,,,, ,,4,,,3,4,*

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 212013;4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

丁香乙酸乙酯相抑制LDL中賴氨酸、色氨酸氧化修飾的研究

萬嚴(yán)1,2,楊瓊玉1,2,曲文娟1,3,謝麗琴1,郝澍1,2,沈勇根1,4,張良慧1,2,江慎華1,2,3,4,*

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 212013;4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

低密度脂蛋白(LDL)所含的色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)發(fā)生氧化修飾是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成的重要因素。為反映丁香乙酸乙酯相(EAFC)對(duì)LDL氧化過程中Trp、Lys修飾的抑制作用,本文首先對(duì)LDL氧化評(píng)價(jià)孵育體系中氧化劑CuSO4及底物L(fēng)DL濃度進(jìn)行優(yōu)化;進(jìn)而以熒光為主要指標(biāo)對(duì)這種抑制效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,選定CuSO4濃度1.25、25 μmol/L與LDL濃度500 μg/mL為配比做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。20 μg/mL EAFC能抑制Trp降解導(dǎo)致的熒光淬滅,抑制作用顯著高于1 μg/mL陽(yáng)性對(duì)照(2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚,BHT)(p<0.01)。3 μg/mL EAFC能抑制高反應(yīng)活性醛修飾Lys,10 μg/mL EAFC能顯著抑制Lys與4-HNE共價(jià)結(jié)合(p<0.01)。15 μg/mL EAFC能有效抑制Lys與MDA交聯(lián),抑制效果強(qiáng)于1 μg/mL BHT。15 μg/mL EAFC能顯著抑制脂褐素形成(p<0.01)。本文為后期解析EAFC抑制LDL氧化修飾作用方式、抑制氧化LDL與清道夫受體之間識(shí)別等作用機(jī)理提供參考。

丁香,ApoB-100,低密度脂蛋白,色氨酸,賴氨酸

低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)是由脂質(zhì)和載脂蛋白B-100(Apolipoprotein B-100,ApoB-100)組成的球狀分子,是血液中膽固醇主要載體[1-2]。LDL由74%～79%脂質(zhì)和21%～26%蛋白組成[2]。LDL極易被氧化修飾產(chǎn)生醛類如4-羥基壬稀酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛,(Malondialdehyde,MDA)等,這些產(chǎn)物能氧化修飾LDL的蛋白質(zhì)(ApoB-100)中相應(yīng)氨基酸殘基[3-5]。ApoB-100(4536個(gè)氨基酸殘基,分子量為513 kDa)是LDL主要的蛋白質(zhì)成分,為L(zhǎng)DL識(shí)別受體的配基。每個(gè)ApoB-100分子含有357個(gè)賴氨酸(Lysine,Lys)殘基及37個(gè)色氨酸(Tryptophan,Trp)殘基[2,6]。因Trp具有高熒光量子產(chǎn)率,為蛋白質(zhì)主要的內(nèi)在熒光團(tuán)。LDL氧化修飾導(dǎo)致Trp熒光發(fā)生淬滅[7]。同時(shí),LDL脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物容易氧化Lys經(jīng)一系列生化反應(yīng)最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)產(chǎn)生[5,8]。ApoB-100氧化修飾對(duì)促進(jìn)ox-LDL形成及AS具有重要影響。因此,研究天然產(chǎn)物以及功能食品在減輕醛類對(duì)LDL中ApoB-100氧化修飾備受關(guān)注[9]。

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾,為國(guó)家公布的藥食兩用植物,是非常有價(jià)值的香料及東亞傳統(tǒng)藥物,具有很多藥理功效[10-13]。

由于在ApoB-100氧化修飾過程中,Trp在Ex295/Em330處的熒光發(fā)生淬滅?；钚匀┡cLys發(fā)生衍生化,Lys衍化程度越高其熒光光譜變化越明顯[14]。同時(shí),熒光光譜具有高靈敏度、選擇性和多功能性等優(yōu)勢(shì)[15],被廣泛運(yùn)用于蛋白熒光特性的表征[16]。

實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,丁香在87種藥食兩用原料中總多酚含量及FRAP值最高、抗氧化能力最強(qiáng)[17]。丁香乙酸乙酯相在其非油類成分中抑制LDL氧化能力最強(qiáng)[18]。Chen等[19]還發(fā)現(xiàn)丁香甲醇粗提物能夠有效抑制蛋白氧化修飾作用。Yang 等[14]通過熒光光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)丁香有效部位能有效抑制LDL氧化過程中共軛二烯(CD)產(chǎn)生、膽固醇降解及Lys游離氨基活性降解。江慎華等[2]發(fā)現(xiàn)丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL弱氧化過程中硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)生產(chǎn)、CD產(chǎn)生、及Lys游離氨基活性降解。但是,丁香乙酸乙酯相在氧化修飾過程中對(duì)LDL所含ApoB-100中Lys、Trp氧化修飾的抑制效果尚不清楚。

