,,,,,3,*

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽蕪湖 241000;3.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取牛鼻栓枝皮多糖工藝

馬志慧1,王曉英1,包淑云2,黃克強(qiáng)1,周守標(biāo)1,3,*

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽蕪湖 241000;3.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

以牛鼻栓枝皮為材料,采用超聲波提取法優(yōu)化多糖的提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取液料比、提取時(shí)間、提取溫度及提取功率為影響因素,多糖提取量為響應(yīng)值,結(jié)合響應(yīng)面分析法確定牛鼻栓枝皮多糖的提取條件,得到最佳提取工藝為:液料比為50∶1 (mL/g),提取時(shí)間為59 min,提取溫度為66 ℃,提取功率為180 W,此條件下的多糖提取量為11.43 mg/g。與傳統(tǒng)熱提法相比,超聲波提取多糖效率更高。

牛鼻栓枝皮,多糖,超聲波,響應(yīng)面法

牛鼻栓(FortuneariasinensisRehd. et Wils)為金縷梅科單屬種植物,且為我國(guó)特有,其分布于湖南、湖北、江蘇、安徽等地[1]。牛鼻栓葉片含有巖白菜素[2-3],對(duì)支氣管哮喘、慢性支氣管炎等具有一定的療效。

多糖是一類具有多種重要生理活性的高分子化合物,除了抗衰老、抗輻射、抗病毒外,還有降血糖、降血脂及抑制腫瘤的作用[4-5]。近年來(lái),隨著對(duì)多糖研究的深入,其提取方法也在不斷改進(jìn),其中超聲波輔助提取的方法由于空化效應(yīng),利于溶劑更好地滲透進(jìn)樣品,具有更為快速、簡(jiǎn)便及有效的特點(diǎn)[6-7]。

雖然關(guān)于多糖的研究報(bào)道很多,但少有關(guān)于牛鼻栓多糖的研究報(bào)道。為更好地開(kāi)發(fā)利用牛鼻栓,本研究以超聲波法提取牛鼻栓枝皮多糖,通過(guò)響應(yīng)面分析法[8-9],研究各因素與響應(yīng)面值、各因素兩兩間交互作用的顯著性[10-12],對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

牛鼻栓枝 采自安徽省滁州市的瑯琊山,由安徽師范大學(xué)周守標(biāo)教授鑒定;石油醚、葡萄糖、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸等均為分析純。

HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司;KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛鼻栓枝皮多糖的提取 取牛鼻栓枝皮晾干,粉碎,過(guò)100目篩,用石油醚索氏提取,得到的殘?jiān)匀桓稍?取一定量的殘?jiān)凑赵O(shè)定的提取條件加蒸餾水后提取,抽濾,上清液濃縮至10 mL,加3倍體積的95%乙醇醇沉過(guò)夜,于4000 r/min離心20 min,沉淀加20 mL蒸餾水溶解,Sevag法脫蛋白[13-14],室溫下于4000 r/min離心10 min,取上清液濃縮后定容至50 mL容量瓶中。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 精密稱取葡萄糖20 mg,用蒸餾水溶解并定容至500 mL容量瓶中,分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于具塞試管中,加蒸餾水至1.0 mL,依次加入0.6 mL 5%苯酚溶液,3.6 mL濃硫酸,置沸水浴中30 min,冷卻至室溫后,在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,繪制多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線[15-16]。多糖提取的公式為:

牛鼻栓枝皮多糖提取量(mg/g)=提取液中多糖質(zhì)量(mg)/牛鼻栓枝皮樣品質(zhì)量(g)

1.2.3 超聲波提取牛鼻栓枝皮多糖的單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察不同液料比、不同提取時(shí)間、不同提取溫度及不同提取功率對(duì)牛鼻栓皮多糖提取量的影響,確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素水平。

