石玉榮，劉 健，陳素蓮，楊 瀅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2. 檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、3. 第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

miR-218對(duì)新藤黃酸抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖作用的影響及機(jī)制研究

石玉榮1，2，劉 健3，陳素蓮1，2，楊 瀅1

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2. 檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、3. 第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

目的研究miR-218對(duì)新藤黃酸抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖作用的影響及其可能的分子機(jī)制。方法人宮頸癌HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)真核表達(dá)載體pmiR-218, real-time PCR檢測HeLa細(xì)胞miR-218的表達(dá)。將HeLa細(xì)胞分為空白對(duì)照組、新藤黃酸組、pmiR-218組、質(zhì)粒對(duì)照組、新藤黃酸聯(lián)合pmiR-218組。MTT法檢測各組細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡；Western blot檢測Bcl-2、Bax、E-cadherin表達(dá)；real-time PCR檢測Bcl-2、Bax和E-cadherin 的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果miR-218真核表達(dá)載體pmiR-218轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miR-218表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。miR-218可提高 HeLa細(xì)胞對(duì)新藤黃酸的敏感性，高表達(dá)miR-218能促進(jìn)新藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)新藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞Bcl-2/ Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論miR-218可提高HeLa細(xì)胞對(duì)新藤黃酸的敏感性，miR-218能增強(qiáng)新藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制作用，并促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào) Bcl-2/Bax的表達(dá)有關(guān)。

新藤黃酸；miR-218；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Bcl-2/Bax

新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)是中藥藤黃中的主要成分之一，基礎(chǔ)研究表明，GNA可抑制胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞增殖[1-3]。微小RNA(microRNAs， miRNAs)是一類長約21～23個(gè)核苷酸序列的單鏈非蛋白編碼的RNA分子，在多種腫瘤中可有異常表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，miRNA-218(miR-218)在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)缺失或低表達(dá)，過表達(dá) miR-218 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，具有抗宮頸癌的作用。本文以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染miR-218真核表達(dá)載體，并聯(lián)合使用GNA，探討miR-218對(duì)GNA抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖作用的影響及機(jī)制，為臨床聯(lián)合應(yīng)用治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。GNA購自中國上海士鋒生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、TRIzol，購自Invitrogen公司；miR-218 Real-time PCR試劑盒，購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT試劑，購于Sigma公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白濃度定量檢測試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光劑，購自Thermo公司；Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-E-cadherin抗體，購自Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購自Promega公司。

1.2Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染pmiR-218對(duì)HeLa細(xì)胞miR-218表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組、pmiR-218組和空質(zhì)粒對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。pmiR-218和空質(zhì)粒的 DNA轉(zhuǎn)染濃度為0.05 mg·L-1。將細(xì)胞以1.5 ×108·L-1接種于24孔板，按 LipofectamineTM2000說明書要求，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，離心收集細(xì)胞，按TRIzol操作說明書提取各組細(xì)胞總RNA。按real-time PCR試劑盒操作說明書要求，檢測細(xì)胞內(nèi) miR-218的表達(dá)水平。用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3MTT法檢測pmiR-218對(duì)GNA抑制HeLa細(xì)胞增殖作用的影響將HeLa細(xì)胞按1×108·L-1接種于96孔板，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，按LipofectamineTM2000操作說明書要求，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組、pmiR-218組。3組細(xì)胞分別加入不同濃度的GNA。GNA濃度為0、0.63、1.25、2.50 、5.0、10.0 mg·L-1。轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行MTT檢測，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測553 nm處各孔的光密度(OD)值。增殖抑制率/%=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100% 。藥物增敏倍數(shù)=單純用藥組的IC50/聯(lián)合用藥組的IC50。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測GNA聯(lián)合pmiR-218對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、GNA組、pmiR-218組、空質(zhì)粒對(duì)照組、 GNA+pmiR-218組。GNA濃度為2.0 mg·L-1。將HeLa細(xì)胞以1.5×108·L-1接種于24 孔板，轉(zhuǎn)染方法同前。48 h后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，按Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書加入試劑，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5Westernblot檢測GNA聯(lián)合pmiR-218對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞提取蛋白，按蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量并校正。取等量蛋白樣品加入樣品裂解液，置沸水中煮5 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。TBST洗膜后，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。TBST脫色，加入二抗，37℃孵育1 h。加入 ECL 顯影，曝光，以β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6qRT-PCR檢測GNA聯(lián)合pmiR-218對(duì)HeLa細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組同前。取5組宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞。按TRIzol操作說明書，提取各組細(xì)胞總RNA。按Real-time PCR試劑盒操作說明書要求，檢測細(xì)胞內(nèi) Bcl-2、Bax、E-cadherin的mRNA表達(dá)水平。用β-actin基因作為內(nèi)參，2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1HeLa細(xì)胞內(nèi)miR-218的相對(duì)表達(dá)水平Fig 1的real-time PCR結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmiR-218 后，細(xì)胞內(nèi) miR-218 的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組和空質(zhì)粒組均明顯增加，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和對(duì)照組相比無明顯變化。表明HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pmiR-218 后，細(xì)胞內(nèi)miR-218 的表達(dá)水平明顯增高。

