李 兵, 張 博

(1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466000； 2.周口師范學(xué)院稀土功能材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466000)

高效長(zhǎng)鏈烷烴降解菌ZKNU01的選育及其降解特性

李 兵1, 張 博2

(1.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466000； 2.周口師范學(xué)院稀土功能材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466000)

通過(guò)富集分離篩選出1株高效長(zhǎng)鏈烷烴降解菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列比對(duì)和BBL Crystal AutoReaders進(jìn)行菌種鑒定，并通過(guò)UV和GC-MS檢測(cè)菌株對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴的降解特性。結(jié)果表明，分離到的1株長(zhǎng)鏈烷降解烴菌，經(jīng)鑒定為AchromobacterxylosoxidansZKNU01。該菌能高效降解長(zhǎng)鏈烷烴C15～C32，生長(zhǎng)溫度范圍0～45 ℃，最適生長(zhǎng)溫度37 ℃，在接種量為106 CFU·mL-1，原油質(zhì)量濃度為0.5 kg·L-1，振蕩培養(yǎng)7 d時(shí)，降解率可達(dá)82.06%。石油中長(zhǎng)鏈烷烴C15～C32以單末端氧化方式被完全降解。

長(zhǎng)鏈烷烴；生物降解；Achromobacterxylosoxidans

目前，石油泄漏已給全球海洋和陸地帶來(lái)嚴(yán)重的生態(tài)和環(huán)境問(wèn)題[1-2]。生物技術(shù)在石油污染治理中具有經(jīng)濟(jì)、高效、無(wú)污染的特點(diǎn)，而長(zhǎng)鏈烷烴是石油的主要組成部分，因此對(duì)微生物降解長(zhǎng)鏈烷烴的研究至關(guān)重要[3-4]。WENTZEL等[5]報(bào)道Pseudomonas,Rhodococcusspp.等可利用n-C12～n-C36烷烴做為碳源和能源。近幾年來(lái)，關(guān)于Achromobacterxylosoxidans對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴的微生物降解雖然也有研究，但還不夠深入，特別是對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴降解機(jī)理還有待進(jìn)一步探討[6]。本研究篩選到1株高效長(zhǎng)鏈烷烴降解菌，鑒定為AchromobacterxylosoxidansZNKU01，并對(duì)其對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴的降解特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 采自遼河油田鉆井機(jī)旁被填埋的油泥、油砂和附近的土壤。

1.1.2 試劑 (NH4)2PO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2SO4、CaCl2、KNO3、FeCl3、MgCl2、環(huán)已烷、正十六烷、二乙醚等為分析純；瓊脂、牛肉膏、蛋白胨等為生化試劑。

1.1.3 儀器 LRH生化培養(yǎng)箱，ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)搖床，UV-2600型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)，F(xiàn)EI Quanta 200掃描電子顯微鏡，BBL Crystal AutoReader，Agilent 7890A-5977B型GC-MS。

1.1.4 培養(yǎng)基[7]基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2HPO40.825 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、K2HPO43.815 g·L-1、Na2SO40.2 g·L-1、CaCl20.02 g·L-1、KNO31.262 5 g·L-1、FeCl30.002 g·L-1、MgCl20.02 g·L-1。

富集培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入原油5.0 g·L-1。

分離培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基加入2.0%瓊脂。

菌種純化培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 菌株分離純化 取5 g石油污染樣品加入裝有l(wèi)00 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d。取5 mL富集培養(yǎng)基同條件培養(yǎng)，重復(fù)2次。用接種環(huán)蘸取富集液在分離培養(yǎng)基上劃線(xiàn)分離。挑取生長(zhǎng)速度快且降解斑大的菌落進(jìn)行純化，對(duì)純化的菌株編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 石油降解率測(cè)定 試驗(yàn)組以石油為唯一碳源和能源進(jìn)行菌體培養(yǎng)，接種量106 CFU·mL-1，37 ℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d；對(duì)照組以不接菌的處理為對(duì)照，與試驗(yàn)組同條件培養(yǎng)。用環(huán)己烷分別提取試驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)物殘油組分，按文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)算石油降解率，降解率計(jì)算公式如下：

降解率(%)= (W0-W1)/W0×100。

式中:W0為初始石油質(zhì)量(g)；W1為接菌樣品的殘油質(zhì)量(g)。選取降解能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.2.3 菌株鑒定 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化試驗(yàn)，16S rDNA序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，BBL Crystal AutoReader微生物鑒定系統(tǒng)將菌株鑒定到種。