保持提取時(shí)間30 min、提取溫度55 ℃、提取功率200 W不變,研究液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優(yōu)的液料比,保持提取溫度55 ℃、提取功率200 W不變,研究提取時(shí)間15、30、45、60、75 min對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優(yōu)的液料比與提取時(shí)間,固定提取功率200 W,研究提取溫度35、45、55、65、75 ℃對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優(yōu)的液料比、提取時(shí)間與提取溫度,研究提取功率80、120、160、180、200 W對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)作為原理,用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,分別以A液料比、B提取時(shí)間、C提取溫度、D提取功率為4個(gè)因素,以-1、0、1表示其3個(gè)水平[17],多糖提取量為響應(yīng)值,從而得到牛鼻栓枝皮多糖的最佳提取工藝,其因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factor and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3傳統(tǒng)熱提法與超聲波提取法的比較

依照超聲波提取的最優(yōu)提取時(shí)間、提取溫度及液料比條件,用傳統(tǒng)熱提法[18]提取牛鼻栓枝皮多糖,進(jìn)行含量測(cè)定,并與超聲波提取法進(jìn)行比較。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)響應(yīng)面法,以牛鼻栓枝皮多糖提取量為響應(yīng)面值,采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與回歸分析,得出最優(yōu)提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=10.951x+0.0488,R2=0.9993,回歸方程的測(cè)定濃度范圍為0.012～0.040 mg/mL,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of dextra

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲提取液料比對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖2所示,隨著液料比的增加,牛鼻栓枝皮中多糖提取量不斷增大,在液料比為40∶1 (mL/g)時(shí),達(dá)到最大值,之后呈下降趨勢(shì)。原因可能是當(dāng)液料比較小時(shí),牛鼻栓枝皮中的多糖溶解不充分;液料比較大時(shí),溶劑過(guò)多,增加了濃縮過(guò)程中的時(shí)間消耗,而導(dǎo)致提取量降低。綜合考慮,故選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)較適宜。

圖2 料液比對(duì)多糖提取量的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖3所示,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖提取量增加;60 min后,多糖提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。原因可能是多糖在長(zhǎng)時(shí)間超聲波的機(jī)械振動(dòng)下,部分多糖大分子被降解成小分子的單糖而造成損失。故選取提取時(shí)間30、45、60 min為較優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharides

2.2.3 超聲提取溫度對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖4所示,隨著提取溫度的升高,多糖提取量增大;之后達(dá)到65 ℃以后,多糖提取量降低。原因可能是由于溫度的升高,促使溶劑更易進(jìn)入樣品的顆粒中,使多糖的溶解力增加。綜合考慮,選取55、65、75 ℃作為最適提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides

2.2.4 超聲提取功率對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖5所示,在提取功率在80～180 W時(shí),多糖提取量在不斷增加,之后隨著功率的增加,呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是超聲波功率越大,其空化效應(yīng)越明顯,能加大溶劑對(duì)于多糖的溶解;功率過(guò)高,產(chǎn)生的熱量越多,對(duì)牛鼻栓枝皮多糖的結(jié)構(gòu)造成一定破壞。故將提取功率160、180、200 W作為較適宜的實(shí)驗(yàn)條件。

圖5 提取功率對(duì)多糖提取量的影響Fig.5 Effect of extraction power on the extraction yield of polysaccharides

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression

注:*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。

2.3.2 回歸模型有效性及顯著性分析 依據(jù)表2中的結(jié)果,利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行回歸分析,得到牛鼻栓多糖提取量(Y)與液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、提取功率(D)的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=10.69+0.21A+0.60B+0.64C-0.19D+1.28AB-0.76AC+0.14AD+0.21BC+0.52BD+0.59CD-0.42A2-1.03B2-1.84C2-1.29D2

2.3.3 兩因素交互作用分析 液料比、提取時(shí)間、提取溫度與提取功率這四個(gè)因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面與等高線圖見(jiàn)圖6。通過(guò)響應(yīng)面圖可知,在所對(duì)應(yīng)的范圍內(nèi)存在極大值,即為各響應(yīng)面的最高點(diǎn),亦為等高線最內(nèi)橢圓的中心點(diǎn)[14]。

