余杰，毛建文，徐彬

1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006

ClC-3基因敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定

余杰1，毛建文2，徐彬1

1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006

目的 構(gòu)建并鑒定ClC-3基因敲除小鼠，為研究ClC-3氯通道蛋白的生物學(xué)功能提供動(dòng)物模型。 方法 將從2015年9月—2016年9月選取的6只賽業(yè)生物科技有限公司 (廣州)構(gòu)建的ClC-3flox/+小鼠與2只Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的Ubc-Cre小鼠進(jìn)行雜交繁殖，得到基因型為ClC-3flox/flox-Cre+及ClC-3flox/+-Cre+的小鼠。取鼠尾DNA，通過PCR法鑒定子代小鼠的基因型。結(jié)果 子代小鼠基因組DNA結(jié)果顯示在357 bp與100 bp處均有條帶，符合預(yù)期結(jié)果。 結(jié)論 該研究基于Cre/Loxp系統(tǒng)，利用loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表達(dá) Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，成功構(gòu)建并鑒定了ClC-3基因敲除小鼠。

ClC-3；基因敲除；Cre/Loxp系統(tǒng)

課題組自 2000年開始從事 ClC-3蛋白的生物學(xué)功能研究，致力于獲得 ClC-3氯通道蛋白參與某些疾病的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。有研究表明ClC-3氯離子通道參與了細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]、增殖[2-3]、遷移[4-8]、凋亡[9]等過程，另外，一些疾病的發(fā)生發(fā)展也與ClC-3有著密不可分的聯(lián)系[10-17]，例如其在腫瘤組織中高表達(dá)[18-19]，且在不同病理分級(jí)之間存在明顯差異[20]。因此，成功構(gòu)建ClC-3基因敲除小鼠，為研究ClC-3基因與某些疾病的相關(guān)性提供動(dòng)物模型具有重要的意義?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建組織特異性ClC-3敲除小鼠模型用于疾病研究，例如，腸特異性敲除ClC-3會(huì)加重炎癥性腸病[20]，心臟特異性敲除 ClC-3基因會(huì)導(dǎo)致成年鼠心肌肥厚。但目前還沒有實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建條件性ClC-3敲除小鼠，該課題組從2015年9月—2016年9月，利用6只loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和2只在全身表達(dá) Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，成功繁育出條件性ClC-3敲除小鼠21只，為進(jìn)一步研究ClC-3與某些疾病的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Ubc-Cre工具鼠由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn) (Stock Number:007179，StrainName:129S.Cg-Tg(UBC-cre/ERT2)1Ejb/J，品系背景為C57BL/6J，雄性2只，基因型為雜合子(+/-)。ClC-3基因敲除小鼠委托賽業(yè)生物科技有限公司(廣州)構(gòu)建，編號(hào)為001_mClcn3_1H12,品系背景為C57BL/6J，雌雄各3只，基因型為雜合子(+/-)。同時(shí)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購進(jìn)野生型C57BL/6J鼠雌性15只、雄性1只用于保種擴(kuò)群。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鼠尾基因組DNA提取試劑盒 （目錄號(hào)：CW2094）購自康為世紀(jì)有限公司，Taq酶 (DRR037S)、DNA marker DL1000(D526A)、瓊脂糖（BIOWEST）購自大連寶生物工程有限公司，EB替代物溶液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。小鼠鑒定引物由上海Invitrogen公司合成，見表1。