因此,本文以熒光定量及掃描為指標(biāo),評(píng)價(jià)EAFC抑制LDL氧化修飾過程中Trp降解、Lys修飾的效果,以期為解析EAFC抑制LDL氧化修飾作用方式、抑制ox-LDL與清道夫受體之間識(shí)別等作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

丁香 江西黃慶仁棧華氏大藥房,批號(hào):1511008,生產(chǎn)日期:2015年11月20號(hào),由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司分裝,產(chǎn)自廣西。材料買回后高速粉碎、過40目篩后置冰箱中備用。LDL依據(jù)江慎華等[2]方法自中分離得到。

肝素鈉、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 上海阿拉丁試劑有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

日立F-4500熒光分光光度計(jì) 日本島津公司;UNIC7200可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)公司;PB-10 pH計(jì) Sartorius儀器設(shè)備有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;DFY-C高速粉碎機(jī) 溫嶺林大機(jī)械公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LJL10冷凍干燥機(jī) 鞏義市予華儀器有限公司;透析袋(SP132544) 上海源葉生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物活性追蹤法提取EAFC 采用江慎華等[2]方法,稱取200 g丁香干粉,甲醇提取,料液比1∶10 (g/mL)、60 ℃、180 r/min水浴振蕩提取40 min,重復(fù)以上操作再次提取,合并兩次提取液、運(yùn)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。取1/10溶液濃縮獲得丁香粗提物。剩余溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加入濃縮液3倍體積蒸餾水超聲輔助混懸后,向該混懸液液中依次加入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇充分萃取(每次溶劑用量200 mL,每種溶劑萃取10次),各萃取相及剩余水相分別濃縮后置于-68 ℃超低溫冰箱預(yù)凍過夜后,置冷凍干燥機(jī)中凍干,72 h后獲干粉,分裝、密封后置真空干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LDL提取 采用江慎華等[2]方法。在磁力攪拌作用下,將血漿(300 mL)與沉淀液(0.064 mol/L檸檬酸鈉,50000 U/L肝素鈉,5 mol/L鹽酸調(diào)pH至5.04)按1∶10體積比混勻。37 ℃水浴靜置15 min后,4 ℃、3000 r/min離心10 min,棄上清。收集沉淀后加入1500 mL洗滌液(0.064 mol/L檸檬酸鈉5 mol/L鹽酸調(diào)pH至5.11)洗滌沉淀。離心(10 min 4 ℃ 3000 r/min)棄上清、收集沉淀,用少量磷酸鹽緩沖液(PBS)(160 g/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4)溶解LDL并于4 ℃透析24 h,每6 h更換一次PBS。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品、按Lowry法[20]測(cè)定LDL中蛋白質(zhì)含量,以該蛋白含量定量LDL濃度,4 ℃避光保存,一周內(nèi)用完。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方式為:y(OD)=0.013x(μg/mL)+0.0503,R2=0.9903。

圖1 生物活性追蹤法制備EAFCFig.1 The preparation scheme of EAFC based on bioassay guided method

1.2.3 確定LDL氧化孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量 用PBS將透析后的LDL蛋白濃度稀釋為250、500、1000 μg/mL,分別加入不同濃度氧化劑CuSO4(1.25、2.5、5、10、25、50 μmol/L),37 ℃孵育24 h后,加1% EDTA-Na2終止氧化反應(yīng),分別測(cè)定脂褐素含量、4-HNE對(duì)ApoB-100修飾作用釋放的熒光和Trp熒光強(qiáng)度。以及固定LDL濃度為500 μg/mL,分別加入1.25、2.5、5、10、25、50 μmol/L CuSO4對(duì)MDA-Lys和高反應(yīng)活性醛類修飾Lys及Trp熒光光譜進(jìn)行掃描。

1.2.4 EAFC對(duì)ox-LDL中Trp降解的抑制 設(shè)置促氧對(duì)照組(4.9 mL LDL+50 μL CuSO4+50 μL甲醇)、空白對(duì)照組(4.9 mL LDL+50 μL去離子水+50 μL甲醇)、2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)陽(yáng)性對(duì)照組和不同濃度的EAFC(4.9 mL LDL+50 μL CuSO4+50 μL BHT或EAFC)。LDL的終濃度為500 μg/mL,CuSO4終濃度為1.25、25 μmol/L。37 ℃水浴孵育14 h后進(jìn)行如下測(cè)定。

