賈宵宵， 鄭榕穎， 黃 悅， 曾澤宇， 張維溪

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院兒童變態(tài)反應(yīng)(過敏)與免疫科， 浙江 溫州 325027)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控哮喘氣道重塑的機(jī)制研究*

賈宵宵， 鄭榕穎， 黃 悅， 曾澤宇， 張維溪△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院兒童變態(tài)反應(yīng)(過敏)與免疫科， 浙江 溫州 325027)

目的： 探討Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控哮喘氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)的功能和參與哮喘氣道重塑的機(jī)制。方法: 建立大鼠哮喘模型，提取大鼠ASMC。Western blot法檢測(cè)哮喘組和正常組大鼠ASMC中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、原癌基因c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表達(dá)。抑制哮喘組和對(duì)照組ASMC中β-catenin和轉(zhuǎn)錄輔助因子p300/CBP間的相互作用后，采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ASMC的細(xì)胞活力和周期變化。抑制P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性后，采用Western blot法檢測(cè)c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果: Western blot法顯示哮喘組ASMC中β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)， 同時(shí)GSK-3β的蛋白表達(dá)水平則低于對(duì)照組(P<0.05)。抑制β-catenin和p300/CBP間相互作用后，哮喘組ASMC的細(xì)胞活力下降幅度和細(xì)胞周期改變程度均較對(duì)照組更為明顯(P<0.05)。抑制P38 MAPK活性后，哮喘模型大鼠及對(duì)照大鼠ASMC中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶蛋白c-Myc 和cyclin D1的表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能通過上調(diào)c-Myc和cyclin D1的表達(dá)、 與P38 MAPK信號(hào)通路相互作用以及調(diào)控ASMC的生長(zhǎng)和分化等途徑，影響ASMC的功能，參與哮喘氣道重塑。

哮喘； 氣道重塑； 氣道平滑肌細(xì)胞； Wnt/β-catenin信號(hào)通路； β-連環(huán)蛋白

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與，以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]。氣道重塑是哮喘最主要的病理生理特征，其形成機(jī)制十分復(fù)雜，目前的研究表明，氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell，ASMC)的增殖和遷移是導(dǎo)致氣道重塑發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路與哮喘的關(guān)系十分密切[3]，對(duì)ASMC的增殖和分化功能亦有影響[4-5]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)調(diào)控β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而核內(nèi)原癌基因c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)均為Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的靶基因，已被證明參與哮喘氣道重塑過程[6-7]。 因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)水平和影響ASMC的增殖和分化功能等途徑，參與哮喘氣道重塑的形成和發(fā)展。此外，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并非單獨(dú)孤立的存在，事實(shí)上各信號(hào)通路間存在著功能上的關(guān)聯(lián)，目前的研究表明，Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路間存在著大量的相互串話[8]，但Wnt/β-catenin和MAPK信號(hào)通路是否共同調(diào)控哮喘氣道重塑過程，目前尚未完全闡明。

本研究通過建立慢性哮喘模型大鼠，獲取大鼠AMSC，研究Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在哮喘氣道重塑過程中對(duì)ASMC功能的調(diào)控，探討Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與哮喘氣道重塑的具體機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)雄性SD大鼠16只，年齡為8周，體重180～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑 澳洲胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA溶液及鏈、青霉素等購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；兔抗大鼠α-actin單克隆抗體、兔抗大鼠c-Myc單克隆抗體和兔抗大鼠cyclin D1單克隆抗體購(gòu)自Abcam；免疫組化 II 抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；P38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580、β-catenin/CBP特異性抑制劑ICG-001和β-catenin/p300特異性抑制劑IQ1均購(gòu)自Selleck Chemicals； CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Biosciences；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)購(gòu)自Sigma。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物模型的建立 參照課題組既往成功建立模型的方法復(fù)制慢性哮喘氣道重塑模型[9-10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別分成哮喘組和對(duì)照組。模型建立過程分為致敏和激發(fā)2個(gè)階段，共10周。致敏階段共2周，分別在第1天、第8天給哮喘組大鼠腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5 mL [內(nèi)含OVA 1 mg，Al(OH)3100 mg]，相應(yīng)給予對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水1.5 mL。從第3周第 1天開始，隔天使用超聲霧化器向處于密閉塑料箱內(nèi)的哮喘組大鼠用1% OVA生理鹽水溶液進(jìn)行霧化，每次30 min，共持續(xù)8周，對(duì)照組大鼠予生理鹽水替代進(jìn)行霧化。