1.3 敲除小鼠的繁殖、信息記錄

3月齡雜合flox小鼠、Cre工具小鼠及野生型小鼠于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)[SYXK(粵)2012-0125]，紫外2 h/d，溫度22～28℃，濕度 40%～60%，明暗循環(huán)12 h/d，自由飲食和飲水。小鼠飼料及墊料均購自廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，籠盒、墊料、飲用水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，進(jìn)入動(dòng)物房1次/d補(bǔ)充飼料和飲用水，觀察小鼠生長情況，墊料更換3次/周。小鼠2個(gè)月后性能力發(fā)育成熟，將其雌雄3:1同籠合養(yǎng)，定期給予滅菌葵花籽以增強(qiáng)其繁殖能力。雌性小鼠的妊娠期和哺乳期為3周左右，記錄其分娩時(shí)間、仔鼠數(shù)量，并于哺乳期后將小鼠與母鼠分開，雌雄分開飼養(yǎng)，待小鼠成年用于鑒定。flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）自交所得F1代有flox純合小鼠（ClC-3flox/flox）、flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）及野生型小鼠（ClC-3+/+），據(jù)孟德爾定律，概率分別為1/4、1/2、1/4。同時(shí)由flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）與Cre工具小鼠（Cre+）交配獲得雜交系F1代有flo x雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+），Cre工具小鼠（Cre+），野生型小鼠（ClC-3+/+），概率分別為1/4。最后由所得的flox純合小鼠（ClC-3flox/flox）與 flox雜合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）雜交得到flox純合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox純合小鼠（ClC-3flox/flox），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+），概率分別為1/4。其中flox純合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）即實(shí)驗(yàn)所需。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1 小鼠組織DNA的提取 將小鼠尾部組織小段 （長0.5～1.0 cm）置入1.5 mL Eppendolf管，按照TailGen DNA Kit鼠尾基因組DNA提取試劑盒 （CW2094）說明進(jìn)行操作，提取DNA。

1.4.2 PCR反應(yīng) 利用ClC-3基因敲除鼠和Ubc-Cre工具鼠特異性引物(如表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ClC-3基因敲除鼠PCR體系總體積25 μL，分別加入Premix Taq酶12.5 μL，PCR引物各0.8 μL，模板DNA1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。注：引物濃度為10 μM。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火60℃ 35 s，延伸72℃35 s，循環(huán)32次，72℃延伸5min，4℃保存。Ubc-Cre工具鼠PCR體系總體積12 μL，分別加入Premix Taq酶4.81 μL,目的基因及內(nèi)參引物各1.2 μL，模板DNA2 μL，ddH2O 2.79 μL。注：引物濃度為10 μM。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火51.7℃1 min，延伸72℃1 min，循環(huán)35次，72℃延伸2 min，4℃保存。

表1 基因型鑒定的引物信息表

1.4.3 瓊脂糖電泳及成像分析 取10 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行3%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖情況

成年ClC-3 flox母鼠與表達(dá)Cre重組酶的母鼠成功繁殖出子代幼鼠。每只母鼠孕期為19～21 d，哺乳期18～23 d，產(chǎn)后3周離乳。每胎平均產(chǎn)6～10只幼鼠，成活率＞95%，新生小鼠呈肉色，無毛，閉眼，尾短，四肢柔弱，平均斷乳期21 d。成年小鼠成熟期：雄性10周，雌性8周，體重、活力相對(duì)C57BL/6J沒有較大差別，但繁殖能力相對(duì)弱，容易出現(xiàn)食仔、脫毛等現(xiàn)象。12個(gè)月共繁育小鼠2代/次，得到F2代小鼠39只，經(jīng)基因型鑒定，獲得flox純合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）9只，flox雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+）12只，flox純合小鼠 （ClC-3flox/flox）8只，flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）10只，純合小鼠比例為23%，基本符合孟德爾遺傳定律。

2.2 ClC-3基因敲除鼠鑒定結(jié)果

F2代基因敲除小鼠有 flox純合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴 Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox純合小鼠 （ClC-3flox/flox），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）4種基因型。Loxp位點(diǎn)驗(yàn)證，如圖 1所示，1、2、3、4、6號(hào)小鼠電泳條帶位于357 bp和287 bp處為雜合子；5、8號(hào)小鼠電泳條帶位于357 bp處為純合子；7號(hào)小鼠電泳條帶位于287 bp處為野生型。Cre位點(diǎn)驗(yàn)證，如圖2所示，3、4、5、6、7號(hào)小鼠電泳條帶位于100 bp是為有Cre位點(diǎn)。綜上，實(shí)驗(yàn)所需flox純合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+）為5號(hào)，flox雜合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）為3、4、6號(hào)。

圖1 ClC-3 flox小鼠基因型鑒定結(jié)果

圖2 表達(dá)UBC-Cre重組酶的小鼠基因型的鑒定結(jié)果

2.3 小鼠生長發(fā)育情況

flox純合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）毛色、體重、活力相對(duì)野生型C57BL/6 J整體沒有較大差別，見圖3。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，部分組織如腦、腎臟、脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)，flox純合伴 Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）相對(duì)C57BL/6J未見明顯異常，見圖4。

