,,,

(寧德師范學(xué)院生物系,福建寧德 352100)

海參體壁蛋白ACE抑制肽酶解工藝及產(chǎn)物分子量分布研究

周逢芳,蔡彬新,巫鑫睿,羅芬

(寧德師范學(xué)院生物系,福建寧德 352100)

以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率和水解度為指標(biāo),篩選出適合海參體壁蛋白水解的酶。采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化最優(yōu)酶的水解條件,確定其最佳水解工藝,進(jìn)而采用HPLC法探討酶解產(chǎn)物的分子量分布。結(jié)果表明:中性蛋白酶在50 ℃、pH7.5、酶量3000 U/g、酶解5 h條件下,所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高,達(dá)到56.5%。此條件下酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析,200～1000 Da(2～10肽)的海參多肽占44.1%。

海參,水解度,ACE抑制肽,分子量分布

高血壓是一種常見的心血管疾病,預(yù)計到2025年全世界高血壓患者將超過15.6億[1]。導(dǎo)致高血壓的原因很復(fù)雜,一些研究證明,ACE是腎素-激肽系統(tǒng)(ARS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)的關(guān)鍵酶,通過ARS和KKS兩個途徑,ACE參與體內(nèi)血壓調(diào)節(jié),造成血壓的升高,引發(fā)高血壓[2-3],因此通過抑制ACE的活性來抑制血壓升高是可行的。

目前有許多治療高血壓的合成藥物,由于高血壓患者往往需要終身治療,因此長期服用產(chǎn)生了一定的副作用,如咳嗽、皮疹等[4]。相反,食物蛋白源ACE抑制活性肽沒有表現(xiàn)出這些副作用,因此尋找新的食物來源的ACE抑制活性肽已成為重要的研究領(lǐng)域。隨著海洋生物被人們越來越多的關(guān)注,藻類[5-6]、蝦[7]、魚[8-10]、海參[11]、鮑魚加工副產(chǎn)品[12]等,已陸續(xù)分離出ACE抑制肽。

海參(Ludwigothureagrisea),屬海參綱,無脊椎棘皮動物[13],具有很高的營養(yǎng)價值和藥理活性[14]。目前海參主要的加工和保鮮技術(shù)是鹽漬,嚴(yán)重制約了海參資源的利用。因此,開發(fā)精加工技術(shù)和高價值的產(chǎn)品,充分利用豐富的海參資源具有重要意義。海參富含蛋白質(zhì),其序列沒有生物活性[15],但酶水解釋放出的海參多肽,具備一定的生理功能[16]。蛋白酶具有高度專一性,不同酶酶切得到的肽段不同,且ACE抑制肽沒有一個固定的結(jié)構(gòu),因此酶法生產(chǎn)ACE抑制肽存在一定的盲目性,無法控制目標(biāo)肽段。只能根據(jù)酶切產(chǎn)物的活性進(jìn)行篩選目標(biāo)酶。趙元暉等[17]利用菠蘿蛋白酶從營養(yǎng)價值較低的海地瓜酶解制備ACE抑制肽;Raheleh Ghanbari[18]利用海參制備ACE抑制和抗氧化活性的雙功能蛋白水解物。本研究不同之處在于以北參南養(yǎng)的“霞浦海參”為原料,不同產(chǎn)地的海參其蛋白含量及成分應(yīng)不盡相同,酶切的肽段存在較大區(qū)別;探討不同的酶切產(chǎn)物ACE抑制活性與其分子量分布的關(guān)系。本研究的目的以ACE抑制率為指標(biāo),篩選蛋白酶,制備ACE抑制活性肽,優(yōu)化最適酶的酶解工藝,并考察所得酶解產(chǎn)物分子量分布。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮海參 福建霞浦;木瓜蛋白酶(60萬U/g)、中性蛋白酶(6萬U/g)、風(fēng)味蛋白酶(20萬U/g)、胰蛋白酶(6000 U/g)、胃蛋白酶(1萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、Sephadex G-25 北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL) Sigma公司;溶菌酶、牛胰島素、桿菌肽、色氨酸、乙腈 阿拉丁公司;福林-酚等其他試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