2.2轉(zhuǎn)染pmiR-218，檢測GNA對(duì)HeLa細(xì)胞的增敏作用單獨(dú)使用GNA，IC50為5.68 mg·L-1，GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用IC50為1.94 mg·L-1(P<0.05) ，增敏倍數(shù)為2.93，兩者聯(lián)用為協(xié)同作用(Tab 1)。提示，高表達(dá)miR-218能夠提高HeLa細(xì)胞對(duì)GNA的藥物敏感性。進(jìn)一步應(yīng)用2.0 mg·L-1GNA和pmiR-218聯(lián)合，用MTT檢測對(duì)細(xì)胞生長的影響。由Tab 2結(jié)果可知，單獨(dú)使用GNA組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染pmiR-218組，對(duì)HeLa細(xì)胞生長均有抑制作用，與空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比，差異有顯著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯(lián)合作用HeLa細(xì)胞，增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，與GNA組和pmiR-218組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 The relative expression level of miR-218 in HeLa cells

*P<0.05vscontrol

Tab 1 Inhibitory effects of gambogenic acidcombined with pmiR-218 on proliferation of HeLa cells

*P<0.05vs0 mg·L-1GNA

Tab 2 Gambogenic acid combined withpmiR-218 on HeLa cell growth

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsgambogenic acid;△P<0.05vspmiR-218

2.4GNA聯(lián)合pmiR-218對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響5組HeLa細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。由Fig 2可見，GNA組和轉(zhuǎn)染pmiR-218組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用組，細(xì)胞凋亡率明顯高于GNA組和pmiR-218組。

2.5Westernblot檢測GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HeLa細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，單獨(dú)使用GNA和轉(zhuǎn)染pmiR-218后，宮頸癌HeLa細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)均較對(duì)照組降低，而Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用后，進(jìn)一步降低HeLa細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)，與單獨(dú)使用GNA和pmiR-218組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6qRT-PCR檢測GNA聯(lián)合pmiR-218對(duì)HeLa細(xì)胞Bcl-2、Bax和E-cadherin基因表達(dá)的影響如Fig 4所示，GNA組和轉(zhuǎn)染pmiR-218組宮頸癌HeLa細(xì)胞Bcl-2的mRNA水平明顯下降，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)；GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌HeLa細(xì)胞，Bcl-2的表達(dá)下降更加明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與GNA組和pmiR-218組相比，差異均有顯著性(P<0.05)；GNA組和轉(zhuǎn)染pmiR-218組Bax和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯(lián)合應(yīng)用組，Bax和E-cadherin的mRNA表達(dá)增加與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)，與GNA和pmiR-218組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218 on apoptosis of cervical cancer HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

Fig 3 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218on expression of Bcl-2, Bax and E-cadherin protein in HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

3 討論

藤黃酸是中藥藤黃的主要成分，在細(xì)胞增殖、侵襲、多藥耐藥方面發(fā)揮抗腫瘤作用，現(xiàn)作為I類新藥，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段?，F(xiàn)代研究證實(shí)，GNA也為藤黃抗腫瘤作用的主要有效成分，在多種癌細(xì)胞系和肝癌小鼠模型中，具有抑制腫瘤生長的作用，且有效治療劑量及毒副作用明顯低于藤黃酸，有望開發(fā)成抗腫瘤新藥。但GNA作為化療藥物單獨(dú)使用，其作用有限，且存在一定的毒副作用，而聯(lián)合用藥可能會(huì)降低GNA的用量，并減少毒副作用，同時(shí)提高其抗腫瘤作用。

Fig 4 Effects of gambogenic acid combinedwith pmiR-218 on mRNA expression of Bcl-2,Bax and E-cadherin in cervical cancer cell line HeLa

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

近年大量的研究顯示，miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs 是一種小分子、非編碼的RNA，通過與靶mRNA的3′UTR結(jié)合，阻礙mRNA翻譯或者誘導(dǎo) mRNA 分解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNA 與腫瘤細(xì)胞形成、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miRNA通過與靶基因RNA堿基配對(duì)，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解RNA或阻礙其翻譯[4]。miRNA在多個(gè)組織中的差異表達(dá)，使表達(dá)圖譜分析成為研究的重點(diǎn)，miRNA在腫瘤耐藥和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[5-6]。將 miRNA與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)miRNA 可以通過調(diào)控抑癌基因、癌基因或凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[7]。