圖3 不同基因型小鼠形態(tài)對(duì)比

圖4 不同基因型小鼠的部分組織比較（HE，×100）

3 討論

隨著基因組學(xué)研究的深入，基因敲除技術(shù)日漸成熟，Zhen等[21]通過 RNA干擾技術(shù)成功抑制豬顆粒細(xì)胞中CEBPβ基因表達(dá)。2012年，余華等[22]利用雙臂同源重組法成功對(duì)銅綠假單胞菌內(nèi)彈性蛋白基因進(jìn)行了敲除。Liu等[23]采用 TALENs技術(shù)對(duì)對(duì)果蠅染色體上的基因進(jìn)行了修飾。該文所述的條件性基因敲除是利用Cre／Loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)基因打靶的方法。Cre重組酶由Cre基因編碼，可識(shí)別特異DNA序列，如Loxp位點(diǎn)，切掉Loxp位點(diǎn)之間的靶基因和一個(gè)Loxp位點(diǎn)，從而達(dá)到靶基因敲除的目的。通過顯微注射法把兩個(gè)同向排列的LoxP位點(diǎn)插入到胚胎干細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)的一個(gè)或幾個(gè)重要外顯子的兩端以制備出floxed小鼠，即文中所提ClC-3flox/+鼠，基因組DNA結(jié)果顯示在357 bp處有條帶，該floxed小鼠在與表達(dá)Cre重組酶小鼠雜交之前，該目的基因表達(dá)完全正常，若floxed小鼠與組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細(xì)胞表達(dá)正常，該實(shí)驗(yàn)所雜交對(duì)象為全身表達(dá)Cre重組酶的Ubc-Cre工具小鼠，DNA結(jié)果顯示在100bp處有條帶，可對(duì)ClC-3進(jìn)行全身敲除。

ClC-3，基因符號(hào)為CLCN3，作為ClC電壓門控性氯離子通道家族中的重要一員，對(duì)于保持膜腔內(nèi)電中性調(diào)節(jié)細(xì)胞體積有重要作用。有研究表明，心臟特異性敲除ClC-3基因，可以導(dǎo)致心肌肥大甚至心衰[24]，此外，ClC-3在胃腸道黏膜保護(hù)、血管重塑[25]、成骨細(xì)胞的礦化和骨形成過程中也起到重要作用[26-27]，也有研究表明某些基因的完全性敲除小鼠致死率極高[28]，難以進(jìn)行該基因功能的相關(guān)性研究。因此，構(gòu)建全身敲除ClC-3基因的小鼠并于成年后誘導(dǎo)敲除對(duì)于進(jìn)一步深入研究ClC-3的功能極為重要，該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的敲除小鼠未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)時(shí)生長發(fā)育良好，且病理檢查未見異常，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Cre／Loxp條件性基因敲除技術(shù)原理，只有基因型為ClC-3 flox/flox-Cre+的純合小鼠于成年后經(jīng)他莫西芬誘導(dǎo)ClC-3基因完全敲除，而其他類型的小鼠體內(nèi)ClC-3基因則正常存在。例如基因型為ClC-3flox/+-Cre+的雜合子敲除小鼠仍有可能對(duì)某些細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建ClC-3基因敲除純合子、雜合子小鼠用于深入研究ClC-3的結(jié)構(gòu)、功能及與某些疾病的相關(guān)性。

綜上所述，基于Cre/Loxp系統(tǒng)，利用loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表達(dá) Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建ClC-3基因全身敲除小鼠,并通過PCR技術(shù)從基因表達(dá)水平上完成了鑒定。ClC-3全身敲除小鼠在生長速度、繁殖能力等方面與野生型小鼠無明顯差異。到目前為止培育雜交子代小鼠共20多只，下一步待小鼠發(fā)育成熟后通過他莫西芬誘導(dǎo)其ClC-3全身敲除，并利用該敲除鼠，探討局部給藥誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)組織特異性敲除，觀察ClC-3敲除對(duì)高表達(dá)ClC-3的組織功能是否有影響。

綜述所述，條件性ClC-3基因全身敲小鼠的成功構(gòu)建，為ClC-3在組織器官生理病理的功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料基礎(chǔ)。

（

）

[1]Guzman RE,Miranda-Laferte E,Franzen A,et al.Neuronal ClC-3 splice variants differ in subcellular localizations,but mediate identicaltransportfunctions [J].JournalOf Biological Chemistry,2015,290(43):25851-25862.