采用Ferretti 等[21]方法稍加修改,定量測(cè)定Ex295nm/Em330 nm處Trp熒光強(qiáng)度以評(píng)價(jià)各樣液抑制ApoB-100中Trp降解的效果。

采用De 等[8]方法稍加修改,固定Ex280 nm,在300～450 nm發(fā)射波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)各樣品進(jìn)行熒光掃描。

1.2.5 EAFC對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物修飾ApoB-100的抑制效果

1.2.5.1 EAFC抑制4-HNE與ApoB-100中Lys的ε-氨基共價(jià)結(jié)合 采用Itakura 等[22]方法稍加修改。按照1.2.4方法孵育14 h,測(cè)定Ex360 nm/Em430 nm處熒光強(qiáng)度,評(píng)價(jià)LDL氧化過程中4-HNE與ApoB-100中Lys的ε-氨基相互作用形成的熒光強(qiáng)度以及不同樣液的抑制效果。

1.2.5.2 EAFC抑制MDA與ApoB-100中Lys的ε-氨基相互作用 采用Yang等[14]方法,按照1.2.4方法孵育18 h,固定Ex390 nm、在400～550 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射波長(zhǎng),測(cè)定LDL氧化過程中MDA與ApoB-100中賴氨酸ε-氨基相互作用形成的熒光強(qiáng)度及不同樣液的抑制效果。

1.2.5.3 EAFC抑制高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys修飾效果 采用Yang 等[14]方法,按照1.2.4方法孵育18 h,固定Ex350 nm、在發(fā)射波長(zhǎng)400～550 nm內(nèi)對(duì)各樣品進(jìn)行熒 光掃描。

1.2.5.4 EAFC抑制LDL氧化過程中脂褐素產(chǎn)生 采用Sutherland 等[23]方法稍加修改。按照1.2.4方法孵育14 h,在5 nm狹縫條件下測(cè)定Ex350 nm/Em460 nm處熒光強(qiáng)度,測(cè)定EAFC對(duì)LDL氧化過程中脂褐素產(chǎn)生的抑制效果。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1確定LDL氧化孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量

Cu2+誘導(dǎo)氧化時(shí),LDL中不飽和脂肪酸氧化形成大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[24]。已經(jīng)證實(shí),在LDL氧化過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能誘導(dǎo)LDL結(jié)構(gòu)和功能改變[21]。由于不同的LDL以及CuSO4添加量對(duì)LDL氧化中各評(píng)價(jià)體系的結(jié)果具有影響[18]。因此,本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)氧化孵育體系中LDL及CuSO4添加量進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3所示。

2.1.1 確定Trp熒光淬滅、4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合、脂褐素孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量 ApoB-100是LDL主要的蛋白質(zhì)成分,在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中作為配基識(shí)別LDL受體[6]。ApoB-100分子含有的37個(gè)Trp是LDL主要的內(nèi)在熒光團(tuán)[2],隨LDL氧化其熒光會(huì)發(fā)生淬滅[7],該熒光淬滅越多表示LDL蛋白質(zhì)氧化越嚴(yán)重[25]。為確定Trp熒光孵育體系中LDL和CuSO4的適宜添加量,采用1.2.3中方法測(cè)定,結(jié)果如圖2a所示。當(dāng)LDL為500 μg/mL時(shí),CuSO4濃度在0～25 μmol/L范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度隨濃度增強(qiáng)而減弱,在25～50 μmol/L范圍內(nèi)時(shí),熒光強(qiáng)度隨濃度增強(qiáng)而有所增強(qiáng)。當(dāng)LDL濃度為250或1000 μg/mL時(shí),CuSO4濃度在0～50 μmol/L范圍內(nèi)Trp熒光強(qiáng)度均未出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)。該結(jié)果表明,Trp熒光淬滅的評(píng)價(jià)體系中LDL和CuSO4適宜濃度分別為500 μg/mL和25 μmol/L。

