王向輝， 黃江平， 崔豐和， 錢海云

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院心胸大血管外科， 湖北 荊州 434020)

微小 RNA-138-5p抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的機制研究

王向輝△， 黃江平， 崔豐和， 錢海云

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院心胸大血管外科， 湖北 荊州 434020)

目的： 探討微小RNA-138-5p(miR-138-5p)抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的相關機制。方法: 以肺癌細胞A549和H460作為研究對象，分別轉染miR-NC(對照組)或miR-138-5p(實驗組)；生物信息學技術預測miR-138-5p的靶基因；RT-qPCR檢測轉染后細胞miR-138-5p、叉頭框蛋白C1(FOXC1)mRNA和波形蛋白(vimentin) mRNA的相對表達量；Western blot法檢測FOXC1、vimentin、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin蛋白表達變化；MTS法和集落形成實驗分別檢測細胞的增殖能力；劃痕愈合實驗和Transwell 法檢測細胞遷移和侵襲能力。結果: miR-138-5p過表達顯著降低FOXC1和vimentin的mRNA及蛋白的表達(P<0.05)，E-cadherin和β-catenin蛋白表達上調，N-cadherin蛋白表達下調，顯著抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力(P<0.05)。結論: miR-138-5p 可以通過靶向干擾FOXC1和vimentin的表達抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，可能是肺癌基因治療的潛在靶點。

微小RNA-138-5p; 叉頭框蛋白C1； 波形蛋白； 肺癌

肺癌是世界死亡率最高的癌癥之一，盡管診斷方法、外科手術和放化療技術近年來有很大的進展，但由于肺癌細胞具有高度的增殖、轉移能力導致肺癌患者的預后依舊很差[1]。有效的分子靶向治療成為肺癌研究的熱點[2]。越來越多的證據(jù)表明微小RNA(microRNA，miRNA)的失調在各種腫瘤發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3]。 miR-138-5p是miR-138 家族成員之一[4]，其對肺癌細胞生物學行為的影響未見報道。本研究以人肺癌細胞A549和H460為研究對象，觀察 miR-138-5p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討其可能的分子機制。

材料和方法

1材料

肺癌細胞系A549和H460購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；miR-138-5p 模擬物和miR-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)；脂質體Lipofectamine 2000(Invitrogen)；RT-qPCR試劑盒和MTS細胞活力試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；抗GAPDH、叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1)、波形蛋白(vimentin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(Cell Signaling)；辣根過氧化物酶標記的 II 抗(武漢博士德生物有限公司)；ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術有限公司)。

2方法

2.1miR-138-5p靶基因預測 通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_61/)并結合文獻報道[4]，我們認為miR-138-5p可能的靶基因為FOXC1和vimentin，具體序列互補見圖1。

Figure 1. The binding site of miR-138-5p in the target gene 3’UTR.

圖1miR-138-5p與目的基因3’UTR的結合位點

2.2細胞培養(yǎng)和轉染 采用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細胞A549和H460，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以處于對數(shù)生長期的肺癌細胞為轉染對象，根據(jù)脂質體Lipofectamine 2000試劑說明書分別轉染miR-NC(對照組)和miR-138-5p(實驗組)至肺癌細胞。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3RT-qPCR檢測mRNA 的表達 轉染48 h，按照TRIzol試劑說明書提取總 RNA，逆轉錄合成 cDNA，以U6或GAPDH為內參照，使用RT-qPCR試劑盒進行擴增并采用2-ΔΔCt方法計算各組細胞miR-138-5p、FOXC1 mRNA和vimentin mRNA 的相對表達量，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.4Western blot法檢測蛋白表達水平 轉染48 h收集細胞，用含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解 30 min，提取總蛋白。依次完成10% SDS-PAGE，電轉移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉，4 ℃下 I 抗孵育過夜，室溫下 II 抗孵育1 h，ECL顯影檢測目的蛋白表達水平。

2.5MTS實驗檢測細胞活力 轉染后24 h，消化吹打細胞，制成單細胞懸液，以每孔3 000個細胞接種于96孔板。于鋪板后1、2、3、4和5 d分別采用MTS細胞活力試劑盒進行檢測，繪制生長曲線。具體方法為每孔加入110 μL MTS稀釋液，放回培養(yǎng)箱孵育2 h；清除氣泡，酶標儀讀取每孔在490 nm波長處吸光度(A)。

2.6集落形成實驗 轉染后24 h，消化吹打細胞，制成單細胞懸液。以每孔1 000個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)10 d后，采用多聚甲醛固定和結晶紫染色，空氣干燥后計數(shù)。集落形成率=集落數(shù)/接種的細胞數(shù)×100%。

