò)識(shí)別病毒的單鏈RNA(ssRNA)誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)干擾素α(IFN-α)和白細(xì)胞介素12(IL-12)等細(xì)胞因子,對(duì)病毒做出相應(yīng)的免疫應(yīng)答。其中,TLR2識(shí)別范圍較廣， 可識(shí)別大部分現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的病原體相關(guān)分子模式 (Pathogen-Associated Molecular Pattem, PAMP)結(jié)構(gòu),TLR1和TLR6作為輔助受體同TLR2組成異二聚體發(fā)揮作用[4]。TLR3參與對(duì)病毒感染細(xì)胞后復(fù)制產(chǎn)生dsRNA的識(shí)別[5]。TLR4 可識(shí)別病毒的包膜蛋白，促進(jìn)釋放β干擾素( interferon β，IFN-β) 及多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，介導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng)，并參與致病[6]。TLR5主要識(shí)別大多數(shù)桿菌都具有的一個(gè)可溶性因子鞭毛蛋白。TLR7、TLR8主要識(shí)別多種小分子抗病毒化合物以及病毒的ssRNA[7]。TLR9介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌DNA CpG序列的識(shí)別[8]。到目前為止，已有13種TLR被發(fā)現(xiàn)。豬體內(nèi)存在10種TLR，即TLR1～TLRl0，除TLR8外，其余豬TLRs的完整編碼序列都已清晰[9]。Toll樣受體是一個(gè)龐大的I型跨膜受體蛋白家族，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9都是介導(dǎo)病毒免疫的重要受體。LUND等[10]用基因敲除技術(shù)研究TLR9是否介導(dǎo)了HSV-2誘導(dǎo)IFN-II分泌,結(jié)果顯示這個(gè)過(guò)程需要TLR9介導(dǎo)。KURT-JONES等[11]發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒(RSV)的一些融合蛋白能誘生促炎癥細(xì)胞因子,與正常對(duì)照小鼠比較,RSV在TLR4缺陷小鼠中的復(fù)制量更多且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),提示TLR4能促進(jìn)機(jī)體對(duì)病毒的清除。因此，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的TLRs進(jìn)行準(zhǔn)確定量，可更好地了解動(dòng)物機(jī)體通過(guò)免疫應(yīng)答抵抗病毒感染的致病機(jī)制[12]。本試驗(yàn)利用SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)方法，分不同時(shí)間點(diǎn)定量檢測(cè)PPV感染PK-15細(xì)胞后Toll-like受體1～10的mRNA的水平變化[13]，為研究豬細(xì)小病毒的感染機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和依據(jù)，并為預(yù)防和控制豬細(xì)小病毒的感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 豬腎細(xì)胞PK-15(Porcine Kindney-15 cells)細(xì)胞購(gòu)買自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，并由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存；豬細(xì)小病毒李氏毒株，病毒滴度為10-6.5·(0.1 mL)-1，由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī)(Sigma, Germany)； PCR 儀(Thermo, America)；CFX96 Real-Time PCR 儀(Roche, Switzerland)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(SIM, America)； LEICA DMIL 倒置顯微鏡(Leica, Germany)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo, America)。

1.1.3 主要試劑 E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA)；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(康為世紀(jì)公司)；RPMI Medium 1640(Solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio)；DEPC水(Sigma, America)；SYBR?Premix Ex Taq TMII(TaKaRa, Japan)；胎牛血清(Hyclone, America)；瓊脂糖(Promega, America)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.4 工作液配制 10%細(xì)胞培養(yǎng)液：450 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入50 mL的胎牛血清，混勻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%細(xì)胞維持液：196 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入4 mL的胎牛血清，混勻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

D-Hank’s液：NaCl 8 g，葡萄糖1 g，KClO34 g，NaHCO30.35 g，Na2HPO4·12H2O 0.152 g，KH2PO40.06 g，溶于900 mL ddH2O中，定容至1 000 mL，高壓滅菌20～30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1 PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)和PPV病毒的增殖 按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法[14]，用1640培養(yǎng)液加10%胎牛血清作為PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定方可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