如圖6a所示,液料比與提取時(shí)間對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的交互作用顯著。響應(yīng)面圖可以看出,當(dāng)液料比為50∶1 (mL/g),提取時(shí)間為60 min時(shí),多糖提取量最高;從等高線圖亦可以看出,提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響更大。

如圖6b所示,液料比與提取溫度對(duì)牛鼻栓枝皮多糖提取量的交互作用顯著。從3D圖可知,多糖提取量在液料比40∶1 (mL/g)、提取溫度65 ℃時(shí)達(dá)到最高,等高線曲線斜率反映出提取溫度對(duì)多糖提取量影響更明顯。

如圖6c所示,多糖提取量在提取時(shí)間45 min、提取功率170 W時(shí),提取效率最高,且提取時(shí)間比提取功率對(duì)響應(yīng)值的影響更大,兩者的交互作用較顯著。

如圖6d所示,多糖提取量受提取溫度與提取功率的交互作用影響顯著。其中,提取溫度對(duì)多糖的影響占主導(dǎo)。在提取溫度65 ℃,提取功率170 W時(shí),多糖提取量較高。

通過(guò)Design-expert 軟件分析得出,牛鼻栓枝皮多糖提取的最佳工藝為:液料比50∶1 (mL/g)、提取時(shí)間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率172 W。此條件下多糖提取量為11.38 mg/g。

圖6 各因素交互作用對(duì)多糖提取量的響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of independent variables on polysaccharide yield

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了對(duì)最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)合實(shí)際操作的可行性,將Design-expert 軟件得到的最優(yōu)條件調(diào)整為:液料比50∶1 (mL/g)、提取時(shí)間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率180 W,并在此條件下進(jìn)行三組平行重復(fù)實(shí)驗(yàn),最終得到的牛鼻栓枝皮多糖的提取量為11.43 mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.44%,差異較小。故利用響應(yīng)面優(yōu)化提取牛鼻栓枝皮多糖得到的提取工藝真實(shí)可靠,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.5傳統(tǒng)熱提法與超聲波提取法的比較

牛鼻栓枝皮多糖不同提取方法下,多糖含量不同,傳統(tǒng)熱提多糖提取量為7.85 mg/g,超聲波提取多糖提取量為11.43 mg/g。與傳統(tǒng)熱提法相比,超聲波提取多糖效率更高,即響應(yīng)面法提取牛鼻栓枝皮多糖具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法,對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度及提取功率這四個(gè)因素進(jìn)行考察,并采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,結(jié)果得出,液料比、提取時(shí)間與提取溫度對(duì)多糖提取量影響顯著,其影響順序?yàn)?提取溫度>提取時(shí)間>液料比>提取功率。通過(guò)二次回歸方程,得到的最優(yōu)提取工藝為液料比50∶1 (mL/g)、提取時(shí)間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率180 W,牛鼻栓枝皮多糖的實(shí)際平均提取量為11.43 mg/g,提取效率高于傳統(tǒng)熱提法。

本實(shí)驗(yàn)藥材牛鼻栓作為中國(guó)特有的植物,目前并未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道過(guò)其多糖成分。本研究通過(guò)響應(yīng)面回歸分析,不僅得出牛鼻栓皮中含有較多量的多糖物質(zhì),也優(yōu)化了超聲波提取的工藝,為牛鼻栓工業(yè)生產(chǎn)提供了理論依據(jù),也為其藥用價(jià)值的利用奠定了基礎(chǔ)。

[1]駱洋,李德銖. Flora of China(《中國(guó)植物志》英文和修訂版)全面完成[J]. 植物分類與資源學(xué)報(bào),2013,34(3):742-810.

[2]吳振瑩,方玲,高強(qiáng),等. 牛鼻栓三裂輪簇霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013(1):113-116,120.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中華人民共和國(guó)藥典[S]. 一部. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:384.

[4]劉芳,鄭育聲,尹學(xué)瓊,等. 灰葉馬尾藻多糖的提取及其生物活性[J]. 食品科學(xué),2013(3):93-96.

[5]張揚(yáng),張艷,楊秀東,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米苞葉多糖的提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2016,(14):267-271.

