趙曉燕

朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西朔州 036002

*認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)與神經(jīng)工程*

士的寧對皮層神經(jīng)元瞬時外向鉀通道的影響

趙曉燕

朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西朔州 036002

目的 研究瞬時外向鉀通道在士的寧中樞興奮性中所起的作用。方法 2014年9月—2016年10月在朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院采用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式，在原代細(xì)胞水平上研究士的寧對昆明（KM）小鼠皮層神經(jīng)元瞬時外向鉀通道電流（IA）的影響。結(jié)果 士的寧呈濃度依賴性地抑制IA，1 μM和10 μM士的寧的抑制效果顯著；1 μM士的寧能顯著降低IA半數(shù)激活電壓約18 mV，加快了通道的激活，但對半數(shù)失活電壓沒有顯著影響；1 μM士的寧使失活后恢復(fù)時間延長了約8 ms，推遲通道失活后恢復(fù)過程。結(jié)論 士的寧對大腦皮層具有的興奮性調(diào)節(jié)作用在一定程度上是對IA作用的結(jié)果。

士的寧；皮層神經(jīng)元；IA

士的寧是由中藥馬錢子中提取出來的生物堿[1]，能經(jīng)血腦屏障進(jìn)入大腦，從而起到興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。士的寧作為一類中樞興奮藥物已被臨床廣泛應(yīng)用[2]，能夠興奮延髓、脊髓和大腦皮層感覺中樞。目前對士的寧中樞興奮作用機(jī)制的研究幾乎均集中在神經(jīng)遞質(zhì)與受體方面，即延髓和脊髓上有甘氨酸受體表達(dá)，這種受體能和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸結(jié)合，而士的寧卻能特異性地阻止這種結(jié)合，進(jìn)而解除抑制興奮中樞系統(tǒng)。此外，研究還表明甘氨酸受體在大腦皮層上幾乎不表達(dá)[3]，故士的寧可能通過其他機(jī)制對大腦皮層起興奮性作用。許多中樞神經(jīng)類藥物發(fā)揮藥理學(xué)作用的機(jī)制是影響離子通道的動力學(xué)特性以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[4]。目前隨著膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，對藥理學(xué)機(jī)制的研究越來越多的集中在離子通道方面，這也為士的寧的中樞興奮作用機(jī)制的研究提供了新的思路。電壓門控性鉀通道在哺乳動物大腦中廣泛地分布著，是一類種類和功能最為復(fù)雜的鉀通道[5]，能調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的靜息膜電位、參與動作膜電位的復(fù)極化過程、控制動作電位的持續(xù)時間及放電頻率等[6]。瞬時外向鉀通道是電壓門控性鉀通道的一個主要類型[7]，常為中樞藥物作用靶點(diǎn)，故該研究在2014年9月—2016年10月采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究士的寧對KM小鼠原代皮層神經(jīng)元IA的影響，每組選取8個左右皮層神經(jīng)元進(jìn)行研究，目的為士的寧作為中樞興奮藥提供通道藥理學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

士的寧：中國藥品生物制品檢定所(110705-200306)；多聚賴氨酸，β-阿拉伯糖呋喃糖苷：美國Sigma。出生24 h以內(nèi)的KM小鼠：大連理工大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 溶液配制

電極外液為(mM)：1 MgCl2，4 KCl，15 Glucose，2 Ca-Cl2，10 HEPES，140 NaCl，用NaOH堿溶液調(diào)節(jié)pH=7.4，最后用直徑為0.22 m濾膜除菌，保存于4°C。電極內(nèi)液為(mM)：1 MgCl2，140 KCl，2 Na2ATP，10 HEPES，1 EGTA，用KOH強(qiáng)堿溶液調(diào)節(jié)pH=7.3，最后用直徑為0.22 m濾膜除菌，保存于-20°C。最后，細(xì)胞外液中加入終濃度為0.2 mM CdCl2和0.001 mM TTX，目的排除內(nèi)向電流的影響；細(xì)胞外液中加入20 mM TEA，目的排除延遲整流鉀電流的影響。