4-HNE是重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其與蛋白質(zhì)形成的加成物影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[26]。通過檢測(cè)Ex360 nm/Em430 nm的熒光,可以檢測(cè)LDL氧化中4-HNE與Lys結(jié)合[20]。脂褐質(zhì)為氧化和交聯(lián)的蛋白質(zhì)、脂類以及少量碳水化合物組成的復(fù)雜混合物[27]。該混合物由醛式的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)反應(yīng)生成,在衰老細(xì)胞、血漿、ox-LDL以及AS損傷中均有分布,其在血漿中的濃度是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化標(biāo)志[23]。為確定4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合、脂褐素孵育體系中LDL和CuSO4的適宜添加量,采用1.2.3節(jié)方法測(cè)定結(jié)果如圖2b、圖2c所示。當(dāng)LDL濃度為500 μg/mL時(shí),CuSO4濃度在0～25 μmol/L范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度隨CuSO4濃度增加而增強(qiáng),而CuSO4濃度在25～50 μmol/L熒光強(qiáng)度隨Cu2+濃度增加而減弱。而LDL濃度在250、1000 μg/mL時(shí),CuSO4在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)氧化程度均未出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)。因此,4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合、脂褐素評(píng)價(jià)體系中LDL和CuSO4適宜濃度為500 μg/mL和25 μmol/L。

圖2 不同LDL和CuSO4條件下LDL氧化產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度Fig.2 The fluorescence intensity of LDL oxidation under different CuSO4 and LDL conditions注:(a)Trp激發(fā)熒光;(b)4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合;(c)脂褐素。

2.1.2 Trp熒光光譜、MDA-Lys、高反應(yīng)活性醛類修飾Lys孵育體系中CuSO4適宜添加量 天然ApoB-100中Trp熒光光譜在332 nm附近有最大吸收[25],隨著LDL氧化,最大吸收逐漸降低[2]。為進(jìn)一步驗(yàn)證2.1.1反應(yīng)體系中LDL濃度及CuSO4添加量,本文進(jìn)一步掃描Trp熒光光譜,結(jié)果如圖3a所示。當(dāng)CuSO4在0～50 μmol/L之間時(shí),熒光掃描峰值隨著CuSO4濃度升高而降低。加入25、50 μmol/L CuSO4后Trp熒光光譜幾乎重疊。掃描光譜圖熒光強(qiáng)度及走勢(shì)越低,表明LDL氧化越嚴(yán)重,添加丁香樣品后更容易反映其抑制效果。圖3a結(jié)果在該孵育體系中CuSO4濃度為25 μmol/L比較適宜,驗(yàn)證了上述圖2a測(cè)定結(jié)果。

LDL氧化過程中還會(huì)產(chǎn)生另一種高反應(yīng)活性醛(MDA),MDA能與Lys交聯(lián)形成MDA-Lys[28-29]。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物-各種醛類修飾Lys的ε-氨基,形成Ex350 nm/Em420 nm處有強(qiáng)熒光吸收的物質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法正確折疊乃至降解[6,22]。熒光強(qiáng)度越高,代表LDL氧化修飾越嚴(yán)重,添加丁香樣品后更容易反映其抑制氧化修飾效果。因此,分別固定Ex390 nm,Ex350 nm掃描發(fā)射波長(zhǎng)反映Lys光譜變化,確定MDA-Lys和高反應(yīng)活性醛類修飾Lys孵育體系中CuSO4的最適濃度。結(jié)果如圖3b、圖3c所示。當(dāng)CuSO4為1.25 μmol/L時(shí),MDA-Lys熒光光譜峰值明顯降低,高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys修飾的光譜峰值明顯升高,隨著CuSO4濃度進(jìn)一步升高,光譜峰值變化不大。結(jié)果表明MDA-Lys和高反應(yīng)活性醛類修飾Lys的熒光光譜孵育體系中CuSO4的最適濃度為1.25 μmol/L。

圖3 在不同CuSO4濃度條件下500 μg/μLLDL氧化形成的熒光強(qiáng)度Fig.3 The fluorescence intensity of 500 μg/μL LDL oxidation at different CuSO4 concentrations注:(a)Trp熒光光譜;(b)MDA-Lys;(c)高反應(yīng)活性醛類修飾Lys。

2.2 EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp降解的抑制作用

2.2.1 EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp降解導(dǎo)致熒光淬滅的定量測(cè)定 由上述2.1確定混合孵育體系中LDL和CuSO4最適濃度后,采用1.2.4方法測(cè)定EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp降解抑制作用的結(jié)果如圖4所示。與促氧相比,添加15、20 μg/mL EAFC后Trp熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(p<0.01),濃度越高、抑制效果越好,并且20 μg/mL EAFC的抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照(1 μg/mL)(p<0.01)。表明EAFC能有效抑制Trp降解。