[6]Zongxi Sun,Ruiqiang Su,Jianwei Qiao,et al. Flavonoids Extraction from Taraxacum officinale(Dandelion):Optimization using response surface methodology and antioxidant activity[J]. Journal of Chemistry,2014(1):1-7.

[7]Wang Xinsheng,Wu Qinan,Wu Yanfang,et al. Response surface optimized ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Sparganii Rhizoma and evaluation of theirinvitroantioxidant activities.[J]. Molecules,2012,17(6):6769-6783.

[8]Yang Xiu-shi,Wang Li-jun,Dong Chuan,et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharides from American ginseng and evaluation of its immunostimulating activity[J]. Journal of Integrative Agriculture,2014,(12):2807-2815.

[9]王洪政,李媛媛,劉偉,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹果莢多糖提取工藝及其抗氧化活性評(píng)估[J]. 植物研究,2015(1):127-132.

[10]艾連中. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化苦豆子多糖提取工藝[J]. 食品科學(xué),2010(12):141-143.

[11]段麗麗,句榮輝,王輝,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界提取茯苓多糖工藝研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2016(5):193-199.

[12]黎英,尤雙圳,賴丹妮,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取狀元豆多糖工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2015(4):223-229.

[13]劉燕,陳小銀,楊麗麗,等. 響應(yīng)面優(yōu)化菊芋菊糖的提取工藝研究[J]. 植物研究,2016(4):627-633.

[14]郝繼偉. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取蒙山松茸多糖工藝[J]. 中藥材,2010(7):1159-1163.

[15]徐建國(guó),田呈瑞,胡青平,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化槐花水溶性多糖的超聲波輔助提取工藝[J]. 食品科學(xué),2011(4):112-116.

[16]劉小攀,田春蓮,覃基信,等. Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取忽地笑多糖工藝研究[J].中藥材,2015(7):1520-1523.

[17]Bao Zhang,Yunzhong Chen,Xuefei Wei,et al. Optimization of Conditions for Collagen Extraction from the Swim Bladders of Grass Carp(Ctenopharyngodon idella)by Response Surface Methodology[J]. International Journal of Food Engineering,2011,6(3):.

[18]胡斌杰,陳金鋒,王宮南. 超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007(2):190-192.

Optimizationofultrasonic-assistedtechnologyforpolysaccharidesextractionfromthebarkofFortuneariasinensisbranchesbyresponsesurface

MAZhi-hui1,WANGXiao-ying1,BAOShu-yun2,HUANGKe-qiang1,ZHOUShou-biao1,3,*

(1.College of Life Science,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China; 2.School of Pharmacy,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China; 3.College of Environmental Science and Engineering,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China)

Ultrasonic-assisted technology was used to optimize the extraction technique of polysaccharides from the bark ofFortuneariasinesisbranches. Based on the results of single factor experiment,the impacting factors was selected including liquid to solid ratio,extraction time,extraction temperature and extraction power,and the extraction yield of polysaccharides as the response value. The extraction conditions of polysaccharides from the bark ofFortuneariasinensisbranches were determined by response surface analysis. The optimum extraction conditions were as follows:liquid to solid ratio was 50∶1 (mL/g),the extraction time was 59 min,the extraction temperature was 66 ℃,and the extraction power was 180 W. The extraction rate of polysaccharide was 11.43 mg/g. Compared with the ultrasonic and traditional hot-water extraction method,ultrasonic extraction efficiency was higher.

the bark ofFortuneariasinensisbranches;polysaccharides;ultrasonic;response surface methodology

2017-02-21

馬志慧(1992-)，女，碩士，研究方向：藥用植物學(xué)，E-mail:mazhihui1999@163.com。

*通訊作者:周守標(biāo)(1963-)，男，博士，教授，研究方向：資源植物學(xué)與生物多樣性保護(hù)等，E-mail:zhoushoubiao@vip.163.com。

安徽省2016年高校優(yōu)秀中青年骨干人才國(guó)內(nèi)外訪學(xué)研修重點(diǎn)項(xiàng)目(gxfxZD2016153)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)17-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.038