2.2ASMC和肺組織的提取 末次霧化后16～24 h內(nèi)用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射處死大鼠，在超凈臺(tái)上獲取大鼠氣管、支氣管。在顯微鏡下操作，剪取一小塊肺葉，浸入4%多聚甲醛予以固定，用于蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)。繼續(xù)剔除粘附在氣管上的剩余肺組織、支氣管血管和脂肪組織等，縱向剖開氣管、支氣管，輕輕刮除外膜及內(nèi)膜，將氣管段剪成1 mm3或更小組織塊。使用膠原酶-胰酶混合消化法去除上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，獲取純度較高的ASMC后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3～6代ASMC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3肺組織HE染色 將固定后的肺組織常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，行HE染色后觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)。

2.4ASMC的鑒定 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片。將貼壁的ASMC消化制作成細(xì)胞懸液，接種至無菌細(xì)胞爬片上并置于12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯聚至70%～80%左右，倒去培養(yǎng)液，使用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定15 min，再經(jīng)過洗滌、封閉等步驟后，滴加稀釋的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)Ⅰ抗(1:100)4 ℃孵育過夜。然后使用相應(yīng)的 II 抗(1:100)室溫孵育細(xì)胞1 h，經(jīng)清洗、染色等步驟后鏡檢。

2.5CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 從哮喘組和對(duì)照組大鼠獲取的ASMC分別進(jìn)行分組處理：①陰性對(duì)照(negative control，NC)組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞不加任何處理；(2)DMSO組：細(xì)胞培養(yǎng)液中添加0.5%的DMSO，檢測(cè)0.5‰濃度DMSO是否影響細(xì)胞活力；(3)β-catenin/CBP抑制劑ICG-001組：2種ASMC用特異性抑制劑ICG-001在100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L和5 μmol/L濃度作用下培養(yǎng)24 h；(4)β-catenin/p300抑制劑IQ1組：2種ASMC用特異性抑制劑IQ1在100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L和5 μmol/L濃度作用下培養(yǎng)24 h。2種抑制劑ICG-001和IQ皆使用DMSO溶解，并且根據(jù)各處理組條件，分別配置相應(yīng)濃度的藥物，最終使各處理組培養(yǎng)液中DMSO濃度固定為0.5‰。每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，去除最大值和最小值后，取平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

用0.25%胰蛋白酶消化貼壁培養(yǎng)的哮喘組和對(duì)照組ASMC，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，將各組ASMC以1×108/L濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL體積，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)1 d左右。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯聚至50%～60%左右時(shí)，換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使所有細(xì)胞處于相同生長(zhǎng)狀態(tài)。然后對(duì)上述分組的細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。藥物影響下培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗板2次，重新加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)液，避光37 ℃下作用2 h，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光度(A)值，根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果，判斷各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，以無處理的陰性對(duì)照組細(xì)胞活力為100%。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布 哮喘組和對(duì)照組ASMC各自分為(1)NC組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞不添加任何處理；(2)ICG-001組：使用50 μmol/L ICG-001培養(yǎng)ASMC 24 h；(3)IQ1組：使用50 μmol/L IQ1培養(yǎng)ASMC 24 h。

使用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的各組ASMC，制成單細(xì)胞懸液后分別收集細(xì)胞至各15 mL離心管，離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的PBS吹打洗滌細(xì)胞， 1 000 r/min離心5 min后棄上清，重復(fù)1次；加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜(18 h以上)；離心收集固定后的細(xì)胞， PBS洗滌細(xì)胞1次，再次離心5 min，棄上清；每個(gè)樣品加入500 μL細(xì)胞周期檢測(cè)試劑碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，室溫避光孵育20 min；以流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)2～3萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件分析。

2.7Western blot法檢測(cè)c-Myc、GSK-3β、β-catenin和cyclin D1蛋白水平的變化 將長(zhǎng)滿正常對(duì)照組和哮喘組平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于冰上，使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液RIPA，裂解30 min后，用細(xì)胞刮刮脫細(xì)胞，收集液體至EP管，超聲裂解5秒、3次，將EP管移至高速離心機(jī)中，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，配置成等體積等濃度的蛋白體系，采用8% SDS-PAGE分離蛋白、300 mA恒流轉(zhuǎn)膜以及5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)單克隆 I 抗4 ℃孵育過夜。16～18 h后將膜浸入TBST中，置于搖床上漂洗3次，加入 II 抗孵育2 h，TBST洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯色、顯影。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)(mean±SD)表示；均數(shù)間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩變量之間的相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1動(dòng)物一般情況觀察