圖4 EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.4 Inhibition efficiency of EAFC on Trp fluorescence quenching 注:不同字母表示差異極顯著,p<0.01,圖6,圖9同。

2.2.2 EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp降解導(dǎo)致熒光淬滅的掃描分析 2.2.1中結(jié)果表明EAFC能有效抑制Trp熒光淬滅,在此基礎(chǔ)上根據(jù)1.2.4方法通過熒光掃描評(píng)價(jià)各樣品對(duì)LDL氧化過程中Trp熒光光譜變化的抑制效果,結(jié)果如圖5所示。與促氧相比,添加1 μg/mL EAFC后其熒光光譜最大吸收增強(qiáng),且隨EAFC濃度升高其最大吸收峰逐漸增強(qiáng)。20 μg/mL EAFC的抑制效果強(qiáng)于1 μg/mL BHT。該結(jié)果與圖4定量測(cè)定結(jié)果相互佐證,進(jìn)一步證明EAFC能夠有效抑制氧化LDL中Trp降解。EAFC對(duì)Trp降解的抑制作用可能是通過抑制Cu2+與ApoB-100結(jié)合,從而避免蛋白質(zhì)的氨基酸殘基被修飾[30]。Ferretti 等[21]研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇也能抑制LDL氧化過程中Trp降解。

圖5 EAFC對(duì)LDL氧化過程中Trp產(chǎn)生熒光光譜變化的影響Fig.5 The influence of EAFC on Trp fluorescence spectroscopy

2.3 EAFC抑制LDL氧化過程中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對(duì)ApoB-100中Lys的修飾作用

LDL氧化過程中,不僅ApoB-100的Trp會(huì)降解,Lys也會(huì)受醛類修飾[31]。由2.2結(jié)果可知EAFC能有效抑制ApoB-100中Trp降解,本節(jié)進(jìn)一步分析EAFC對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物修飾ApoB-100中Lys的抑制效果。

2.3.1 EAFC抑制LDL氧化過程中4-HNE與ApoB-100中Lys共價(jià)結(jié)合效果 LDL經(jīng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成的4-HNE是一種能與Lys共價(jià)結(jié)合的醛類[20]。采用1.2.5.1節(jié)方法測(cè)定EAFC對(duì)4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合的抑制作用,結(jié)果如圖6所示。與空白相比,促氧熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(p<0.01)。添加10 μg/mL EAFC后熒光強(qiáng)度較促氧顯著減弱(p<0.01),且隨著EAFC濃度提高,熒光強(qiáng)度逐漸減弱。表明EAFC能有效抑制4-HNE對(duì)ApoB-100中Lys的修飾作用,但EAFC的抑制效果顯著低于10 μg/mL BHT。Keller等[32]研究發(fā)現(xiàn)仙人掌多酚和黃酮能夠抑制4-HNE的毒性。EAFC抑制4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合,也可能是由其所含的多酚和黃酮起作用。

圖6 EAFC對(duì)4-HNE與Lys的ε-氨基相互作用的抑制效果Fig.6 Inhibition efficiency of EAFC on covalent binding of 4-HNE to the lysine ε-amino group

2.3.2 EAFC抑制LDL氧化過程中MDA與Lys結(jié)合作用 由2.3.1分析可知EAFC能有效抑制4-HNE與Lys共價(jià)結(jié)合(圖6)。LDL脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的代表性醛類除了4-HNE外,還包含MDA[27]。因此,采用1.2.5.2節(jié)方法測(cè)定EAFC對(duì)MDA與Lys結(jié)合的抑制作用結(jié)果如圖7所示。與空白相比,促氧組熒光光譜最高。添加5 μg/mL EAFC后,熒光光譜及強(qiáng)度較促氧降低。當(dāng)EAFC升高到15 μg/mL后,熒光光譜進(jìn)一步降低,其熒光強(qiáng)度及掃描譜線甚至趨近于空白組,并強(qiáng)于1 μg/mL BHT,表明EAFC也能有效抑制MDA與Lys結(jié)合。實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)已表明EAFC能有效抑制LDL氧化過程中形成MDA[33]。因此,EAFC可能是通過抑制MDA產(chǎn)生、降低其含量而達(dá)到減少M(fèi)DA與ApoB-100中Lys交聯(lián)。

圖7 EAFC對(duì)MDA與Lys交聯(lián)作用的抑制效果Fig.7 Inhibition efficiency of EAFC on covalent binding of MDA to the Lys