MC電子天平 奧豪斯儀器公司;UV2550紫外光分光光度計 日本島津;PB-10PH計 上海般特儀器公司;3-16pk高速冷凍離心機 sigma公司;1200高效液相色譜儀 安捷倫公司。

1.2實驗方法

1.2.1 海參體壁ACE抑制肽制備工藝 將海參體壁洗凈,絞碎,取一定量勻漿液,按料水比1∶2,每克底物添加3000 U的酶,在酶的適宜條件(表1)下水解海參勻漿液。分別于1、2、3、4、5、6、7、8 h取樣,沸水浴滅酶10 min后,于4 ℃,12000 r/min離心15 min得上清液。分別測定它們的水解度和ACE活性抑制率,探討水解度與ACE抑制率的關(guān)系,確定最優(yōu)酶。

1.2.2 酶解工藝條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 固定料水比1∶2、時間5 h、pH7.0、加酶量3000 U·g-1,考察不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、溫度50 ℃、pH7.0、加酶量3000 U·g-1,考察不同時間(4、5、6、7、8 h)對ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、時間5 h、溫度50 ℃、加酶量3000 U·g-1,考察不同pH(6、6.5、7、7.5、8)對ACE抑制率的影響。固定料水比1∶2、時間5 h、溫度50 ℃、pH7.5,考察不同加酶量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)對ACE抑制率的影響。

表1 酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝 根據(jù)Box-Behnkcn的中心組合設(shè)計原理,結(jié)合單因素實驗結(jié)果,選擇時間、溫度和酶量三個因素為自變量,以ACE抑制率為響應(yīng)值,設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗,如表2。

表2 實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of the experiment

1.2.3 測定指標(biāo)

1.2.3.1 水解度的測定 采用甲醛滴定法測水解度[19]:DH(%)=水解液中的α-氨基氮量/原料中總氮量×100

其中采用凱氏定氮法(GB/T5009.5.2010)測定總氮含量,甲醛滴定法測定氮量。

1.2.3.2 ACE抑制肽活性的測定 根據(jù)Cushman方法[20]改進(jìn),取2.0 mg/mL海參酶解液40 μL,加入20 μL ACE溶液(25 mU/mL),在37 ℃下保溫5 min后加入50 μL HHL溶液開始反應(yīng),反應(yīng)60 min后加入200 μL 1.0 mol/L HCl中止反應(yīng),得到反應(yīng)液,利用HPLC進(jìn)行分析測定。同時用40 μL pH8.3的硼酸緩沖液替代海參酶解液來制備反應(yīng)液,作為空白對照組。色譜檢測條件:色譜柱Zorbax SB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,填料粒徑5 μm);柱溫:25 ℃;流動相：乙腈-水(25∶75,V/V,各含0.1%三氟乙酸);流速:1 mL/min;檢測波長:228 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

ACE活性抑制率(I，%)=(M-N)/M×100

式中:M-空白對照組中馬尿酸的峰面積;N-樣品組中馬尿酸的峰面積。

1.2.3.3 相對分分子量測定 分別選用分子質(zhì)量:細(xì)胞色素C(Mw 12500 Da)、抑肽酶(Mw 6500 Da)、桿菌酶(Mw 1450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw 451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw 189 Da)標(biāo)品,配成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,經(jīng)0.45 μm膜過濾后,分析其分子量分布范圍。

色譜條件如下:SRT SEC-100 300 mm×7.8 cm;流動相:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0);檢測:UV214 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL。由分子量對數(shù)與出峰時間關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法分析海參酶解液的分子量分布。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 響應(yīng)面實驗結(jié)果采用Design-Expert8.0.6程序進(jìn)行分析,以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用Excel2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1蛋白酶初步篩選