與對(duì)照組大鼠比較，哮喘組大鼠霧化激發(fā)后明顯更為煩躁不安、易激惹，出現(xiàn)抓耳撓腮、呼吸加深加快、腹肌痙攣等癥狀，霧化結(jié)束后大鼠多呈俯伏不動(dòng)的姿態(tài)，密封霧化箱內(nèi)的大小便排泄物明顯較對(duì)照組大鼠增多。對(duì)照組大鼠在用生理鹽水霧化過程中仍活動(dòng)自如，無明顯異常表現(xiàn)。經(jīng)過多次激發(fā)之后，哮喘組大鼠相較對(duì)照組毛色蒼黃、無光澤。

2肺組織病理學(xué)改變

正常對(duì)照組大鼠肺組織HE染色顯示正常小氣道和肺泡結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮完整，支氣管管腔規(guī)則，支氣管、血管周圍未見炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。哮喘組大鼠肺組織HE染色顯示氣道壁明顯增厚，基底膜不規(guī)則增厚，黏膜褶皺增多，可見黏液腺增生、黏液栓形成和黏膜下水腫，管腔內(nèi)可見滲出物和炎性細(xì)胞增多，支氣管黏膜下、支氣管和血管周圍可見嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)(圖1)。綜合肺組織切片HE染色結(jié)果，表明本實(shí)驗(yàn)大鼠哮喘氣道重塑模型成功建立。

Figure 1. HE-stained lung tissues from the rat (×400).

圖1大鼠肺組織HE染色

3大鼠ASMC的鑒定

于倒置相差顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)，鏡下可見單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形, 有多個(gè)細(xì)胞突起, 胞質(zhì)豐富, 密度高, 核圓形居中, 有多個(gè)核仁。細(xì)胞生長(zhǎng)致密時(shí)平行排列成束, 部分重疊, 表現(xiàn)為典型的“谷峰”形態(tài)。對(duì)ASMC使用SP法進(jìn)行特異的α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，99%以上細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色，胞漿呈棕黃色或棕紅色，證實(shí)為ASMC，見圖2、3。

Figure 2. Images of ASMC under microscope observation (×100).

圖2靜置培養(yǎng)后ASMC的形態(tài)觀察

Figure 3. The identification of ASMC by α-SMA stainning (×100).

圖3ASMC的培養(yǎng)鑒定

4Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)ASMC生長(zhǎng)的調(diào)控

4.1細(xì)胞活力的變化 0.5‰濃度的DMSO對(duì)細(xì)胞活力無明顯抑制。對(duì)哮喘組和正常組ASMC使用β-catenin/CBP特異性抑制劑ICG-001和β-catenin/p300特異性抑制劑IQ1干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，抑制β-catenin和p300或CBP間的相互作用，結(jié)果顯示ICG-001在4個(gè)濃度(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)均抑制哮喘組ASMC的細(xì)胞活力(P<0.01)，但在5 μmol/L濃度時(shí)對(duì)正常組ASMC的活力無明顯抑制作用。對(duì)比各濃度ICG-001對(duì)哮喘組和正常組ASMC活力影響，發(fā)現(xiàn)相同處理?xiàng)l件下哮喘組ASMC的活力明顯低于正常組ASMC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

另一方面，IQ1濃度在5 μmol/L 、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L時(shí)，均對(duì)哮喘組ASMC的細(xì)胞活力有明顯抑制(P<0.01)，但在濃度為5 μmol/L 、25 μmol/L時(shí)對(duì)正常組ASMC的活力無明顯抑制作用。相同IQ1濃度作用時(shí)，各哮喘組ASMC的活力明顯低于正常組ASMC，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. The cell activity of the ICG-001 treated ASMC in asthma group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group.

圖4使用ICG-001干預(yù)24h后ASMC的細(xì)胞活力變化

Figure 5. The cell activity of the ASMC in IQ1 treated asthma group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vscontrol group.