傳代培養(yǎng)細(xì)胞，待PK-15細(xì)胞培養(yǎng)至80%時(shí)，加入適量PPV病毒后繼續(xù)置于5% CO2培養(yǎng)箱中吸附，吸附1～3 h后，加2%的細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，待貼壁細(xì)胞80%發(fā)生病變時(shí)，將細(xì)胞瓶置于-20 ℃冰箱冷凍，再于室溫下融化，如此反復(fù)凍融3次細(xì)胞全部脫落，吸至離心管中，離心除去細(xì)胞碎片后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)的測(cè)定 用2%的RPMI-1640培養(yǎng)液在1.5 mL離心管中10倍倍比稀釋PPV病毒液(稀釋度為10-1～10-7)，將稀釋好的病毒接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度各作8個(gè)重復(fù)孔，每孔100 μL，設(shè)一列正常細(xì)胞對(duì)照。逐日觀察細(xì)胞病變并記錄結(jié)果，按照Karber法計(jì)算TCID50。

1.2.3 病毒感染和樣品收集 將PK-15細(xì)胞用胰酶消化后，接種于于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁面積達(dá)到80%以上時(shí)，用D-hank’s洗2次，將PPV接種于PK-15細(xì)胞30 μL(MOI=1)，每孔做2個(gè)重復(fù)，另設(shè)2孔作對(duì)照。將6孔板置于5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后，棄液體，添加1.5 mL 2%的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于感染后0、1、3、6、12、24、36、48、72 h用顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)，之后對(duì)樣品進(jìn)行收集。收集樣品時(shí)吸取上清于EP管；再次加1.5mL 2%細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融2次，吹打均勻，吸入EP管中，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 參照 E.Z.N.A Total RNA KitⅠ說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，具體方法和步驟參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行 ，以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為熒光定量PCR模板。

1.2.5 熒光定量PCR 參照GenBank公布的豬TLR1～TLR10序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(如表1)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物(25 pmol·L-1)各0.35 μL，cDNA (1 000 ng· μL-1) 2 μL，RNsae Free ddH2O 7.3 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s；55 ℃,30 s；72 ℃,30 s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后升溫至95 ℃，10 s，再降至65 ℃持續(xù)60 s，遞增至95 ℃, 1 s，采集熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，于37 ℃,30 s后結(jié)束反應(yīng)。

表1 Real-time PCR引物及其反應(yīng)條件Table 1 Primers and conditions used for Real-time PCR assays

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 在熒光定量PCR中，循環(huán)閾值(Ct)是反映模板中目標(biāo)基因含量的重要指標(biāo)，通過(guò)比較目標(biāo)基因和內(nèi)參基因β-actin，消除樣品收集和加樣操作過(guò)程中的誤差。采用 2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行處理分析，采用Duncan法進(jìn)行檢驗(yàn)差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1PPV感染PK-15后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算TCID50，PPV病毒滴度為10-5.5·mL-1，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)用PPV感染PK-15細(xì)胞(MOI=1)，37 ℃吸附后換維持液，并設(shè)未接毒細(xì)胞對(duì)照。于顯微鏡下記錄細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)(圖1)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)感染PPV后6 h，顯微鏡下未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化；感染24 h后，可以看到明顯的病變；48 h后隨著細(xì)胞的增殖，對(duì)照組細(xì)胞密度增加，逐漸開(kāi)始變圓，感染組細(xì)胞病變達(dá)到60%以上，病變細(xì)胞聚縮成團(tuán)狀，并伴有明顯的多層重疊狀態(tài)，細(xì)胞脫落呈空斑狀；到60 h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞幾乎鋪滿底部，接毒組出現(xiàn)明顯的聚集、裂解等病變現(xiàn)象，細(xì)胞病變區(qū)域達(dá)到100%，并且大面積脫落。