近年來，關(guān)于miR-218在腫瘤中的異常表達(dá)的現(xiàn)象備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤中存在著miR-218表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，如頭頸鱗癌[8]、膀胱癌[9]、鼻咽癌[10]等。現(xiàn)研究證實(shí)，宮頸癌組織中microRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，且其與宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。研究表明，miR-218表達(dá)下調(diào)與HPV感染相關(guān)，miR-218表達(dá)降低與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。我們的前期研究也證實(shí)了miR-218在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-218表達(dá)，可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。

本研究通過將 miR-218的真核表達(dá)載體(pmiR-218)轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中miR-218的表達(dá)，與GNA聯(lián)用后，HeLa細(xì)胞對(duì)GNA的敏感性提高到單獨(dú)使用GNA的2.93倍，兩者表現(xiàn)為協(xié)同抗腫瘤作用。提示兩者聯(lián)合使用較單獨(dú)使用GNA具有更強(qiáng)的抗宮頸癌效果。

GNA和pmiRNA-218共同作用于宮頸癌細(xì)胞，探討二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)宮頸癌的抗腫瘤作用。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，單獨(dú)使用GNA和轉(zhuǎn)染pmiR-218均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。兩者聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)用藥組明顯增加，提示GNA轉(zhuǎn)染pmiR-218的協(xié)同抗腫瘤作用可能與共同誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)。

細(xì)胞凋亡與多種細(xì)胞因子表達(dá)異常相關(guān)。Bax基因是人體最主要的抗凋亡基因，屬于Bcl-2 基因家族，編碼的Bax 蛋白可與Bcl-2 形成異二聚體，對(duì)Bcl-2 產(chǎn)生阻抑作用。研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，因此認(rèn)為，Bax是重要的促細(xì)胞凋亡基因之一[13-14]。本研究結(jié)果顯示，GNA和pmiR-218兩者聯(lián)合應(yīng)用后，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，較單獨(dú)用藥組相比，差異有顯著性。qRT-PCR結(jié)果亦顯示，兩者聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步上調(diào)Bax基因表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。這些結(jié)果均提示，轉(zhuǎn)染pmiR-218聯(lián)合GNA的協(xié)同抗腫瘤作用，可能與共同誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)。

發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤靶點(diǎn)、開發(fā)特異性的靶向抗腫瘤藥物，并與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合應(yīng)用，在當(dāng)今腫瘤治療研究中顯示出良好的發(fā)展前景。本研究將GNA與靶向miRNA技術(shù)聯(lián)合使用，提高HeLa細(xì)胞對(duì)GNA的敏感性，為靶向基因治療與傳統(tǒng)化療聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為宮頸癌的輔助治療提供新的思路。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！)

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InhibitingeffectsofgambogenicacidincombinationwithmiR-218oncervivalcancerHeLacellsanditsmechanisms

SHI Yu-rong1,2, LIU Jian3, CHEN Su-lian1,2, YANG Ying1

(1.DeptofBiochemistryandMolecularBiology; 2.ResearchCenterofClinicalDiagnosticsLab;3.DeptofOncologicalSurgery;BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233003,China)

AimTo study the inhibitory effects of gambogenic acid in combination with miR-218 on cervical cancer HeLa cells and its mechanisms.MethodsEukaryotic expression vector of miR-218(pmi8-218) was transfected into HeLa cells. Transcript levels of miR-218 were quantified by real-time quantitative PCR. HeLa cells were incubated with different concentrations of gambogenic acid alone or in combination with pmiR-218. The cell growth inhibiting ratio of HeLa cells was assessed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by fluorescence activated cell sorting. The expression levels of Bcl-2, Bax and E-cadherin were measured by Western blot and qRT-PCR.ResultsLevels of miR-218 transcript significantly increased in pmiR-218 transfected HeLa cells. Overexpression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid. Over expression of miR-218 could enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation, promoting apoptosis of HeLa cells. pmiR-218 could enhance the regulation of Bax expression and decrease the expression of Bcl-2 in HeLa cells.ConclusionsOver expression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid; miR-218 can enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation and promote the apoptosis of HeLa cells, and the mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2/Bax expression.

gambogenic acid; miR-218; HeLa cells; proliferation; apoptosis; Bcl-2/ Bax

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.015

A

：1001-1978(2017)10-1405-05

R284.1；R329.24；R329.25；R394.2；R737.330.22

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.030.html

2017-05-16,

2017-06-28

安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No KJ2014A162)

石玉榮(1974-)，女，碩士，副教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，通訊作者，E-mail: shiyr@126.com