李雪　雷雪雪　徐紅丹

[摘要] 目的 采用高通量細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)分析桃葉珊瑚苷干預(yù)光老化ESF-1細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制和有效作用靶點(diǎn)。 方法 細(xì)胞UVA損傷模型法制備光老化細(xì)胞模型，給予低中高不同劑量的桃葉珊瑚苷DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞所含總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性和含量評(píng)價(jià)光老化ESF-1細(xì)胞模型的氧化損傷情況及桃葉珊瑚苷對(duì)模型的干預(yù)作用。在此基礎(chǔ)上基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)正常細(xì)胞、光老化細(xì)胞及桃葉珊瑚苷干預(yù)后的細(xì)胞進(jìn)行高通量的代謝足跡分析。通過(guò)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)海量的數(shù)據(jù)采取降維處理和多元統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 與空白組相比，模型組細(xì)胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P < 0.01）；與模型組相比，給藥組能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。光老化細(xì)胞代謝與空白組細(xì)胞存在顯著性差異，發(fā)生擾亂的代謝主要集中在花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝。通過(guò)聚焦分析發(fā)現(xiàn)了6個(gè)核心的生物標(biāo)志物，且這些小分子代謝產(chǎn)物在給予桃葉珊瑚苷干預(yù)后都發(fā)生了有效的回調(diào)。 結(jié)論 桃葉珊瑚苷對(duì)光老化有很好的治療作用，其作用機(jī)制可能與花生四烯酸代謝機(jī)制相關(guān)，本研究為早期預(yù)防和藥物研發(fā)提供了新思路和新方法。

[關(guān)鍵詞] 代謝組學(xué)；模式識(shí)別；桃葉珊瑚苷；光老化；生物標(biāo)志物

[中圖分類號(hào)] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（a）-0025-05

[Abstract] Objective To analyze the mechanism and effective target of aucubin intervene photoaging ESF-1 cells by high through-put cell metabolomics. Methods Cell photoaging model was established by UVA cell injury method， then given low medium and high dose aucubin DMEM medium for the intervention. The activities and contents of total superoxide dismutase （T-SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT）， malondialdehyde （MDA） were detected for the evaluation of oxidative damage and aucubin treatment effect. Based on above analysis and high resolution mass spectrometry， the high throughput metabolic footprint analysis was conducted in the normal cells， photoaging ESF-1 cells and aucubin intervention cell. Massive metabolic data were analzyed with dimension reduction process and multivariate statistics by model discriminating technique. Results Compared with the blank group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT significantly decreased and contents of MDA significantly increased in the model group （P < 0.01）. Compared with the model group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT increased and contents of MDA decreased in the medication gorups， of which， in the medium and high doses medication groups the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. There were significant differences in the metabolism between the normal cells and the photoaging ESF-1 cells， and the disturbance of metabolism was mainly concentrated in arachidonic acid metabolism， glutathione metabolism. 6 core biomarkers were identified by focusing analysis， and these small molecular metabolites were callback after the administration of aucubin. Conclusion Aucubin has a favorable effect on photoaging， and the mechanism may be related to arachidonic acid metabolism. Besides， the present investigation provides new ideas and methods for early prevention and drug development.endprint

[Key words] Metabolomics； Pattern recognition； Aucubin； Photoaging； Biomarker

隨著環(huán)境的日益惡化及大氣層的破壞，輻射地球的紫外光（UV）照射強(qiáng)度越來(lái)越大，這致使其對(duì)皮膚組織的氧化損傷日益嚴(yán)重，并導(dǎo)致光老化等一系列皮膚問(wèn)題[1-6]。目前，UV輻射對(duì)健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境與健康問(wèn)題之一，從天然產(chǎn)物中提取有效成分對(duì)其進(jìn)行干預(yù)也是防止光老化的熱點(diǎn)研究之一[7-17]。杜仲藥材為金縷梅亞綱、杜仲目、杜仲科、杜仲屬植物的干燥莖皮，在我國(guó)有2000余年的藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。相關(guān)研究表明，杜仲對(duì)由紫外照射的皮膚光老化有很好的保護(hù)作用。桃葉珊瑚苷作為杜仲有效成分，具有保肝、抗癌、解毒、抗氧化等功效。本研究基于高通量的代謝組學(xué)技術(shù)靶向性分析杜仲所含有效成分桃葉珊瑚苷對(duì)光老化ESF-1細(xì)胞干預(yù)作用，為闡明光老化代謝機(jī)制和桃葉珊瑚苷作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX Triple QuadTM3500（美國(guó)AB SCIEX公司），XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多），RT-9000半自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雷杜公司），人皮膚成纖維細(xì)胞ESF-1（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心），DMEM培養(yǎng)基，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程公司），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程公司），過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程公司），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程公司），桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海銳谷生物科技有限公司）。

1.2 給藥溶液配制

將桃葉珊瑚苷加入DMEM培養(yǎng)液中，配制成高（4×10-5 mol/L）、中（4×10-6 mol/L）、低（4×10-7 mol/L）3個(gè)濃度，調(diào)pH值為7.0，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.3 ESF-1細(xì)胞體外培養(yǎng)