2.2PPV感染PK-15細(xì)胞后TLR1～TLR10的mRNA轉(zhuǎn)錄情況

PPV感染PK-15細(xì)胞后，在0、1、3、6、12、24、36、48、72 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行熒光定量PCR，與β-actin進(jìn)行比較分析，得出不同時(shí)段細(xì)胞內(nèi)TLR1～TLR10的表達(dá)量(圖2)。通過(guò)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)在各時(shí)段感染組和未感染組均有TLR1～TLR10的轉(zhuǎn)錄。其中，TLR1 mRNA水平在PPV感染后3 h約為正常水平的3.1倍，其他時(shí)段均低于正常水平。在病毒感染后12 h時(shí),TLR2 mRNA表達(dá)量開(kāi)始升高，約為對(duì)照組1.8倍，48 h差異達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的10.1倍。TLR3和TLR7 mRNA表達(dá)水平在病毒感染早期均低于正常水平，TLR3在60 h和72 h高于正常水平，TLR7在36 h和72 h高于正常水平。TLR4和TLR8均在3、12、36 h較正常水平發(fā)生上調(diào)，其他時(shí)段mRNA表達(dá)水平低于正常水平。TLR5在感染后1、3、36 h較正常水平上調(diào)，TLR6在病毒感染后3 h達(dá)到峰值，約為正常水平的3.8倍。PPV病毒感染后TLR9 mRNA表達(dá)量在24 h開(kāi)始高于對(duì)照組，于48 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的26.7倍，持續(xù)到72 h均發(fā)生顯著上調(diào)。其中60 h和72 h分別為正常水平的13.4倍、1.25倍。TLR10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在感染后3 h和36 h發(fā)生上調(diào)，其他時(shí)段較正常水平均發(fā)生下調(diào)。

注：A、C和E分別為24、48和60 h的對(duì)照細(xì)胞；B.、D、F分別為PPV感染后24、48和60 h 細(xì)胞。

Note: A, C and E were untreated cell in the post 24, 48 and 60 h, respectively ; B, D and F were PK-15 cells infected with PPV at 24, 48 and 60 h post-infection, respectively.

圖1PPV感染PK-15細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)(×100)
Fig.1CellmorphologyofPK-15cellsinfectedwithPPV(×100)

3 結(jié)論與討論

隨著分子生物學(xué)與病毒學(xué)研究的發(fā)展，人們對(duì)病原微生物的作用機(jī)制有了更深入的了解和認(rèn)識(shí)。TLRs和其他分子識(shí)別受體能夠識(shí)別病原微生物的多種PAMPs，這種識(shí)別機(jī)制使TLRs在先天性免疫和固有免疫中發(fā)揮重要作用，然而由于免疫機(jī)制的復(fù)雜性，人們至今仍然無(wú)法系統(tǒng)揭示天然免疫是如何識(shí)別微生物病原體的，人們也無(wú)法了解天然免疫系統(tǒng)是如何精細(xì)調(diào)控和誘導(dǎo)獲得性免疫的。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，TLRs在病毒感染中發(fā)揮重要作用。徐春利等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染中能夠激活TLRs，并調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答及獲得性免疫應(yīng)答。XU等[17]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和漿樣樹(shù)突細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDCs)上TLR7和TLR9 mRNA表達(dá)量和TLR7蛋白表達(dá)量低于正常人群，而TLR9蛋白表達(dá)量高于正常人群；TLR9蛋白表達(dá)與HBV病毒DNA呈負(fù)相關(guān)，TLR9蛋白表達(dá)與HBV呈正相關(guān)，結(jié)果也表明HBV抑制TLR7和TLR9 mRNA表達(dá)，推測(cè)可能機(jī)體對(duì)HBV表現(xiàn)出免疫耐受和免疫逃逸。