2.1.1 六種蛋白酶對海參體壁水解度的影響 由于酶具有特異性,不同酶的酶切位點不同,產(chǎn)生的肽段不一樣,這決定了酶解產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能。實驗選取了六種蛋白酶,分別在各種蛋白酶的理論適宜條件下進(jìn)行水解,水解進(jìn)程曲線如圖1所示。雖然不同酶水解海參蛋白的能力存在差異,但總體來說,酶解過程中水解度的變化趨勢基本相同,DH隨著時間的延長而增大,前期水解度快速上升,后期水解度升高緩慢,這可能是因為隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行,可供蛋白酶水解的肽鍵數(shù)不斷減少,或者體系中的酶活力下降或喪失。

圖1 蛋白酶水解產(chǎn)物酶解進(jìn)程曲線Fig.1 Hydrolysis curves of hydrolysates

在六種酶中,堿性蛋白酶水解海參體壁蛋白的能力最強,2 h內(nèi)DH就達(dá)到24.5%。這是由于堿性蛋白酶是一種非特異性肽鍵內(nèi)切酶,有較多的切割位點,從肽鏈內(nèi)部水解底物,產(chǎn)生大量小片段多肽,從而表現(xiàn)出了高水解度的特點。中性蛋白酶對海參蛋白的水解作用稍低于堿性蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶所含酶的種類復(fù)雜,作用范圍較廣,能夠進(jìn)行比較徹底的酶解。胰蛋白酶和木瓜蛋白底物位點的專一性較高。胃蛋白只能促進(jìn)各種水溶性蛋白質(zhì)水解成為多肽,所以其水解能力相對較弱。

2.1.2 六種酶對海參體壁ACE抑制活性的影響 測定六種蛋白酶不同酶解時間的ACE抑制活性,探討DH對ACE抑制活性的影響,結(jié)果見圖2。在水解反應(yīng)的初期,ACE抑制率隨水解度的升高而不斷上升,在反應(yīng)后期,水解液的ACE抑制率均有不同程度的下降,可能是因為水解前期具有ACE抑制活性的肽段就被迅速釋放出來了,后期ACE抑制肽被降解為無活性的肽或氨基酸,導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抑制活性降低。這說明高水解度不一定具有高ACE抑制活性,即水解度與ACE抑制率之間不存在漸減或漸增的對應(yīng)關(guān)系。由于實驗的主要目的是制備ACE 抑制活性強的多肽,ACE抑制活性被作為考察選酶的關(guān)鍵因素,因此選用中性蛋白酶作為制備海參體壁ACE抑制肽的酶。

圖2 蛋白酶水解產(chǎn)物ACE活性進(jìn)程曲線Fig.2 ACE inhibitory activity curves of hydrolysates

2.2單因素實驗

2.2.1 酶解時間對ACE抑制活性的影響 由圖3可知,酶解5 h時,其ACE抑制率最強。當(dāng)酶解時間在4～5 h,隨時間的延長,ACE抑制率增加明顯,可能是活性肽量增多。在5～8 h時,ACE抑制率逐漸變小,可能是過度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽或游離氨基酸。

圖3 時間對海參ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of time on ACE inhibitory activity

2.2.2 酶解溫度對ACE抑制活性的影響 由圖4可知,海參多肽ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢,溫度為50 ℃時,ACE抑制率最高,達(dá)到54.3%,溫度為60 ℃時,ACE抑制率最低,達(dá)到27.6%,可以看出溫度對酶的作用影響較大?？赡茉蚴菧囟容^低時,沒達(dá)到中性蛋白酶的最適溫度,酶未充分發(fā)揮功效。當(dāng)溫度過高時,酶結(jié)構(gòu)破壞,酶活力降低。

圖4 溫度對海參ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature on ACE inhibitory activity

2.2.3 酶解pH對ACE抑制活性的影響 由圖5可知,pH7.5時ACE抑制率最強,為51.2%,但隨pH變化ACE抑制率變化不顯著(p>0.05),可能是由于中性蛋白酶適應(yīng)的pH較廣。由于pH對抑制率影響不明顯,因此不作為響應(yīng)面研究因素,選擇抑制率最強點pH7.5作為響應(yīng)面實驗的pH。

圖5 pH對海參ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of pH value on ACE inhibitory activity