ESF-1細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的10%胎牛血清DMEM。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以胰酶消化，調(diào)整其密度為1×106個(gè)/mL接種于6孔板、5×104個(gè)/mL接種于96孔板。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞UVA損傷模型的建立 參考文獻(xiàn)[18]方法，空白組給予遮蔽處理。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組、給藥組?？瞻捉M細(xì)胞給予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組和給藥組細(xì)胞給予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行模型制備，且給藥組給予含不同濃度（4×10-5、4×10-6、4×10-7 mol/L）桃葉珊瑚苷的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 氧化損傷指標(biāo)檢測(cè) 給藥24 h后收集6孔板中各組細(xì)胞，用冷PBS清洗2次，超聲破碎，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明流程檢測(cè)細(xì)胞所含總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性及含量。

1.4.4 細(xì)胞提取 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，以生理鹽水清洗細(xì)胞3遍，液氮淬滅后加入1.5 mL的甲醇-水（4∶1，v/v）溶液，細(xì)胞刮刀取下細(xì)胞，并置入1.5 mL離心管中渦旋，超聲破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎后4℃ 4000 r/min離心15 min。取上清液氮?dú)獯蹈桑?00 μL 0.1%甲酸復(fù)溶。

1.4.5 分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集團(tuán)公司，美國(guó)）；流動(dòng)相分別為0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液；柱溫40℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；色譜梯度為0～10 min，50%B～60%B、10～13 min，60%～65%B、13～15 min，65%～99%B。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），ESI+模式毛細(xì)管電壓設(shè)定為3.0 kV，錐孔電壓為30 V；ESI-模式毛細(xì)管電壓設(shè)定為3.0 kV，錐孔電壓為30 V。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理及生物標(biāo)志物鑒定 原始數(shù)據(jù)通過(guò)代謝組學(xué)最新權(quán)威數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)XCMS進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，對(duì)色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊、歸一化等基礎(chǔ)性處理后，導(dǎo)入SIMCA-13用于模式識(shí)別運(yùn)算，結(jié)合VIP值篩選對(duì)分組貢獻(xiàn)率大的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物。最終通過(guò)Metline、HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和比對(duì)以鑒定生物標(biāo)志物。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桃葉珊瑚苷對(duì)ESF-1細(xì)胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

UVA照射及不同劑量桃葉珊瑚苷對(duì)ESF-1細(xì)胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響見(jiàn)表1。與空白組相比，模型組細(xì)胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P < 0.01）；與模型組相比，給藥組能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 代謝組學(xué)研究

主成分分析得分圖顯示，空白組、模型組和高、中、低給藥組的組內(nèi)聚類良好，組間分離明顯（圖1）?？瞻捉M和模型組組間分離明顯，證明兩組細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有極大差異，可能由光老化因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。發(fā)生擾亂的代謝主要集中在花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝。不同劑量給藥組處于空白組和模型組之間，證明藥物的干預(yù)對(duì)光老化細(xì)胞有很好的回調(diào)作用。endprint

采用正交偏最小二乘判別分析篩選空白組和模型組組間對(duì)分組具有顯著性貢獻(xiàn)的小分子代謝產(chǎn)物作為潛在生物標(biāo)志物（圖2～3）。選取重要變量投影值>3，進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行比對(duì)，鑒定了6個(gè)光老化潛在生物標(biāo)志物，根據(jù)細(xì)胞代謝所涉及的生物學(xué)信息構(gòu)建光老化ESF-1細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

3 討論

隨著環(huán)境污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重，紫外光輻射等問(wèn)題日益加劇，這其中光老化是嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的重要因素之一。單純從皮膚表面增白角度入手難以達(dá)到根治，中藥因多成分多靶點(diǎn)協(xié)同起效、副作用小等優(yōu)勢(shì)在治療慢性病或調(diào)解亞健康狀態(tài)方面有很好的效果。近年來(lái)應(yīng)用杜仲干預(yù)由紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化效果明顯，且國(guó)內(nèi)外研究表明花生四烯酸代謝與光老化密切相關(guān)[19-21]。目前已知白三烯（LTB4）是參與光老化過(guò)程中的重要炎癥介質(zhì)[22]，其經(jīng)5-LOX代謝后產(chǎn)生花生四烯酸，即為花生四烯酸產(chǎn)生的限速酶。皮膚角質(zhì)層細(xì)胞由于缺乏5-LOX，不能單獨(dú)產(chǎn)生LTB4。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫外線可能作為誘導(dǎo)5-LOX增加的因素，使LTB4升高，導(dǎo)致花生四烯酸含量代謝異常。

谷胱甘肽代謝為本次發(fā)現(xiàn)的重要通路之一，結(jié)合GSH-Px試劑盒活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光老化細(xì)胞內(nèi)的還原性谷胱甘肽酶活性不高，這可能與紫外光輻射后胞內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷有關(guān)[23-30]。大量的還原態(tài)代謝酶用于修復(fù)氧化性損傷，故活性降低，細(xì)胞代謝組學(xué)研究與試劑盒結(jié)果相一致，推斷上述代謝機(jī)制發(fā)生與光老化密切相關(guān)。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，因其具有的整體性、動(dòng)態(tài)性與中醫(yī)藥理論相一致，近年來(lái)在解讀中醫(yī)藥癥候理論和方劑配伍作用方面有較為廣泛的應(yīng)用。本研究首次依托細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)針對(duì)性研究紫外線誘導(dǎo)的光老化ESF-1細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制，以期為光老化藥物作用靶點(diǎn)研究和相關(guān)產(chǎn)品的基礎(chǔ)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-05-02 本文編輯：程 銘）endprint