[2]Mao J,Li X,Chen W,et al.Cell cycle-dependent subce llular distribution of ClC-3 in HeLa cells[J].Histochemistry And Cell Biology,2012,137(6):763-776.

[3]Liang W,Huang L,Zhao D,et al.Swelling-activated Cl currents and intracellular CLC-3 are involved in proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells[J].Journal Of Hypertension,2014,32(2):318-330.

[4]Guo R,Pan F,Tian Y,et al.Down-Regulation of ClC-3 Expression Reduces Epidermal Stem Cell Migration by Inhibiting Volume-Activated Chloride Currents[J].The Journal Of Membrane Biology,2016:1-12.

[5]Xu B,Jin X,Min L,et al.Chloride channel-3 promotes tumor metastasis by regulating membrane ruffling and is associated with poor survival[J].Oncotarget,2015,6(4):2434-2450.

[6]Guan Y,Huang Y,Wu J,et al.Overexpression of chloride channel-3 is associated with the increased migration and invasion ability of ectopic endometrial cells from patients with endometriosis[J].Human Reproduction,2016:dew034.

[7]Ma MM,Lin CX,Liu CZ,et al.Threonine532 phosphorylation in ClC-3 channels is required for angiotensin II-induced Cl?current and migration in cultured vascular smooth muscle cells[J].British Journal Of Pharmacology,2016,173 (3):529-544.

[8]Gaurav R,Bewtra AK,Agrawal DK.Chloride Channel 3 Channelsinthe Activationand MigrationofHumanBlood Eosi nophils in Allergic Asthma[J].American Journal Of Respir atory cell And Molecular Biology,2015,53(2):235-245.

[9] Liu J,Zhang FF,Li L,et al.ClC-3 deficiency prevents apoptosis induced by angiotensin II in endothelialprogenitorcellsvia inhibition ofNADPH oxidase[J]. Apoptosis,2013,18(10):1262-1273.

[10]Guzman RE,Alekov AK,Filippov M,et al.Involvement of ClC -3 chloride/proton exchangers in controlling glutamatergic synaptic strength in cultured hippocampal neurons[J].Frontiers In Cellular Neuroscience,2014：8.

[11]Zhang Y,Guo X,Guo J,et al.Lactobacillus casei reduces susceptibility to type 2 diabetes via microbiota-mediated body chloride ion influx[J].Scientific Reports,2014（4）: 5654.

[12]Xiang N,Liu J,Liao Y,et al.Abrogating ClC-3 Inhibits LPS-induced Inflammation via Blocking the TLR4/NF-κB Pathway[J].Scientific Reports,2016：6.

[13] Liu SW,Li Y,Zou LL,et al.Chloride channels are involved in sperm motility and are downregulated in spermatozoa from patients with asthenozoospermia[J].Asian Journal Of Andrology,2016.

[14]Tao J,Liu C Z,Yang J,et al.ClC-3 deficiency prevents atherosclerotic lesion development in ApoE mice[J].Journal Of Molecular And Cellular Cardiology,2015（87）:237-247.

[15]Huang YY,Huang XQ,Zhao LY,et al.ClC-3 deficiency protects preadipocytes against apoptosis induced by palmi tate in vitro and in type 2 diabetes mice[J].Apoptosis, 2014,19(11):1559-1570.

[16]Fan F,Liu T,Wang X,et al.ClC-3 Expression and Its Association with Hyperglycemia Induced HT22 Hippoc ampal Neuronal Cell Apoptosis[J].Journal Of Diabetes Res earch,2016,2016.

[17]Yan Y,Ding Y,Ming B,et al.Increase in Hypotonic Stress-Induced Endocytic Activity in Macrophages via ClC-3[J].Molecules And Cells,2014,37(5):418.

[18]Zhang H,Zhu L,Zuo W,et al.The ClC-3 chloride channel protein is a downstream target of cyclin D1 in nasopharyngeal carcinoma cells[J].The International Journal Of Biochemistry&Cell Biology,2013,45(3):672-683.