2.2.4 酶量對ACE抑制活性的影響 由圖6可知,ACE抑制率隨著酶量的增加而升高,酶量3000 U/g時到達(dá)最大值,而后減小,4000 U/g后活性基本保持不變?？赡苁敲噶康脑黾?促進(jìn)蛋白水解出活性多肽。當(dāng)酶到一定量時,部分活性多肽被水解成無活性的小分子肽或游離氨基酸,而后趨于穩(wěn)定。

表4 回歸系數(shù)模型及方差分析表Table 4 Coefficient of regression model and variance analysis

圖6 酶量對海參ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on ACE inhibitory

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析 以時間(X1)、溫度(X2)、酶量(X3)為響應(yīng)變量,以ACE抑制率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行實驗,結(jié)果見表3。經(jīng)過Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件處理,得到3個因素與響應(yīng)值的回歸方程為:

Y=54.86+2.63X1-2.56X2+2.89X3+0.2X1X2+0.65X1X3-3.42X2X3-6.72X12-5.59X22-7.24X32

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.3.3 驗證實驗 按照最佳提取條件進(jìn)行實驗驗證,重復(fù)三次,同時考慮到實際操作的便利,將ACE抑制肽的最佳酶解條件修正為:酶解溫度50 ℃、pH7.5、加酶量3000 U/g、酶解5 h。實際測得的ACE抑制率為56.5%。

2.4酶解液的相對分子量分布

混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜,如圖8,以Rt-lgMw 作對數(shù)曲線如圖9,得到方程:lgMw=-0.4423Rt+7.9916(R2=0.9978)。圖10為中性蛋白酶最佳條件下酶解產(chǎn)物HPLC圖。根據(jù)方程式,海參酶解液的相對分子量2000 Da以上占13.25%,1000～2000 Da占28.21%,1000～200 Da占了44.1%,200～1000Da組分占的比例較大,這現(xiàn)象與具有ACE抑制活性的多肽主要集中在的2～10肽相符合[21]。

表5 中性蛋白酶酶解液相對分子量分布Table 5 Molecular weight distribution (percent of the total area)of protein hydrolysate

圖7 酶量和時間對酶解液ACE抑制率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 Response surface plot and contour plot revealing effects of amount of enzyme and time on ACE inhibitory rate of hydrolysates

圖8 混合標(biāo)樣色譜圖像Fig.8 Chromatogram image of mixed standard sample

圖9 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of relative molecular weight

圖10 中性酶酶解液的分子量分布色譜圖Fig.10 The molecular weight distribution of the protein hydrolysates

3 結(jié)論

實驗通過初步分析水解度與ACE抑制活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)水解度與ACE抑制率之間不存在著對應(yīng)關(guān)系。六種海參體壁蛋白酶解物中,中性蛋白酶解物的ACE抑制率最好。通過采用單因素和響應(yīng)面法,中性蛋白酶其最佳水解工藝條件為50 ℃、pH7.5、酶量3000 U、酶解5 h條件下,所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高,達(dá)到56.5%,抑制肽濃度為21.5 mg/mL,此條件下酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析,海參多肽在200～1000 Da(2～10肽)間占了44.1%。

[1]Kuo P. The contribution of depression to mortality among elderly with self-reported hypertension:Analysis using a national representative longitudinal survey[J]. Hypertens,2011,29:2084-2090.

[2]DW Cushman.Development and design of specific inhibitors of angiotensin converting enzyme[J]. American Journal of Cardiology,1982,49(6):1390-1394.

[3]MurrayBA,FitzgeraldRJ. Angiotensin converting enzyme Inhibitory peptides derived from food proteins:bioche emistry,bioactivity production[J].Curr Pharm Des,2011,13:773-791.

[4]Vercruysse L,Van Camp J. ACE inhibitory peptides derived from enzymatic hydrolysates of animal muscle protein[J].Agric Food Chem,2005,53:8106-8115.

[5]Fitzgerald C,Mora-Soler L.Isolation and characterization of bioactive pro-peptides withinvitrorenin inhibitory activities from the macroalga Palmaria palmata[J]. Agric Food Chem,2010,60:7421-7427.

