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(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東湛江 524001)

菠蘿蜜果皮活性成分的純化與結(jié)構(gòu)鑒定

彭芍丹,李積華,黃曉兵,林麗靜*

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東湛江 524001)

為了進(jìn)一步研究菠蘿蜜果皮中的活性成分,采用柱層析分離方法對(duì)菠蘿蜜果皮乙醇提取物進(jìn)行分離純化,利用硅膠柱、薄層層析和凝膠柱等分離手段,從菠蘿蜜醇提物的乙酸乙酯萃取部位中分離純化并鑒定了2種化合物,經(jīng)過(guò)1H-NMR和13C-NMR核磁共振波譜儀檢測(cè)后結(jié)構(gòu)已確定,分別為環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone)和環(huán)桉樹醇(cycloeucalenol)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的分離純化工藝,為全面研究菠蘿蜜的植物化學(xué)數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

菠蘿蜜果皮,活性成分,單體,結(jié)構(gòu)鑒定

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.),又稱波羅蜜、苞蘿、木菠蘿、樹菠蘿、大樹菠蘿等,是?？撇ぬ}蜜亞科菠蘿蜜屬常綠喬木,是世界著名的熱帶水果。自一千多年前從印度引入我國(guó)后,被廣泛的種植于我國(guó)的廣東省、廣西省、云南省、海南省、福建省和臺(tái)灣省等地區(qū),作為“全身都是寶”的熱帶珍果。菠蘿蜜不僅能作為鮮果供人們食用,其樹種更是集藥用和木材于一身的優(yōu)秀樹種,但是它的利用卻受到了很大的局限性。不同菠蘿蜜品種差異極大,品質(zhì)低下的部分樹種病害嚴(yán)重,再加上果實(shí)本身保鮮期極短,我國(guó)在其生產(chǎn)上的技術(shù)又不夠成熟和完善,在產(chǎn)業(yè)規(guī)模上就不足以支撐菠蘿蜜加工的發(fā)展,在市場(chǎng)上也滿足不了人們對(duì)產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量上的要求。除了菠蘿蜜果干一例較為成功的產(chǎn)品外,沒(méi)有其他對(duì)菠蘿蜜加工利用的好技術(shù)和方法,導(dǎo)致菠蘿蜜在我國(guó)也只能成為小眾水果,北方地區(qū)根本不能享用到菠蘿蜜果實(shí)的香甜。而國(guó)內(nèi)外對(duì)于菠蘿蜜的研究報(bào)道也不多,因此這方面的研究利用還是很值得開展的。

多項(xiàng)研究表明,菠蘿蜜果實(shí)具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1],Jagtap通過(guò)DPPH、FRAP和DMPD三種方法對(duì)成熟菠蘿蜜果肉的丙酮、甲醇、乙醇和水的提取物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià),均證明菠蘿蜜果肉具有很強(qiáng)的清除自由基活性,其中黃酮和多酚是菠蘿蜜果肉的抗氧化物質(zhì);Saxena A等用DPPH自由基清除法對(duì)氣調(diào)保藏菠蘿蜜果肉的甲醇提取物進(jìn)行抗氧化活性分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的果肉具有較好的抗氧化穩(wěn)定性,其對(duì)DPPH自由基的清除率與其中抗壞血酸和多酚含量呈正相關(guān)[2-3]。Soong等用ABTS法和FRAP法研究了脫脂后菠蘿蜜種子和果肉的乙醇提取物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)種子的抗氧化活性高于果肉,而且干制后樣品的抗氧化活性約為新鮮樣品的3倍,酚類化合物約貢獻(xiàn)了70%的抗氧化活性[4],烘干后成熟果實(shí)的乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除活性的IC50為410 μg/mL[5]。對(duì)于占整個(gè)果實(shí)約1/2的菠蘿蜜果皮的抗氧化活性則未見(jiàn)報(bào)道,而且已有研究證明了其果皮中黃酮類化合物含量豐富,黃酮類與抗氧化活性有密切的關(guān)系,本文作者已在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上得出菠蘿蜜果皮醇提物乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)抗氧化活性,因此本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)乙酸乙酯活性部位的進(jìn)一步純化,這對(duì)菠蘿蜜的綜合利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菠蘿蜜 采于湛江徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)(九成熟)。

無(wú)水乙醇,95%乙醇,鹽酸,甲醇,丙酮,乙酸乙酯,氯仿,石油醚 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑;實(shí)驗(yàn)用水 二次蒸餾水;100～200,200～300目柱層析硅膠、預(yù)制薄層層析板 青島海洋化工廠;Sephadex LH-20柱層析凝膠 Pharmacia公司;5%硫酸乙醇顯色劑、碘顯色劑 國(guó)藥集團(tuán)。