本研究中在PPV感染細(xì)胞后，TLR1、TLR3～ TLR 8和TLR10 mRNA水平在部分時(shí)段發(fā)生上調(diào)，其他時(shí)段均低于正常水平，而TLR2和TLR9在感染后發(fā)生有規(guī)律的顯著上調(diào)。關(guān)于TLR9病毒識(shí)別的研究已報(bào)道許多，研究發(fā)現(xiàn)該過(guò)程與自身免疫性疾病性相關(guān)[18]，但TLR9在PPV病毒的研究中尚未報(bào)道。本研究采用PPV感染PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PPV處理組的細(xì)胞內(nèi)TLR2和TLR9 mRNA的表達(dá)量在處理后前6 h低于正常組細(xì)胞，12 h后TLR2及TLR9的mRNA表達(dá)量顯著高于正常組細(xì)胞；因此后續(xù)試驗(yàn)研究時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)可以集中在6 h及以后。這一研究結(jié)果與張?jiān)氯A等[21]在人細(xì)小病毒的研究結(jié)果一致。根據(jù)本研究可以推測(cè)，在感染前期細(xì)胞表現(xiàn)免疫耐受，隨著細(xì)胞的增殖，PPV病毒得到擴(kuò)增，大量的PPV病毒誘導(dǎo)細(xì)胞TLR2和TLR9 mRNA的顯著上調(diào)；PPV可能通過(guò)上調(diào)TLR2和TLR9的表達(dá)改變機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致PPV持續(xù)感染。王強(qiáng)等[19]采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectious Mononucleosis， IM)，患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)TLR2和TLR9的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IM患者體內(nèi)TLR2和TLR9 mRNA表達(dá)量相對(duì)于正常人顯著上調(diào)，而IM恢復(fù)期TLR2和TLR9的表達(dá)相對(duì)下調(diào)，推測(cè)TLR2與TLR9表達(dá)上調(diào)能夠識(shí)別病原體，引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，TLR9缺陷小鼠的病毒滴度和死亡率較正常小鼠上升，表明TLR9在抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[20]。因此我們推測(cè)，TLR2和TLR9可能能夠識(shí)別PPV病毒，并通過(guò)一定配體活化TLR2和TLR9。試驗(yàn)結(jié)果顯示，TLR2、TLR9可能在豬感染PPV 24 h后發(fā)揮抗病毒作用。

注：星號(hào)表示統(tǒng)計(jì)感染組和對(duì)照組差異顯著，*P<0.05和**P<0.01。

Note: An asterisk indicates a statistically significant difference from infected and control cells, *P<0.05 and **P<0.01.

圖2PPV感染PK-15后TLR1～TLR10mRNA水平表達(dá)情況
Fig.2ThemRNAexpressionofTLR1toTLR10inPK-15cellsafterPPVinfection

[1] XU Y G, CUI L C, WANG H W, et al. Characterization of the capsid proteinVP2 gene of a virulent strain NE/09 of porcine parvovirus isolated in China[J]. Research in Veterinary Science, 2013, 94(2): 219-224.

[2] SHARMA R, SAIKUMAR G. Porcine parvovirus and porcine circovirus 2-associated reproductive failure and neonatal mortality in crossbred Indian pigs[J]. Tropical animal health and production, 2010, 42(3): 515-522.

[3] 魏戰(zhàn)勇, 王學(xué)兵, 陳紅英, 等. 利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)豬細(xì)小病毒在PK-15細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 43(4): 398-401.

[4] 周慶, 郝璐, 周澤強(qiáng). 固有免疫系統(tǒng)Toll樣受體的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志, 2016, 33(3): 83-87.

[5] TAKAHASI K, YONEYAMA M, NISHIHORI T, et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses[J]. Molecular cell, 2008, 29(4): 428-440.

[6] 楊永峰, 申煥君, 姜泓, 等. Toll樣受體4介導(dǎo)的抗病毒固有免疫研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016,32(6): 854-858.

