賈琳　江龍

[摘要] 目的 對(duì)金蟬止癢顆粒建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 對(duì)金蟬止癢顆粒中梔子、苦參、黃柏藥材采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別；對(duì)鹽酸小檗堿、蛇床子素采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。 結(jié)果 薄層色譜專屬性強(qiáng)，分離度高，陰性對(duì)照無(wú)干擾；高效液相色譜法測(cè)得鹽酸小檗堿、蛇床子素分別在0.00648～0.1296 μg（r=0.9996）、0.0045～0.1125 μg（r=0.9996）范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.16%、99.22%，RSD分別為1.21%、1.33%，測(cè)得含量分別為0.1135、0.0310 mg/g。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠很好地對(duì)金蟬止癢顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 金蟬止癢顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；梔子；苦參；黃柏；鹽酸小檗堿；蛇床子素

[中圖分類號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（a）-0042-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Jinchanzhiyang Granules. Methods The contents of Gardenia jasminoides Ellis， Sophora flavescens， Phellodendron amurense Rupr. in Jinchanzhiyang Granules were identified by using thin layer chromatography （TLC） method. The contents of Berberine， Osthole were determined by high performance liquid chromatography （HPLC） method. Results TLC had strong specificity and high separation. Negative control without interference. The linear range was 0.00648-0.1296 μg for Berberine （r=0.9996） and 0.0045-0.1125 μg for Osthole （r=0.9996） respectively. The average recovery was 99.16% （RSD=1.21%）， 99.22% （RSD=1.33%） respectively. the content of Berberine and Osthol was 0.1135， 0.0310 mg/g respectively. Conclusion The method is accurate and simple， and can be used for the quality control of Jinchanzhiyang Granules.

[Key words] Jinchanzhiyang Granules； Quality standard； Gardenia jasminoides Ellis； Sophora flavescens； Phellodendron amurense Rupr.； Berberine； Osthole

金蟬止癢顆粒由金銀花、黃柏、蛇床子、梔子、苦參、黃芩等十六味中藥組成。適用于夏季皮炎，丘疹性蕁麻疹等皮膚瘙癢癥狀的治療，具有清熱解毒、燥濕止癢的功效。在其含量測(cè)定方面，未見(jiàn)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鹽酸小檗堿、蛇床子素的報(bào)道。本文采用高效液相色譜法測(cè)定金蟬止癢顆粒中鹽酸小檗堿、蛇床子素的含量。結(jié)合薄層色譜法對(duì)組方中梔子、苦參、黃柏進(jìn)行定性鑒別。進(jìn)一步提高金蟬止癢顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

日本島津SCL-10AVP，LC-10ATVP高效液相色譜儀，Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；KQ5200B超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），TDD5m多管低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）。梔子苷、苦參對(duì)照品、鹽酸小檗堿、蛇床子素（均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)分別為110749-200714、121019-200605、 110713-200911、110822-200407）。金蟬止癢顆粒（重慶希爾安藥業(yè)有限公司；規(guī)格：8 g/袋，批號(hào)：130102、130301、130401、130404）。試劑（成都科龍化工試劑廠）：乙腈、甲醇均為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其余試劑均為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 梔子的薄層色譜鑒別 供試品溶液：取樣品20 g，加水40 mL使溶解，用乙醚提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水溶液用氫氧化鈉試液調(diào)pH值至8～9，用正丁醇提取3次，每次10 mL，合并提取液，每次用10 mL含量為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液洗滌共2次，棄去洗滌液，蒸干正丁醇提取液，加甲醇1 mL使殘?jiān)芙?。?duì)照品溶液：取梔子苷對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含2 mg的溶液。根據(jù)薄層色譜法[1]，將上述兩種溶液分別取10 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，正丁醇-醋酸-水（6∶2∶0.25）作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，用5%香草醛硫酸溶液噴霧，吹熱空氣[2-3]。相同顏色的斑點(diǎn)顯示在供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上（圖1）。

2.1.2 黃柏的薄層色譜鑒別 供試品溶液：取樣品10 g，加水20 mL使溶解，加濃氨溶液0.3 mL，用氯仿提取3次，每次10 mL，將提取液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解。對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成含量為0.1 mg/L的溶液。根據(jù)薄層色譜法[1]，將上述兩種溶液分別取5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，正丁醇-醋酸-水（6∶2∶0.25）作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置UV光（波長(zhǎng)365 nm）下檢視[4]。相同顏色的黃色熒光斑點(diǎn)顯示在供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上（圖2）。endprint

2.1.3 苦參的薄層色譜鑒別 供試品溶液：取鑒別“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液。對(duì)照藥材溶液：取苦參對(duì)照藥材0.5 g，加濃氨試液0.3 mL，氯仿25 mL，振搖提取4 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解[5]。根據(jù)薄層色譜法[1]，將上述兩種溶液分別取10 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，苯-丙酮-醋酸乙酯-濃氨試液（2∶3∶4∶0.2）作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，用稀碘化鉍鉀試液噴霧。相同顏色的橘黃色斑點(diǎn)顯示在供試品與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上（圖3）。

2.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.2.1 高效液相色譜條件 Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（50∶20∶30）（內(nèi)含0.1%十二烷基磺酸鈉及0.1%磷酸溶液）；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，柱溫為32℃。