2.7劃痕愈合實驗 消化收集各組細胞，接種 6 孔板，待細胞鋪滿孔底，用200 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS 洗滌 3 次，加入無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。于0 h、12 h和24 h觀察拍照。劃痕愈合率(%)=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.8Transwell實驗 消化收集各組細胞，分別使用無血清培養(yǎng)基制成濃度為1×108cells/L的細胞懸液，在Transwell 小室的上室中加入細胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。 取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿膜細胞和基質膠，甲醇固定15 min，0.1%結晶紫溶液染色30 min。鏡下(×100)隨機選取4個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取平均值。

3統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1轉染后細胞miR-138-5p、FOXC1mRNA和vimentinmRNA的表達

對照組和實驗組轉染后A549細胞中miR-138-5p的表達量分別為1.03±0.28和18 513.12±8 391.65 (t=4.41,P<0.01)，實驗組中FOXC1和vimentin的mRNA表達分別降低約45.5%(t=3.40,P<0.05)和27.1%(t=3.03,P<0.05)；對照組和實驗組H460細胞中miR-138-5p的表達量分別為1.01±0.16和25 629.68±4 610.69 (t=11.12,P<0.01)，實驗組中FOXC1和vimentin的mRNA表達分別降低約65.6%(t=3.61,P<0.05)和52.7% (t=3.53,P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The mRNA expression levels of FOXC1 and vimentin. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖2FOXC1和vimentin的mRNA表達水平

2靶基因及EMT相關蛋白的表達

與對照組相比，過表達miR-138-5p后，肺癌細胞中FOXC1、vimentin和N-cadherin蛋白的表達均明顯降低，E-cadherin和β-catenin蛋白的表達明顯升高，見圖3。

3MTS法檢測細胞活力的變化

與對照組相比，過表達miR-138-5p的A549和H460細胞活力在第5天均有顯著差異(t=2.84,P<0.05；t=4.74,P<0.01)，提示miR-138-5p能抑制肺癌細胞活力，見圖4。

4集落形成實驗的結果

對照組和實驗組A549細胞的集落形成率分別為0.94%±0.36%和1.89%±0.48%(t=3.12,P<0.05)，H460細胞的集落形成率分別為1.38%±0.23%和2.18%±0.51%(t=2.86,P<0.05)。過表達 miR-138-5p組細胞集落形成率明顯降低，結合細胞活力的變化，表明miR-138-5p能抑制肺癌細胞的體外增殖能力，見圖5。

5劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

對照組和實驗組中A549細胞的劃痕愈合率分別為66.73%±16.30%和37.87%±10.18%(t=3.00,P<0.05)，H460細胞的劃痕愈合率分別為60.36%±9.07%和33.06%±14.03%(t=3.27,P<0.05)。過表達 miR-138-5p組細胞劃痕愈合率明顯降低，表明miR-138-5p能抑制肺癌細胞的體外遷移能力，見圖6。

6Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

對照組和實驗組A549細胞的穿膜細胞數(shù)分別為85±19和28±14 (t=4.91,P<0.05)，H460細胞的穿膜細胞數(shù)分別為64±19和24±9 (t=3.72,P<0.05)。過表達 miR-138-5p組的穿膜細胞數(shù)明顯降低，表明miR-138-5p能抑制肺癌細胞的體外侵襲能力，見圖7。

討 論

miRNA是一類長約22個核苷酸的內源性非編碼RNA，miRNA的產(chǎn)生首先由初級轉錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細胞核中被RNase III (Drosha)切割形成前體 miRNA(pre-miRNA)，經(jīng)轉運蛋白Exportin 5轉運到細胞質，再由RNase III Dicer切割形成成熟的 miRNA[5]。miRNA通過不完全互補配對結合于靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3’UTR)，形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，抑制mRNA的翻譯或者直接誘導mRNA的降解[6]。miRNA 廣泛參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學行為，在近些年的生命科學研究中，miRNA的研究已經(jīng)成為生命科學最熱門的研究領域之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可抑制多種腫瘤的惡性生物學行為，比如miR-138-5p可通過靶向干擾SIRT1的表達抑制胰腺癌細胞的自噬[8]。在膀胱癌細胞中，miR-138-5p可通過干擾凋亡抑制蛋白家族成員survivin的表達抑制細胞的增殖和侵襲能力[9]。miR-138-5p可逆轉包括白血病細胞、肺癌細胞的多藥耐藥性[10-11]。在肝癌細胞中，miR-138-5p通過干擾SOX9的表達，阻滯細胞周期的進展，抑制肝癌細胞的增殖[12]。miR-138-5p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及分子機制值得研究。