[7] ONEILL A J, GOLENBOCK D, BOWIE A G. The history of Toll-like receptors [mdash] redefining innate immunity[J]. Nature Reviews Immunology, 2013, 13(6): 453-460.

[8] BARBER G N. Cytoplasmic DNA innate immune pathways[J]. Immunological reviews, 2011, 243(1): 99-108.

[9] SHIMOSATO T, KITAZAWA H, KATOH S, et al. Swine Toll-like receptor 9 recognizes CpG motifs of human cell stimulant[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 2003, 162(1): 56-61.

[11] KURT-JONES E A, POPOVA L, KWINN L, et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus[J]. Nature Immunology, 2000, 1(5): 398-401.

[12] 溫立斌, 何孔旺, 楊漢春, 等. 類豬圓環(huán)病毒因子P1感染對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 25(6): 9-13.

[13] 宋亞鵬, 孔雪旺, 李金磊, 等. 豬細(xì)小病毒感染對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,47 (2): 147-151.

[14] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[15] 李厚偉, 魏戰(zhàn)勇, 尹海燕, 等. 豬細(xì)小病毒感染 PK-15 細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄變化的分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 42(1): 48-55.

[16] 徐春利, 吳珺, 鄭昕, 等. Toll樣受體參與慢性HBV感染免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展[J]. 中華肝臟病雜志, 2014, 22(4): 318-320.

[17] XU N, YAO H P, SUN Z, et a1. Toll-like receptor 7 and 9 expression in penripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B and related hepatocellular carcinoma[J]. Acta Pharmacol Sin, 2008, 29: 239-244.

[18] DREXLER S K, FOXWELL B M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(4): 506-518.

[19] 王強(qiáng), 王佐風(fēng), 曹玫, 等. TLR2、TLR9及T細(xì)胞亞群在傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中的變化及意義[J]. 中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志, 2013, 18(6): 267-271.

[20] LAROSA D F, GELMAN A E, RAHMAN A H, et al. CpG DNA inhibits CD4+CD25+ Treg suppression through direct MyD88-dependent costimulation of effector CD4+ T cells[J]. Immunology Letters, 2007, 108(2): 182-188.

(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Changesoftoll-likereceptorstranscriptionalprofilesofPK-15cellculturesfollowinginfectionwithporcineparvovirus

ZHOU Yong1,2, JIN Xiaohui1,2, LI Bingxiao1,2， JING Yaxing1, HAN Li1, ZHANG Liwei1,2, WEI Zhanyong1,2

(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2.Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

This study was conducted to detect the expression of TLRs after PPV infected PK-15 cell, which aimed to explove the theoretical basis of proven PPV infection mechanism.The transcription of TLR1-10 in PPV infected PK-15 cells was detected by real-time PCR method. The results showed that TLR1 in PK-15 cells after PPV infection up-regulated in 3 hours and was about 3.1 times of the control group cells, other times were lower than the normal level; TLR3 and TLR7 mRNA expression in the initial stage of infection were lower than the normal level; the content of mRNA TLR4 and TLR8 were 3, 12 and 36 h after infection increased; TLR10 expression in 3 h and 36 h increased respectively, other times were reduced to varying degrees; while TLR2 and TLR9 expression level of mRNA in 24 h after infection began to increase, and reached the peak at 48 h, and respectively 10.1 times and 26.7 times higher than those in blank. Studies show that PPV infected PK-15 cells can induce the TLR2 and TLR9 in the mRNA level was significantly increased.PPV infection may be mediated by TLR2 and TLR9 receptors.

porcine parvovirus; Toll-loke receptor; PK-15 cell; transcriptional profiles

S858.28

：A

2016-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U140410985)

周 雍(1990-)，女，河南周口人，碩士研究生，主要從事病原生物學(xué)和分子病毒學(xué)方面的研究。

魏戰(zhàn)勇(1975-)，男，河南安陽(yáng)人，教授，博士。

1000-2340(2017)02-0201-06