1.3 大腦皮層原代神經(jīng)元分離與培養(yǎng)

選取新生24 h以內(nèi)KM小鼠，麻醉后迅速斷頭，分離皮層組織。用0.125%胰酶消化約25 min，1 200 r，5 min離心，棄上清。再用DMEM/F12重懸沉淀，接種到已用30 μg/mL多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度約為2～3×105/mL。置于CO2培養(yǎng)箱，2 d后添加10 μM β-阿拉伯糖呋喃糖苷，48 h后更換新培養(yǎng)基，之后每隔2 d換一次培養(yǎng)基。選用培養(yǎng)到第7～10天的皮層神經(jīng)元做膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄

將裝有神經(jīng)元培養(yǎng)皿的舊培養(yǎng)基去掉，加入2 mL 標(biāo)準(zhǔn)電極外液。用倒置顯微鏡選取胞體有較強(qiáng)的反光、表面干凈、呈錐體形的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用電極拉制儀制作玻璃微電極，借助毛細(xì)作用灌注標(biāo)準(zhǔn)電極內(nèi)液。用三維微操縱儀讓電級與細(xì)胞外液接觸，補(bǔ)償液接電位，電極與皮層神經(jīng)元接觸，施加適當(dāng)負(fù)壓，形成高阻封接。施加快速負(fù)壓破膜，補(bǔ)償慢電容后，形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式，按照事先設(shè)定好的刺激方案記錄電流。

1.5 給藥方式

采用灌流的方法給藥，記錄給藥前（作為對照組）電流、給藥后2 min（作為實(shí)驗(yàn)組）電流，也就是采用自身前后對照的方式，每組選取皮層神經(jīng)元數(shù)目為8個左右。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

記錄和分析數(shù)據(jù)采用軟件Pulse、Origin、Clamfit。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用mean±SE表示，各組數(shù)據(jù)間進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)目用n表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 士的寧對IA電流峰值的影響

膜電位鉗制在-70 mV，給予一個時程為80 ms，從-50 mV開始到+60 mV，10 mV階躍一次的去極化脈沖。借助MPS-1多通道快速加藥系統(tǒng)，給予不同濃度的士的寧(分別為0.001,0.01,0.1,1,10 μM)，通過抑制率公式：抑制率(%)＝[(給藥前電流峰值－給藥后電流峰值)/給藥前電流峰值]×100%來計(jì)算，結(jié)果顯示0.001，0.01，0.1，1，10 μM的士的寧分別使IA電流峰值減少了(12.68±5.78)%(n=8,P＞0.05)，(14.95±3.01)%(n=8,P＞0.05)，(15.81±3.89)%(n=8,P＞0.05)，(25.37±7.38)%(n=8,P＜0.05)和(33.76±9.43)%(n=8,P＜0.05)，如圖1A，這表明士的寧對IA電流的抑制率呈濃度依賴性，且1 μM和10 μM士的寧的抑制效果顯著。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)只選取1 μM作為士的寧的實(shí)驗(yàn)濃度。1 μM士的寧對IA電流的抑制作用見圖1B。

圖1 士的寧對IA的作用Fig.1 Effects of strychnine on IA

2.2 士的寧對IA穩(wěn)態(tài)激活參數(shù)的影響

首先將膜電位鉗制在-70 mV，接著給予一個時程為80 ms，從-50 mv開始直接階躍到+60 mV，且每10 mV階躍一次的去極化脈沖。根據(jù)波爾茲曼方程對電導(dǎo)值—膜電位曲線擬合，發(fā)現(xiàn)士的寧對半數(shù)激活電壓Vb1/2和斜率因子κb的影響見表1。