2.2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：將鹽酸小檗堿對(duì)照品精密稱取適量置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，恒定體積（0.00648 mg/mL）。供試品溶液：精密稱取樣品約2 g置錐形瓶中，精密加入含量60%甲醇50 mL，稱重，超聲波處理30 min（不低于200 W），取出，放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，高速離心（10 000 r/min）10 min，上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液[6-7]。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取缺黃柏的陰性樣品約2 g，陰性供試品溶液按“2.2.2”項(xiàng)方法制備。在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，陰性樣品色譜圖中無(wú)相應(yīng)特征峰，方法專屬性良好[8]。鹽酸小檗堿分離度>1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)不低于5000，滿足定量分析要求（圖4）。

2.2.4 線性關(guān)系考察 吸取對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20 μL，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mAU·min）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.00648～0.1296 μg范圍內(nèi)與峰面積之間線性關(guān)系良好[9-10]?；貧w方程為Y=2495021.87X-7705.76，r=0.9999（n=7）。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，每次10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為250583、252411、249662、251269、248975、 251351，RSD為0.50% 。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，在室溫下放置0、3、5、7、9、12 h，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得鹽酸小檗堿峰面積分別為256874、258340、269465、253215、265422，RSD為2.54%，說(shuō)明在12 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：130403）樣品6份，供試品溶液按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得鹽酸小檗堿含量分別為0.1447、0.1508、0.1469、0.1483、0.1434、0.1468 mg/g，RSD為1.78%。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：130403）已知含量樣品9份，分成3組，每組分別添加低、中、高濃度鹽酸小檗堿對(duì)照品，供試品溶液按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率[11]，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 含量測(cè)定 供試品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)3批金蟬止癢顆粒樣品測(cè)定分析，根據(jù)峰面積計(jì)算每批樣品中鹽酸小檗堿含量分別為0.1077、0.1312、0.1016 mg/g，即測(cè)得鹽酸小檗堿含量為0.1135 mg/g。

2.3 蛇床子素含量測(cè)定

2.3.1 高效液相色譜條件 Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水（49∶51）；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm，柱溫為25℃。

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：將蛇床子素對(duì)照品精密稱定0.0045 g至100 mL棕色量瓶，加甲醇稀釋至刻度（0.045 mg/mL）。供試品溶液：取樣品約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇25 mL，超聲提取30 min（不低于200 W），過(guò)濾，濾液揮干，加甲醇5 mL，完全溶解，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)[12-13]，取續(xù)濾液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 取缺蛇床子的陰性樣品約2 g，陰性供試品溶液按“2.3.2”項(xiàng)方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，陰性樣品色譜圖中無(wú)相應(yīng)特征峰，方法專屬性良好。蛇床子素分離度>1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)不低于4000，滿足定量分析要求（圖5）。

2.3.4 線性關(guān)系考察 吸取對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20 μL，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mAU·min）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果蛇床子素進(jìn)樣量在0.0045～0.1125 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好[14]?；貧w方程為Y=22956.74X-8165.36，r=0.9999（n=7）。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，每次10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為503945、506527、505570、504399、504268、 501947，RSD為0.31%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，在室溫下放置0、3、5、7、9、12 h，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得蛇床子素峰面積分別為452087、456390、454766、455378、455065、453786，RSD為0.33%。說(shuō)明在12 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。endprint

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：130403）樣品6份，供試品溶液按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得蛇床子素分別為0.0319、0.0306、0.0299、0.0286、0.0311、0.0304 mg/g，RSD為3.67%。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：130403）已知含量樣品9份，分成3組，每組分別添加低、中、高濃度蛇床子素對(duì)照品，供試品溶液按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率[15]。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.9 含量測(cè)定 供試品溶液按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)3批金蟬止癢顆粒樣品測(cè)定分析，根據(jù)峰面積計(jì)算每批樣品中蛇床子素含量分別為0.0313、0.0299、0.0319 mg/g，即測(cè)得蛇床子素含量為0.0310 mg/g。

3 討論

鹽酸小檗堿在標(biāo)準(zhǔn)方法色譜條件下的峰型存在拖尾現(xiàn)象[16-17]。鹽酸小檗堿作為堿性季銨型類生物堿，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相中水相和有機(jī)相的比例，并加入緩沖溶液在流動(dòng)相中，可以解決峰型拖尾問(wèn)題；故本試驗(yàn)調(diào)整流動(dòng)相為：甲醇-乙腈-水（50∶20∶30）（內(nèi)含0.1%十二烷基磺酸鈉及0.1%磷酸溶液）；配合色譜柱、柱溫、流速等條件，鹽酸小檗堿的峰型較好，其理論塔板數(shù)和分離度均良好。

本試驗(yàn)對(duì)蛇床子素在200～400 nm進(jìn)行全掃描，在203、322 nm波長(zhǎng)處蛇床子素有較強(qiáng)的紫外吸收，經(jīng)比較采用322 nm時(shí)，雜質(zhì)峰數(shù)量較少，基線較好，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，故選用322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。有文獻(xiàn)[18]報(bào)道，蛇床子素見(jiàn)光易分解，其分解速度在避光保存的情況下顯著減慢，因此本試驗(yàn)的樣品在試驗(yàn)前臨時(shí)處理，并對(duì)蛇床子素采用避光操作。

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（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：李亞聰）endprint