1.2.4 菌株降解特性分析 采用GC-MS分析試驗(yàn)組和對(duì)照組提取物組分差異[8]。以正十六烷為唯一碳源和能源進(jìn)行菌體培養(yǎng)，待穩(wěn)定期收集菌體，經(jīng)生理鹽水清洗，超聲破碎和二乙醚提取，最后對(duì)提取物進(jìn)行GC-MS分析，確定烷烴降解途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株篩選

篩選到1株高效、穩(wěn)定的長(zhǎng)鏈烷烴降解菌，命名為ZKNU01，其生長(zhǎng)溫度范圍0～45 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。

2.2菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 將純化獲得的菌株ZKNU01進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和表1。

圖1 菌株ZKNU01菌落照片F(xiàn)ig.1 Colony photo of strain ZKNU01

圖2 菌株ZKNU01掃描電鏡照片(×20 000)Fig.2 SEM of strain ZKNU01(×20 000)

2.2.2 16S rDNA序列分析 使用Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性比較；MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。通過(guò)16s rDNA序列比對(duì)分析，菌株ZKNU01與AchromobacterxylosoxidansH的菌種有高度的同源性。本研究中所獲序列已提交Genebank，序列號(hào)為KU254650。

綜合菌株ZKNU01的形態(tài)特征、生理生化、16S rDNA序列比對(duì)分析和BBL Crystal AutoReader鑒定結(jié)果，將菌株ZKNU01鑒定為Achromobacterxylosoxidans。

2.3菌株降解特性

用環(huán)已烷提取對(duì)照組和試驗(yàn)組培養(yǎng)物殘油組分，經(jīng)測(cè)定接種量106 CFU·mL-1，37 ℃，振蕩培養(yǎng)7 d ,菌株ZKNU01的降解率為82.06 %。經(jīng)GC-MS分析，對(duì)照組含有C15～C3218種長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴(圖4)，試驗(yàn)組中C15～C32這18種長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴已被完全降解，其中未降解組分C18、C23、C25、C28為長(zhǎng)鏈支鏈烷烴和雜環(huán)芳香烴(圖5)。

表1 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Characteristics of strain ZKNU01

注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

Note: “+” is positive, “-” is negative

圖3 菌株ZKNU01 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenetic dendrogram of strain ZKNU01 based on 16S rDNA

圖4 對(duì)照組提取物TIC圖譜Fig.4 Total ion chromatogram (TIC) of the extract of abiotic control

對(duì)處于穩(wěn)定期的ZKNU01菌體進(jìn)行提取和GC-MS檢測(cè)，結(jié)果在提取物中不僅檢測(cè)到正十六烷，還檢測(cè)到它的氧化中間產(chǎn)物正十六醛(圖6、圖7)，表明AchromobacterxylosoxidansZKNU01是通過(guò)單末端氧化途徑來(lái)降解正鏈烷烴。

圖5 試驗(yàn)組提取物TIC圖譜Fig.5 TIC of the extract of experimental group

3 結(jié)論

本研究從遼河油田石油污染土壤樣品中分離到1株菌株，鑒定為AchromobacterxylosoxidansZKNU01。該菌能夠以長(zhǎng)鏈烷烴為唯一碳源獲得良好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍0～45 ℃，最適生長(zhǎng)溫度37 ℃，在接種量為106 CFU·mL-1，原油質(zhì)量濃度為0.5 kg·L-1, 振蕩培養(yǎng)7 d時(shí), 降解率可達(dá)82.06%。GC-MS分析表明，菌株ZKNU01對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴有較好的降解效果，石油中長(zhǎng)鏈烷烴C15～C32已被完全降解。以正十六烷為唯一碳源對(duì)菌株ZKNU01進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)在ZKNU01的細(xì)胞提取物中檢測(cè)到正十六烷及其中間產(chǎn)物正十六醛，結(jié)果證明AchromobacterxylosoxidansZKNU01是通過(guò)單末端氧化途徑降解正鏈烷烴。在檢測(cè)過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)正十六醇，我們推測(cè)菌株ZKNU01中烷烴羥化酶和乙醇脫氫酶活性比乙醛脫氫酶高。雖然AchromobacterxylosoxidansXL對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴降解也曾有報(bào)道[6]，但其降解效率與本研究中的ZKNU01菌株相比仍有較大差距，且并未對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴降解機(jī)理進(jìn)行研究。