Figure 3. The expression levels of miR-138-5p target proteins and EMT-related proteins. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖3miR-138-5p靶蛋白及EMT相關蛋白的表達水平

Figure 4. The viability of A459 cells and H460 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖4轉染后A459和H460細胞活力的變化

Figure 5. The effect of miR-138-5p on the colony formation capacity of lung cancer cells (crystal violet staining). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖5miR-138-5p對肺癌細胞集落形成能力的影響

Figure 6. The effect of miR-138-5p on the migration ability of lung cancer cells (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖6miR-138-5p對肺癌細胞遷移能力的影響

Figure 7. The effect of miR-138-5p on the invasion ability of the lung cancer cells (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsmiR-NC group.

圖7miR-138-5p對肺癌細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色)

miR-138-5p的靶基因鑒定是其功能研究的關鍵。我們參考文獻報道[4]，并結合miRNA靶基因預測網(wǎng)站microRNA.org和TargetScan，確定miR-138-5p的靶基因為FOXC1和vimentin。FOXC1屬于 FOXC 亞族，通過抑制腫瘤細胞的增殖參與調控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。Vimentin能促進細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，與腫瘤細胞的遷移、侵襲及耐藥密切相關[14]。EMT過程主要表現(xiàn)為上皮細胞失去自身極性與特性，向間質細胞轉化，EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的主要生物學機制，E-cadherin和β-catenin蛋白屬于上皮表型，N-cadherin屬于間充質表型，均與EMT過程密切相關[15-17]。本研究中，過表達miR-138-5p后，肺癌細胞中FOXC1和vimentin蛋白表達水平明顯下降，MTS實驗和集落形成實驗顯示肺癌細胞的活力和增殖能力下降，表明miR-138-5p可能通過干擾FOXC1的表達抑制肺癌細胞的增殖。同時，肺癌細胞EMT相關蛋白E-cadherin和β-catenin表達上調，N-cadherin表達下調，提示肺癌細胞EMT過程被抑制；劃痕愈合實驗和Transwell小室實驗顯示肺癌細胞遷移和侵襲能力顯著下降，表明miR-138-5p可能通過干擾vimentin的表達抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-138-5p 可能通過靶向干擾FOXC1和vimentin的表達抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，為以 miR-138-5p為治療靶點的肺癌分子靶向治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。我們下一步將通過收集臨床肺癌組織標本，觀察miR-138-5p表達水平與患者腫瘤病理分期及預后的相關性，研究miR-138-5p在肺癌患者中的生物學標志價值。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Mechanism of microRNA-138-5p inhibiting proliferation, migration and invasion of lung cancer cells

WANG Xiang-hui, HUANG Jiang-ping, CUI Feng-he, QIAN Hai-yun

(Department of Cardiothoracic Surgery, Jingzhou Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Jingzhou 434020, China. E-mail: jzyywxh@163.com)

AIM: To investigate the mechanism of microRNA-138-5p (miR-138-5p) inhibiting the proliferation, migration and invasion abilities of lung cancer cells.METHODS: The lung cancer A549 and H460 cells were transfected with miR-NC (control group) or miR-138-5p (experimental group). The bioinformatic analysis was performed to predict the target genes of miR-138-5p.The expression levels of miR-138-5p, forkhead box protein C1 (FOXC1) mRNA and vimentin mRNA were detected by RT-qPCR. The protein expression of FOXC1, vimentin, E-cadherin, N-cadherin and β-catenin was determined by Western blot. MTS method and colony formation assay were used to detect cell viability and proliferation ability. Wound healing assay and Transwell assay were used to detect cell migration and invasion ability.RESULTS: Over-expression of miR-138-5p significantly reduced the expression of FOXC1 and vimentin at mRNA and protein levels (P<0.05). The expression of E-cadherin and β-catenin were up-regulated and the expression of N-cadherin was down-regulated. The proliferation, migration and invasion abilities of the lung cancer cells were inhibited by the over-expression of miR-138-5p.CONCLUSION: miR-138-5p inhibits the proliferation, migration and invasion abilities of lung cancer cells by targeting FOXC1 and vimentin. It may be a potential target for lung cancer gene therapy.

MicroRNA-138-5p; Forkhead box protein C1; Vimentin; Lung cancer

1000- 4718(2017)09- 1631- 06

2017- 03- 22 [

] 2017- 06- 20

R734.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.016

△通訊作者 Tel： 18107168104； E-mail： jzyywxh@163.com