2.3.3 EAFC抑制LDL氧化過程中高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys修飾作用 LDL脂質(zhì)過氧化中除了會(huì)產(chǎn)生2.3.1和2.3.2中的4-HNE和MDA,還包含許多其他的高反應(yīng)活性醛類[34]。因此,通過1.2.5.3方法測(cè)定分析EAFC抑制高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys修飾的效果,結(jié)果如圖8所示。與空白相比,促氧的熒光光譜峰值明顯升高。添加3 μg/mL和5 μg/mL EAFC后其熒光光譜峰值逐漸降低。以上結(jié)果表明EAFC能減緩LDL氧化過程中高反應(yīng)活性醛類對(duì)ApoB-100中Lys的修飾作用。Picard等[35]研究發(fā)現(xiàn)氨基胍能延緩高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys的修飾作用。

圖8 EAFC對(duì)高反應(yīng)活性醛類修飾Lys的熒光光譜的影響Fig.8 Effect of EAFC on fluorescence spectra of lysine by reactive aldehydes modification

2.4 EAFC抑制LDL氧化過程中脂褐素的形成

LDL在氧化過程中,除了ApoB-100中Trp會(huì)降解以及醛類會(huì)對(duì)Lys修飾外,ox-LDL產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物還能與ApoB-100反應(yīng)生成脂褐素[36]。為此,采用1.2.5.4方法通過測(cè)定脂褐素?zé)晒庾兓从矱AFC對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與ApoB-100反應(yīng)的抑制效果,結(jié)果如圖9所示。與促氧相比,添加15 μg/mL EAFC樣液后,其熒光強(qiáng)度顯著降低(p<0.01)。隨著EAFC濃度增加,熒光強(qiáng)度逐漸減弱。這些結(jié)果表明,EAFC也能有效抑制ox-LDL中脂褐素生成。王麗麗發(fā)現(xiàn)紫丁香葉提取物能抑制脂褐素形成[37]。LDL氧化修飾導(dǎo)致ApoB-100周圍極性發(fā)生改變使其更容易與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。EAFC可能是通過保護(hù)ApoB-100,使其極性不發(fā)生變化,從而使其不易于與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物結(jié)合[30]。

圖9 EAFC對(duì)LDL氧化過程中脂褐素形成的抑制效果Fig.9 Inhibition efficiency of ethyl acetate extract of clove on lipofuscin generated

3 結(jié)論

EAFC能抑制Trp的降解,延緩LDL氧化過程中ApoB-100的修飾,其抑制效果高于1 μg/mL BHT。

10 μg/mL EAFC能抑制4-HNE對(duì)Lys的修飾,當(dāng)EAFC濃度增加為15 μg/mL不僅能抑制脂褐素形成,對(duì)于Lys與MDA發(fā)生交聯(lián)的抑制效果強(qiáng)于1 μg/mL BHT(p<0.01),所以EAFC能抑制高反應(yīng)活性醛類對(duì)Lys修飾,延緩清道夫受體對(duì)ox-LDL的識(shí)別與吞噬。

EAFC抑制醛類對(duì)Lys修飾可能是通過抑制Trp的降解,從而減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的啟動(dòng),進(jìn)而減少醛類對(duì)Lys的修飾。

[1]Prassl R,Laggner P. Molecular structure of low density lipoprotein:current status and future challenges[J]. European Biophysics Journal,2009,38(2):145-158.

[2]江慎華,萬嚴(yán),楊瓊玉,等. 丁香有效部位對(duì)低密度脂蛋白弱氧化修飾的抑制效果[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2016,47(6):242-249.

[3]Lankin V Z,Tikhaze A K,Kapel’Ko V I,et al. Mechanisms of oxidative modification of low density lipoproteins under conditions of oxidative and carbonyl stress[J]. Biochemistry Biokhimiia,2007,72(10):1081-1090.

[4]Baohai S,Subramaniam P,Ioanna P,et al. Modifying apolipoprotein A-I by malondialdehyde,but not by an array of other reactive carbonyls,blocks cholesterol efflux by the ABCA1 pathway[J]. 2010,285(24):18473-18484.

[5]Stocker R,Jr K J. Role of oxidative modifications in atherosclerosis[J]. Physiological Reviews,2004,84(4):1381-1478.

[6]Kim G,Lee H,Oh H,et al. Solution state structure of P1,the mimetic peptide derived from Igm antigen ApoB-100 by NMR[J].2016,20(3):95-101.

[7]Sato A,Aoki J,Ebina K. Synthetic biotinylated peptide compound,BP21,specifically recognizes lysophosphatidylcholine micelles[J]. Chemical Biology & Drug Design,2012,80(3):417-425.