[6]Hao Wu.Hydrolysis and purification of ACE inhibitory peptides from the marine microalga Isochrysis galbana [J].J Appl Phycol,2015,27:351-361.

[7]Lun HH,Lan CX,Yun SC.Analysis of novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from Protease hydrolyzed marine shrimp Acetes chinensis[J].Pept Sci,2006,12:726-733.

[8]Neyssene Aissaoui. ACE inhibitory and antioxidant activities of red scorpionfish(Scorpaena notata)protein hyohydrolysates[J]. Food Sci Technol,2015,52(11):7092-7102.

[9]Neyssene Aissaoui. ACE Inhibitory and Antioxidant Activities of Novel Peptides from Scorpaena notata Byprodu protein Hydrolysate[J]. Int J Pept Res Ther,2017,23:13-23.

[10]Bougatef A,Nedjar-Arroume N. Angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory activities of sardinelle(Sardinella aurita)by-products protein hydrolysates obtained by treatment withmicrobial and visceral fish serine-proteases[J]. Food Chem,2008,11:350-356.

[11]Zhao Y,Bafang L,Dong S. Anovel ACE inhibitory peptide isolated from Acaudina molpa-dioidea hydrolysate [J]. Peptides,2009,30:1028-1033.

[12]伍強.利用鮑魚性腺制備ACE抑制肽[J]. 中國食品學(xué)報,2015,15(10):91-98.

[13]胡曉倩. 海參主要活性成分對大鼠脂質(zhì)代謝影響的比較研究[J].食品科學(xué),2009,30(23):393-396.

[14]李冰袁. 刺參對運動小鼠抗疲勞作用的研究[J].食品科學(xué),2010,31(15):244-247.

[15]童靜靜,章元炳.海參多肽的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(11):356-360.

[16]麗霞海.海參多肽生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2015,36(9):215-219.

[17]Zhao Yuanhui,LI Bafang. Antihypertensive effectand purification of an ACE inhibitory peptide from sea cucumber gelatinhydrolysate[J]. Process Biochemistry,2007,42(12):1586-1591.

[18]G Raheleh,Z Mohammad. Angiotensin-I Converting Enzyme(ACE)Inhibitory and Anti-Oxidant Activities of Sea Cucumber(Actinopyga lecanora)Hydrolysates[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(12):28870-28885.

[19]楊文博,張英華. 蛋白質(zhì)水解度的測定方法研究[J]. 中國調(diào)味品,2014,39(3):88-91.

[20]Fitz Gerald R J,Meisel H. Milk protein-derived peptide inhibitors of Angiotmsin-converting enzyme[J]. BrJNutr,2000,84:33-37.

[21]呂樂,劉冬,萬紅霞,等.堿性蛋白酶 Alcalase 酶解大米蛋白制備小分子肽的動力學(xué)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014,30(7):150-153.

StudyonhydrolysisconditionandmolecularweightdistributionofACEinhibitorypeptidederivedfromseacucumberprotein

ZHOUFeng-fang,CAIBin-xin,WUXin-rui,LUOFen

(Department of Biology,Ningde Normal University,Ningde 352100,China)

With the hydrolysis degree and ACE inhibitory rate the index,the optimum enzyme was selected for hydrolyzing sea cucumber protein. The optimal condition for enzymatic hydrolysis was investigated through single factor experiment and orthogonal. HPLC was used to determine the molecular distribution of the hydrolysate. The results showed that the optimum enzyme was neutral protease. The optimized parameters were temperature 50 ℃,time 5h,pH7.5 and amount of enzyme 3000U/g . Under this condition,ACE inhibition rate was up to 56.5% and the relative molecular weight of 200～1000 Da(2～10 peptides)reached 44.1% .

sea cucumber;the degree of hydrolysis(DH);ACE inhibitory peptide;molecular weight distribution

2017-02-20

周逢芳(1978-),男,碩士，講師，研究方向：活性物質(zhì)提取和功能研究，E-mail:zhoufengfang123@163.com。

福建省科技重點項目(2014N0016);寧德科技局項目(20130139);校級項目(2015T10)。

TS201.2

:B

:1002-0306(2017)17-0163-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.031