圖6 菌株ZKNU01提取物GC-MS分析結(jié)果Fig.6 GC-MS analysis of total crude extract of strain ZKNU01

圖7 正十六醛MS圖譜Fig.7 MS spectrum of n-Hexadecanal

生物修復(fù)能夠加速石油污染物的降解，在治理石油污染方面具有重大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益[8-9]。研究表明，烷烴降解菌可以通過(guò)產(chǎn)生生物表面活性劑來(lái)有效提高疏水性有機(jī)污染物的生物可利用性，強(qiáng)化其生物降解過(guò)程[10]。因此,利用烷烴降解菌來(lái)協(xié)助解決石油污染問(wèn)題具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] ATLAS R M, HAZEN T C. Oil biodegradation and bioremediation: a tale of the two worst spills in U.S. history [J]. Environmental Science & Technology,2011,45(16):6709-6715.

[2] XU H L, CHEN J N, WANG S D, et al. Oil spill forecast model based on uncertainty analysis: a case study of Dalian oil spill[J].Ocean Engineering,2012,54(9):206-212.

[3] BIHARI Z, SZABó Z, SZVETNIK A, et al. Characterization of a novel long-Chain n-alkane-degrading strain, Dietzia sp. E1[J]. Zeitschrift Für Naturforschung C Journal of Biosciences,2010,65 (11/12):693-700.

[4] YANTO D H Y, TACHIBANA S. Biodegradation of petroleum hydrocarbons by a newly isolated sp. NG007[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2013,85(11): 438-450.

[5] WENTZEL A, ELLINGSEN T E, KOTLAR H K, et al. Bacterial metabolism of long-chain n-alkanes[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2007,76(6):1209-1221.

[6] 司美茹,趙云峰,蘇濤.高效降解烷烴的無(wú)色桿菌XL株的分離鑒定及其降解特性[J].土壤通報(bào),2011, 42(3):562-567.

[7] GOPINATHAN R, PRAKASH M, BHARATHIRAJAN R. An experimental study for crude oil biodegradation in contaminated soil[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences,2012,1(1):12-16.

[8] LIU H, XU J, LIANG R, et al. Characterization of the medium and long-chain n-alkanes degradingPseudomonasaeruginosastrain SJTD-1 and its alkane hydroxylase genes[J].Plos One.2014,9(8):e105506.

[9] BOUTHEINA G, FATMA K, NAJLA M, et al. Bioremediation of petroleum hydrocarbons-contaminated soil by bacterial consortium isolated from an industrial wastewater treatment plant[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology,2014,89(7):978-987.

[10] GARCIA I N S, OLIVEIRA V M D. Microbial hydrocarbon degradation: efforts to understand biodegradation in petroleum reservoirs[M]//ROLANDO C, FRANCISCA R. Biodegradation. Engineering and Technology.London: InTech,2013,47-72.

(責(zé)任編輯：朱秀英)

Screeningofahigh-efficiencylong-chainalkane-degradingbacteriaZKNU01anditsdegradationcharacteristics

LI Bing1, ZHANG Bo2

(1.College of Life Science and Agiculture, Zhoukou Normal College, Zhoukou 466000,China; 2.The Key Laboratory of Rare Earth Functional Materials and Applications, Zhoukou Normal College, Zhoukou 466000, China)

A long-chain alkane-degrading bacteria was obtained by enriched culture, and identified based on morphological, physiological and biochemical tests,16S rDNA sequence alignment and BBL Crystal AutoReader tests. The degradation characteristics were determined by UV spectrophotometry and GC-MS. The results showed that, a newly isolated strain, identified asAchromobacterxylosoxidansZKNU01, proved to have an excellent ability to degrade n-C15～n-C32alkane components of crude oil. The temperature range for its growth was 0～45 ℃ (optimum at 37 ℃). Strain ZKNU01 could remove 82.06% of oil at 0.5 kg·L-1concentration and 106CFU·mL-1inoculum within 7 d at 37 ℃. n-alkanes C15～C32in oil were completely depleted via the monoterminal oxidation pathway.

long-chain alkane; biodegradation;Achromobacterxylosoxidans

X172

：A

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21503285)

李 兵(1983-)，男，河南周口人，碩士研究生，主要從事環(huán)境生物學(xué)方面的研究。

1000-2340(2017)02-0226-04