[8]De L P R,Barcelos R P,De Bem A F,et al. Oximes as inhibitors of low density lipoprotein oxidation[J]. Life Sciences,2008,83(25-26):878.

[9]Rahman M A,Abdullah N,Aminudin N. Antioxidative effects and inhibition of human low density lipoprotein oxidationinvitroof polyphenolic compounds in flammulina velutipes(golden needle mushroom)[J]. Oxidative Medicine & Cellular Longevity,2015,2015(10):1-10.

[10]江慎華,趙錦,劉常金,等. 采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取丁香總多酚工藝優(yōu)化及其高效原因分析[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(24):243-247.

[11]Ryu B,Kim H M,Woo J H,et al. A new acetophenone glycoside from the flower buds ofSyzygiumaromaticum(cloves)[J]. Fitoterapia,2016,115:46-51.

[12]閆訓(xùn)友,杜洪利,朱愛紅,等. 丁香提取物對(duì)鮮切鴨梨保鮮效應(yīng)的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(4):347-350,355.

[13]Jin S,Cho K H. Water extracts of cinnamon and clove exhibits potent inhibition of protein glycation and anti-atherosclerotic activityinvitroandinvivohypolipidemic activity in zebrafish[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2011,49(7):1521-1529.

[14]Yang Q Y,Wan Y,Jiang S H,et al. The antioxidant inhibition of clove effective fraction on lipid and protein and spectra variation of LDL.[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2017,1(37):312-320.

[15]Chen Z,Liu Q,Wang S,et al. Study on hemorrhagin III purified from the venom of Agkistrodon acutus,by three-dimensional fluorescence spectrometry[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy,1999,55(9):1909-1914.

[16]Kumaran R,Ramamurthy P. Photophysical studies on the interaction of amides with Bovine Serum Albumin(BSA)in aqueous solution:Fluorescence quenching and protein unfolding[J]. Journal of Luminescence,2014,148(7):277-284.

[17]杜余輝,蔡志鵬,江慎華,等. 丁香有效部位清除超氧陰離子及對(duì)LDL糖基化抑制作用[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(15):80-85.

[18]江慎華,肖敏,江春霞,等. 生物活性追蹤法對(duì)丁香抗低密度脂蛋白氧化修飾的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013(9):2063-2067.

[19]Chen H,Diao J,Li Y,et al. The effectiveness of clove extracts in the inhibition of hydroxyl radical oxidation-induced structural and rheological changes in porcine myofibrillar protein[J]. Meat Science,2015,111(2):60-66.

[20]董學(xué)艷,姜鐵民,劉繼超,等. 高通量快速檢測(cè)母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量方法的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(5):308-310.

[21]Ferretti G,Bacchetti T,Masciangelo S,et al. Effect of phytosterols on copper lipid peroxidation of human low-density lipoproteins[J]. Nutrition,2010,26(3):296-304.

[22]Itakura K,Oya T. Detection of lipofuscin-like fluorophore in oxidized human low-density lipoprotein. 4-hydroxy-2-nonenal as a potential source of fluorescent chromophore.[J]. Febs Letters,2000,473(2):249-253.1.4.5.

[23]Sutherland W H,Williams M J,Jong S A D. Plasma protein lipofuscin-like fluorophores in men with coronary artery disease treated with statins[J]. Archives of Medical Research,2007,38(7):757-763.

[24]Yu L H,Liu G T,Sun Y M,et al. Antioxidative effect of schisanhenol on human low density lipoprotein and its quantum chemical calculation[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2004,25(8):1038-44.

[25]Portella R D L,Barcelos R P,Rosa E J F D,et al. Guaraná(Paullinia cupana,Kunth)effects on LDL oxidation in elderly people:aninvitro,andinvivo,study[J]. Lipids in Health & Disease,2012,12(1):12.

[26]Castro J P,Jung T,Grune T,et al. 4-Hydroxynonenal(HNE)modified proteins in metabolic diseases[J]. Free Radical Biology & Medicine,2016.

[27]Nowotny K,Jung T,Grune T,et al. Accumulation of modified proteins and aggregate formation in aging[J]. Experimental Gerontology,2014,57(9):122-131.

[28]Huang G S,Wang Z P,Wang S C,et al. Intracellular generation of MDA-LYS epitope in foam cells[J]. Life Sciences,1999,65(3):285-296.