圖5使用IQ1干預(yù)后ASMC的活力變化

4.2細(xì)胞周期分布的變化 使用50 μmol/LICG-001和IQ1干預(yù)培養(yǎng)正常對(duì)照組ASMC后，與NC組相比，各處理組ASMC 的G0/G1期占細(xì)胞周期百分比有所上升，S期少許下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。而使用抑制劑處理的哮喘組ASMC，與NC組比較，各處理組ASMC 的G0/G1期延長(zhǎng)，S期和G2/M期占細(xì)胞周期的百分比均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖7。

5ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)量的變化

檢測(cè)2組ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示哮喘組ASMC中的β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的相對(duì)灰度值均高于正常對(duì)照ASMC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。哮喘組ASMC中GSK-3β蛋白的相對(duì)灰度值低于對(duì)照組ASMC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖8、表1。

Figure 6. The change of cell cycle distribution in ICG-001 or IQ1 treated ASMC of control rats. Mean±SD.n=3.

圖6正常組ASMC經(jīng)2種抑制劑處理后細(xì)胞周期的變化

Figure 7. The change of cell cycle distribution in ICG-001 or IQ1 treated ASMC of asthma rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC group.

圖7哮喘組ASMC經(jīng)2種抑制劑處理后細(xì)胞周期的變化

6抑制P38MAPK信號(hào)通路后c-Myc、cyclinD1蛋白表達(dá)量變化

使用特異性P38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB2023580干預(yù)培養(yǎng)哮喘大鼠ASMC 24 h后，位于Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組ASMC相比均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖9、表2。

Figure 8. The protein expressions of β-catenin,GSK-3β, c-Myc and cyclin D1 in the ASMC.

圖8β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)

表1GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)

Table 1. The protein expressions of β-catenin, GSK-3β, c-Myc and cyclin D1 in the ASMC (Mean±SD.n=8)

Groupβ-cateninGSK-3βc-MycCyclinD1Control0.27±0.060.75±0.330.25±0.110.17±0.03Asthma0.49±0.16*0.30±0.08*0.44±0.04**0.65±0.12**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 9. The protein expressions of cyclin D1 and c-Myc in the ASMC of asthma rats.

圖9c-Myc和cyclinD1蛋白在ASMC中的表達(dá)

表2c-Myc和cyclinD1蛋白在ASMC中的表達(dá)

Table 2. The protein expressions of c-Myc and cyclin D1 in ASMC of asthma rats (Mean±SD.n=8)

Groupc-MycCyclinD1NC0.49±0.130.72±0.16SB2035800.08±0.04**0.29±0.07**

**P<0.01vsNC group.

討 論

氣道重塑是哮喘最主要的病理生理特征，表現(xiàn)為ASMC肥大增生、氣道上皮纖維化、氣道壁增厚、管腔面積縮窄、黏膜下新血管形成、黏液腺體肥厚增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等[11-12]。ASMC是主動(dòng)參與哮喘炎癥過程的效應(yīng)細(xì)胞，它通過與其它炎癥細(xì)胞的相互作用，改變自身收縮性能，分泌各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等各種方式，參與哮喘氣道重塑[2]。同時(shí)，平滑肌細(xì)胞的增殖伴有細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白含量增加以及β-catenin mRNA增多，β-catenin還參與ASMC的有絲分裂過程，其在胞內(nèi)聚集和核內(nèi)轉(zhuǎn)移對(duì)維持ASMC的生長(zhǎng)具有重要作用，可參與調(diào)控ASMC分泌細(xì)胞外基質(zhì)的過程[4-5]?？紤]到β-catenin與ASMC的功能關(guān)系十分密切，兩者同時(shí)又和哮喘氣道重塑的形成具有相關(guān)性，因此我們開展此研究，旨在探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)ASMC的相關(guān)功能的調(diào)控作用及參與哮喘氣道重塑的機(jī)制。

1Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)哮喘ASMC生長(zhǎng)的調(diào)控

CBP和p300是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶中一種重要的大分子蛋白，其結(jié)構(gòu)存在高度的同源性，因而時(shí)常被合稱為p300/CBP，它們能調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，同時(shí)還參與細(xì)胞內(nèi)的一系列生物活性調(diào)節(jié),如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)等[13-14]。已有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路上存在著p300/CBP的作用位點(diǎn)，并且β-catenin/CBP和β-catenin/p300影響細(xì)胞的增殖和分化功能[4, 15]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CBP及p300兩個(gè)位點(diǎn)與β-catenin間的相互作用后，ASMC的活力明顯降低，并且相同處理?xiàng)l件下，哮喘組ASMC的活力下降幅度明顯大于正常組，表明Wnt/β-catenin可能通過調(diào)控ASMC的生長(zhǎng)，參與哮喘氣道重塑。

2Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活使下游靶基因表達(dá)上升

原癌基因c-myc和cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，與哮喘氣道重塑的形成表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，課題組既往的研究亦表明，β-catenin和c-Myc參與哮喘氣道重塑的形成[6]。

本研究中，我們使用Western blot法檢測(cè)哮喘組以及正常對(duì)照組ASMC中Wnt/β-catenin通路的核心轉(zhuǎn)錄因子β-catenin及其通路下游的靶基因c-Myc和cyclin D1的表達(dá)變化，結(jié)果顯示哮喘組ASMC中β-catenin表達(dá)上升，而對(duì)β-catenin的表達(dá)有抑制作用的GSK-3β則表達(dá)下降，表明哮喘氣道重塑大鼠ASMC中存在Wnt信號(hào)通路的激活。提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的激活可能通過上調(diào)c-Myc和cyclin D1的表達(dá)，影響平滑肌細(xì)胞的相關(guān)功能，從而參與氣道重塑過程。

3Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過與MAPK信號(hào)通路間的相互作用

MAPK信號(hào)通路被證明可能參與哮喘氣道重塑中ASMC的增殖過程[16]，MAPK還可以通過磷酸化導(dǎo)致GSK-3β的抑制，引發(fā)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累，引起Wnt相關(guān)敏感基因的表達(dá)[17]。多項(xiàng)研究報(bào)道[8, 17-18]Wnt信號(hào)家族可以激活p38 MAPK通路，表明p38 MAPK信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路關(guān)系密切，然而兩者是否通過相互作用共同參與哮喘氣道重塑過程以及其在ASMC中作用的具體機(jī)制尚未清楚。

我們的研究顯示，使用特異性抑制劑SB203580抑制哮喘大鼠ASMC中p38 MAPK活性后，Wnt信號(hào)通路下游的c-Myc和cyclin D1表達(dá)量下降，提示p38 MAPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)，表明MAPK信號(hào)通路很可能通過與Wnt/β-catenin信號(hào)通路間相互作用共同影響ASMC功能，參與哮喘氣道重塑。

綜上所述，本研究通過建立大鼠慢性哮喘模型，獲取大鼠ASMC，探究Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與哮喘氣道重塑的相關(guān)機(jī)制，結(jié)果提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能通過上調(diào)c-Myc和cyclin D1的表達(dá)，與MAPK信號(hào)通路相互作用和調(diào)控ASMC的增殖與分化等途徑，影響ASMC功能，參與哮喘氣道重塑。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of Wnt/β-catenin signal pathway on asthma airway remodeling

JIA Xiao-xiao, ZHENG Rong-ying, HUANG Yue, ZENG Ze-yu, ZHANG Wei-xi

(Department of Pediatric Allergy and Immunology, The Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China. E-mail: zhangweixi112@163.com)

AIM: To explore the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway in airway smooth muscle cells (ASMC) on asthmatic airway remodeling.METHODS: The asthmatic airway remodeling model in rats was established and the ASMC was isolated and cultured. The protein expression of β-catenin, glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), c-Myc and cyclin D1 in the ASMC was determined by Western blot. After depressing the interaction between β-catenin and p300/CBP, the cell activity was measured by CCK-8 assay and the change of cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. Meanwhile, the protein expression of c-Myc and cyclin D1 in the ASMC was determined by Western blot after inhibiting P38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity.RESULTS: The protein levels of β-catenin， c-Myc and cyclin D1 were significantly increased in asthma group while the protein level of GSK-3β was decreased in the same group (P<0.05). After depressing the interaction between β-catenin and p300/CBP, the cell activity of ASMC was decreased in asthma group compared with control group (P<0.05), and the change of the cell cycle distribution in asthma group was also more obvious (P<0.05). After inhibiting P38 MAPK activity, the protein levels of c-Myc and cyclin D1 were all decreased compared with control group in ASMC asthma and control rats (P<0.05).CONCLUSION: Wnt/β-catenin signaling pathway may participates in airway remodeling in asthma by increasing the protein expression of c-Myc and cyclin D1, reacting with the P38 MAPK signaling pathway and regulating the growth of ASMC.

Asthma; Airway remodeling; Airway smooth muscle cells; Wnt/β-catenin signaling pathway; β-catenin

1000- 4718(2017)09- 1683- 07

2017- 03- 07 [

] 2017- 05- 09

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. LY15H010006)；浙江省科技廳項(xiàng)目(No. 2016C33182)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才項(xiàng)目

R562.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.024

△通訊作者 Tel: 0577-88002125; E-mail: zhangweixi112@163.com