2.3 士的寧對IA穩(wěn)態(tài)失活參數(shù)的影響

膜電位保持在-70 mV，接著設(shè)置一個時程為100 ms的條件脈沖：從-120～0 mV，以10mV為一個階躍；最后設(shè)置一個時程為100 ms的測試脈沖，固定去極化到+40 mV。運(yùn)用波爾茲曼方程擬合標(biāo)準(zhǔn)化電流-電壓曲線，發(fā)現(xiàn)士的寧對半數(shù)激活電壓Vc1/2和斜率因子κc的影響見表1。

表1 士的寧對IA動力參數(shù)的影響（±s）

表1 士的寧對IA動力參數(shù)的影響（±s）

注:與對照前比較，*P＜0.05。

組別 Vb1/2(mV) κb Vc1/2(mV) κc加藥錢士的寧4.31±0.38 (-13.83±0.49)*17.24±0.34 17.65±0.37 -78.15±0.59 -79.772±0.61 9.57±0.53 9.85±0.54

2.4 士的寧對IA失活后恢復(fù)過程的影響

膜電位保持在-70 mV，接著設(shè)置一個時程為80 ms的條件脈沖：從-70 mV到+50 mV；間隔10～260 ms以后設(shè)置一個時程為80 ms的測試脈沖，固定去極化到+50 mV。運(yùn)用單指數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)化電流—時間曲線，繪制失活后恢復(fù)曲線，見圖2。發(fā)現(xiàn)士的寧使失活后恢復(fù)時間常數(shù)τ由(32.43±3.17)ms變?yōu)?40.38±2.94)ms(n=8,P＜0.05)。結(jié)果表明士的寧對IA失活后恢復(fù)曲線有顯著的影響，延遲IA通道失活后恢復(fù)過程。

圖2 士的寧對IA失活后恢復(fù)曲線的作用Fig.2 Effects of strychnine on IA recovery from fast inactivation.

3 討論

已有研究表明士的寧作用大腦皮層，大腦皮層會表現(xiàn)放電效應(yīng)。Heinbecker等[8]以兔和貓為研究對象，研究士的寧作用前后側(cè)皮層感覺運(yùn)動區(qū)或視區(qū)的自發(fā)電活動，發(fā)現(xiàn)士的寧能加強(qiáng)電活動幅度和增加放電的面積和頻率。此外，張香桐等記錄在離電極最近處的皮層電位時，發(fā)現(xiàn)低閾值的刺激對象是樹突電位，但是高閾值的刺激對象是皮層神經(jīng)元。這也就說明士的寧對皮層具有作用，并且可以作用于皮層神經(jīng)元。故該研究也以皮層神經(jīng)元為對象，探討士的寧對皮層的作用。

士的寧對離子通道作用的研究也相當(dāng)深入。Shapiro[9]研究發(fā)現(xiàn)士的寧能阻斷青蛙朗飛結(jié)處鈉電流和阻斷槍烏賊軸突處鉀電流；Oyama等[10]研究發(fā)現(xiàn)士的寧能阻斷海兔神經(jīng)元和青蛙神經(jīng)節(jié)的鈣電流。