[19]Ye D,Luo H,Lai Z,et al.ClC-3 Chloride Channel Proteins Regulate the Cell Cycle by Up-regulating cyclin D1-CDK4/6 through Suppressing p21/p27 Expression in Nasopharyngeal Carcinoma Cells[J].Scientific Reports,2016, 6.

[20]Huang L Y,He Q,Liang S J,et al.ClC-3 chloride channel/ antiporter defect contributes to inflammatory bowel disease in humans and mice[J].Gut,2014:gutjnl-2013-305168.

[21]Zhen YH,Wang L,Riaz H,et al.Knockdown of CEBPβ by RNAi in porcine granulosa cells resulted in S phase cell cycle arrest and decreased progesterone and estradiol synthesis[J].The Journal Of Steroid Biochemistry And Mol ecular Biology,2014（214）:90-98.

[22]余華,熊浚智,何曉梅,等.采用 Red重組系統(tǒng)敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2013, 29(2):129-132.

[23]Liu J，Li C，Yu Z，et al.Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy[J].Journal Of Genetics And Genomics,2012,39(5): 209-215.

[24]Yu Y,Ye L,Li YG,et al.Heart-specific overexpression of the human short CLC-3 chloride channel isoform limits myocardial ischemia-induced ERP and QT prolongation[J]. International Journal Of Cardiology,2016（214）:218-224.

[25]Zeng JW,Wang XG,Ma MM,et al.Integrin β3 mediates cerebrovascular remodelling through Src/ClC‐3 volume‐regulated Cl channel signalling pathway[J].British Journal Of Pharmacology,2014,171(13):3158-3170.

[26]Larrouture QC,Nelson DJ,Robinson LJ,et al.Chloridehydrogen antiporters ClC‐3 and ClC‐5 drive osteoblast mineralization and regulate fine‐structure bone patterning in vitro[J].Physiological Reports,2015,3(11):e12607.

[27]Wang H,Wang R,Wang Z,et al.ClC-3 chloride channel functions as a mechanically sensitive channel in osteob lasts[J].Biochemistry And Cell Biology,2015,93(6):558-565.

[28]Morgado-Palacin L,Varetti G,Llanos S,et al.Partial loss of Rpl11 in adult mice recapitulates Diamond-Blackfan Anemia and promotes lymphomagenesis[J].Cell Reports, 2015,13(4):712-722.

Construction and Identification of ClC-3 Knockout Mouse

YU Jie1,MAO Jian-wen2,XU Bin1
1.College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China；2.Academic College,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China

Objective To construct and identify the ClC-3 knockout mouse and provide the animal model for researching the biology function of ClC-3 chloride channel protein.Methods 6 ClC-3flox/+mice constructed by the Saiye biotechnology Co.Ltd (Guangzhou)and 2 Ubc-Cre mice introduced by Jackson laboratory were selected from September 2015 to September 2016 were selected for interbreeding thus obtaining the lC-3flox/flox-Cre+and ClC-3flox/+-Cre+mice,Results The generation mice gene was identified by PCR method.The DNA results in the general mice gene group showed that there were stripes at 357 bp and 100 bp,meeting the expected results.Conclusion The paper successfully constructs and identifies the ClC-3 knockout mouse by using the loxp transgenosis ClC-3flox/+mice and Ubc-Cre mice with cre recombinase in expression of the whole body based on the Cre/Loxp system.

ClC-3;Knockout;Cre/Loxp system

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.04

2016-12-15；

2017-01-07

國家自然科學(xué)基金：ClC-3氯通道蛋白非離子通道途徑調(diào)控膜皺褶和有絲分裂的研究（31371144）；廣東省自然科學(xué)基金：氯通道阻斷劑NPPB抑制術(shù)后腹膜粘連的研究（2016A030313741）。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（31371144）and the?Natural Science Foundation of Guangdong Province（2016A030313741）.

余杰（1992.7-），女，湖北宜昌人，碩士，研究方向：離子通道蛋白功能及其靶向藥物篩選。

徐彬（1975.11-），女，四川眉山人，博士，教授，研究方向：離子通道蛋白功能及其靶向藥物篩選，腫瘤分子生物學(xué)與基因治療。E-mail：xubin2003@163.com。