[29]Uchida K,Sakai K,Itakura K,et al. Protein Modification by lipid peroxidation products:formation of malondialdehyde-derived N′-(2-Propenal)lysine in proteins[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics,1997,346(1):45-52.

[30]Barcelos R P,Portella R L,Da R E,et al. Thiosemicarbazone derivate protects from AAPH and Cu2+-induced LDL oxidation[J]. Life Sciences,2011,89(1-2):20.

[31]Vanderyse L,Devreese A M,Baert J,et al. Structural and functional properties of apolipoprotein B in chemically modified low density lipoproteins[J]. Atherosclerosis,1992,97(2-3):187.

[32]Keller J. Antiatherogenic and antitumoral properties of Opuntia cladodes:inhibition of low density lipoprotein oxidation by vascular cells,and protection against the cytotoxicity of lipid oxidation product 4-hydroxynonenal in a colorectal cancer cellular model[J]. Journal of Physiology and Biochemistry,2015,71(3):577-587.

[33]劉仁綠,肖敏,江衛(wèi)青,等. 訶子粗提物及不同極性部位抑制低密度脂蛋白氧化修飾的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(16):100-104.

[34]Esterbauer H,Jürgens G,Quehenberger O,et al. Autoxidation of human low density lipoprotein:loss of polyunsaturated fatty acids and vitamin E and generation of aldehydes[J]. Journal of Lipid Research,1987,28(5):495.

[35]Picard S,Parthasarathy S,Fruebis J,et al. Aminoguanidine inhibits oxidative modification of low density lipoprotein protein and the subsequent increase in uptake by macrophage scavenger receptors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,1992,89(15):6876-6880.

[36]Candide C,Reyftmann J P,Santus R,et al. Modification of ε-amino group of lysines,cholesterol oxidation and oxidized lipid-apoprotein cross-link formation by porphyrin-photosensitized oxidation of human low density lipoproteins[J]. Photochemistry & Photobiology,1988,48(2):137.

[37]王麗麗,趙新淮. 紫丁香葉提取物對(duì)低密度脂蛋白氧化修飾的抑制作用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(5):641-644.

InhibitioneffectofethylacetatefractionofcloveonTrpandLysmodificationduringLDLoxidation

WANYan1,2,YANGQiong-yu1,2,QUWen-juan1,3,XIELi-qin1,HAOShu1,2,SHENYong-gen1,4,ZHANGLiang-hui1,2,JIANGShen-hua1,2,3,4,*

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China;2.Jiujiang Andehe Biotechnology Corporation Ltd,Jiujiang 332000,China;3.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products,Zhenjiang,212013,China;4.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods,Nanchang 330045,China)

Oxidative modification of Tryptophan(Trp)and Lysine(Lys)in apoB-100 of LDL is the important factor resulting in atherosclerosis(AS). In order to investigate the possible inhibition effect of Ethyl acetate fraction of clove(EAFC)on Trp and Lys oxidative modification during LDL oxidation,the concentrations of CuSO4and LDL were firstly optimized,and then this inhibition effects of EAFC against oxidation were evaluated by using fluorescence as the main index in this paper. The results indicated that the concentrations of CuSO4and LDL were 1.25,25 μmol/L and 500 μg/mL respectively in subsequent experiments. Fluorescence quenching can be inhibited by 20 μg/mL EAFC,and this inhibition effect was significantly higher than that of the 1 μg/mL butylated hydroxytoluene(positive control,BHT)(p<0.01). Likewise,3 μg/mL EAFC can inhibit the modification of Lys residues by highly reactive aldehydes. 10 μg/mL EAFC can dramatically inhibit covalent binding of 4-HNE with the Lys residues(p<0.01). The modification of Lys residues resulting from MDA was inhibited by EAFC(15 μg/mL)which was significant than that of 1 μg/mL BHT. Meanwhile,15 μg/mL EAFC showed a significant inhibition on formation of lipofuscin(p<0.01). This study provides references for further analyzing the inhibition way of EAFC and the mechanism that EAFC inhibits the recognition between ox-LDL and scavenger receptors.

clove;apolipoproteinb-100;low density lipoprotein;tryptophan;lysine

2017-03-06

萬嚴(yán)(1993-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：wanyanbio@163.com。

*通訊作者:江慎華(1973-)，男,博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā),E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360371，31560308，31301423);江西省科技支撐計(jì)劃(20151BBF60026);江西省教育廳項(xiàng)目(GJJ161081);江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(JAPP2010-5);江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金、九江學(xué)院人才啟動(dòng)基金、九江學(xué)院教改課題(2015-04)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0010-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.003