鉀通道在哺乳動物大腦中廣泛地分布著，電壓依賴性鉀通道是鉀通道超家族中的主要成員。瞬時外向鉀通道是電壓門控性鉀通道的一個主要類型，能產(chǎn)生IA。目前普遍認(rèn)為IA是參與動作電位復(fù)極化早期的主要外向電流[11]，能夠控制動作電位的產(chǎn)生和影響動作電位發(fā)放頻率，是一些中樞興奮藥物的作用靶點(diǎn)。士的寧能對大腦皮層具有興奮作用，能夠使抑制狀態(tài)的患者蘇醒過來[12]，所以在該論文中取KM小鼠的皮層神經(jīng)元為研究對象，首先討論士的寧對原代皮層神經(jīng)元IA電流峰值的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 μM和10 μM士的寧能濃度依賴性地抑制IA電流幅度，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取1 μM士的寧為研究對象。此外，士的寧能夠影響IA通道的動力學(xué)參數(shù)，使半數(shù)激活電壓由(4.31±0.38)mV降為(-13.83±0.49)mV(n=8,P＜0.05)，能夠加快通道的激活；使失活后恢復(fù)時間常數(shù)τ由(32.43±3.17)ms變?yōu)?40.38±2.94)ms(n=8,P＜0.05)，能延遲通道失活后恢復(fù)過程。這表明士的寧是通過改變瞬時外向鉀通道的激活與失活后恢復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)。故該論文推測士的寧對皮層神經(jīng)元瞬時外向鉀通道的作用部位既是該通道的激活門控蛋白又是失活后恢復(fù)門控蛋白。已有研究表明，IA電流參與動作電位復(fù)極化過程，若抑制IA電流峰值，也就降低鉀離子的流動，會影響動作電位的產(chǎn)生，減緩動作電位的發(fā)放頻率[13]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示士的寧對皮層神經(jīng)元IA電流具有顯著地抑制作用，也就減少了鉀離子外流，從某種意義上說士的寧維持了神經(jīng)元鉀離子濃度與Na-KATP酶的活性，也就減少了過氧化物的釋放，進(jìn)而有助于受損皮層神經(jīng)元的恢復(fù)。此外，士的寧對皮層神經(jīng)元IA電流具有顯著地抑制作用，從另一種意義上說士的寧減慢了動作電位重復(fù)發(fā)放頻率，也就減少了機(jī)體能量的過度消耗。故這就首先解釋了士的寧的中樞興奮性作用。

小劑量的士的寧能加強(qiáng)皮層的興奮過程，使處于抑制狀態(tài)的病人蘇醒過來，且能提高一些感覺器官的功能，如味覺、觸覺、聽覺及視覺等。但是接近中毒劑量的士的寧，在短時間的提高興奮后即發(fā)生超限抑制現(xiàn)象。林昌松等[14]研究表明士的寧的中毒血藥濃度為2 mg/L，約為5.98 μM，而該實(shí)驗(yàn)證明1 μM士的寧能興奮皮層神經(jīng)元，遠(yuǎn)小于士的寧中毒血藥濃度，這和林昌松的研究一致。該研究也為小劑量的士的寧加強(qiáng)皮層的興奮性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。該實(shí)驗(yàn)證明士的寧能興奮皮層神經(jīng)元的濃度為1 μM，由于這個濃度是直接作用于神經(jīng)細(xì)胞，所以臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，士的寧對中樞神經(jīng)具有興奮性作用，其具體的作用機(jī)制可能是士的寧通過影響皮層神經(jīng)元瞬時外向鉀離子通道的激活和失活后恢復(fù)動力學(xué)特征，抑制IA電流，減緩動作電位的發(fā)放頻率，進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)興奮性。這些結(jié)果對研究中樞興奮性藥物具有一定的作用，為士的寧作為中樞興奮藥的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Strychnine on the Cortical Neuron Instantaneous Outward Potassium Channels

ZHAO Xiao-yan
Biological Engineering Department,College of Vocational and Technical,Shuozhou,Shanxi Province,036002 China

Objective To research the effect of strychnine on the cortical neuron instantaneous outward potassium channels.Methods The whole-cell patch clamp recording model was adopted in the College of Vocational and Technical from September 2014 to October 2016,the effect of strychnine on the cortical neuron instantaneous outward potassium channels current in Kunming was researched. Results The strychnine restrained IAdependently,the control effect of strychnine for 1 μM and 10 μM is obvious,and 1 μM strychnine can obviously reduce the IAhalf activation voltage about 18 mV,accelerate the activation of passage but had no obvious effect on half inactivation voltage,and the 1 μM strychnine extended the recovery time after inactivation about 8 ms and postponed the recovery course of passage after inactivation.Conclusion The excitability adjustment function of strychnine on pallium is the results on IAto a certain degree.

Strychnine;Cortical neuron;IA

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.28

2017-01-04；

2017-01-19

趙曉燕（1985.6-），女，山西朔州人，碩士，助教，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)教育工作。