超高壓液相-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜Triple TOFTM 5600+/UPLC-Triple TOF MS/MS 美國(guó)AB Sciex公司;AV-600型核磁共振波譜儀 美國(guó)Bruker公司;HH-4恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、FA2104N天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī) 北京若比鄰公司;LR4002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司;DFT-150高速萬(wàn)能粉粹機(jī) 上海鼎廣有限公司;MS 3 digital振蕩器 德國(guó)IKA公司;冰箱 海爾集團(tuán)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酸乙酯部分的分離 即乙酸乙酯部分得到條件為菠蘿蜜果皮在80%乙醇、溫度65 ℃,料液比1∶3條件下提取三次得到的粗提物,再用石油醚、乙酸乙酯、水一次萃取后得到的乙酸乙酯部濃縮浸膏[6-7]。

取乙酸乙酯部分(184 g),使用100～200目硅膠拌樣后進(jìn)行常壓硅膠柱層析(硅膠100～200目),氯仿-甲醇系統(tǒng)(20∶1～10∶1～8∶1～4∶1～0∶1)梯度洗脫,得到8個(gè)流分,依次命名為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8。

Fr.3分離:取Fr.3部分,進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱層析(流動(dòng)相為氯仿∶甲醇1∶1),得到4個(gè)部分。其中第1份有白色狀物質(zhì)析出,重結(jié)晶得到白色固體物質(zhì)BLM-1(75 mg)。

Fr.8分離:取Fr.8部分,使用100～200目硅膠拌樣后進(jìn)行常壓硅膠柱層析(硅膠200～300目),氯仿-甲醇系統(tǒng)(1∶0～20∶1～10∶1～4∶1～0∶1)梯度洗脫,得到5個(gè)部分。其中第5個(gè)部分有白色固體析出,經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠純化后得到白色無(wú)定形固體BLM-2(約100 mg)。

Fr.1、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7等流分未純化出相應(yīng)單體物質(zhì)。另外,Fr.8中還分離出白色細(xì)小晶體BLM-3(約200 mg),故本研究以Fr.3和Fr.8作為研究對(duì)象。具體分離過(guò)程見(jiàn)下圖1。

圖1 乙酸乙酯部分離純化流程圖Fig.1 The flow chart of extraction and purification from the fraction of ethyl acetate

1.2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 采用核磁共振1H-NMR和13C-NMR,超高壓液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜等現(xiàn)代技術(shù)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和解析,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道最終鑒定各化合物結(jié)構(gòu)。具體方法如下。

顯色反應(yīng):乙酸酐-濃硫酸反應(yīng)(Liebermann-Burchard反應(yīng))。取乙醇提取液1～2 mL,揮去乙醇,殘?jiān)芙饣驊腋∮谝宜狒?滴加1滴濃硫酸,如呈紫紅色,并且在溶液上層逐漸變綠,證明含有甾體、三萜類或皂甙。

色譜條件:色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm(2.1 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)和水(B);流速0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL;梯度洗脫程序:0.0～2.0 min,10%～95% A;2.0～15.0 min,95% A。

質(zhì)譜條件:通過(guò)全掃描獲得一級(jí)譜圖,并通過(guò)數(shù)據(jù)采集模式獲得二級(jí)譜圖。電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式;質(zhì)量掃描范圍100～1000 m/z;離子源霧化氣:55 Psi;輔助加熱氣:55 Psi;氣簾氣:40Psi;輔助加熱溫度:550 ℃;噴霧電壓:-4500 V;去簇電壓:-80 V;碰撞能:一級(jí)-5 V,二級(jí)-35 eV;擴(kuò)展碰撞能量:15 eV。

核磁鑒定:采用Bruker AV-600核磁共振儀,1H-NMR和13C-NMR的觀察頻率頻率為600 MHz,溶劑為CDCl3。

2 結(jié)果與討論

2.1化合物BLM-1:環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone)的結(jié)構(gòu)

白色固體粉末(氯仿),分子式C30H48O,分子量為424.70。通過(guò)Liebermann-Burchard反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性,為甾類或三萜類化合物。在1H-NMR(CDCl3,600 MHz)譜中,δ5.10(1H,t,J=6.3 Hz,H-24)為1個(gè)雙鍵碳上質(zhì)子信號(hào),δ:1.70(3H,s,27-CH3)、1.82(3H,s,26-CH3)、1.25(3H,s,28-CH3)、1.11(3H,s,18-CH3)、0.92(3H,s,21-CH3)、1.05(3H,d,J=5.7 Hz,30-CH3)、1.25(3H,s,29-CH3)為7個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào);0.59(1H,d,J=4.2 Hz,H-19a)、0.08(1H,d,J=4.2 Hz,H-19b)為1對(duì)環(huán)阿屯烷類型三萜的特征亞甲基質(zhì)子信號(hào)。

13C-NMR(151 MHz,CDCl3)譜共給出30個(gè)碳信號(hào):35.58(C-1)、37.48(C-2)、216.63(C-3)、50.24(C-4)、48.44(C-5)、22.18(C-6)、25.97(C-7)、47.89(C-8)、20.77(C-9)、25.87(C-10)、26.74(C-11)、33.42(C-12)、45.33(C-13)、48.73(C-14)、35.87(C-15)、28.14(C-16)、52.29(C-17)、17.64(C-18)、32.79(C-19)、29.56(C-20)、19.29(C-21)、36.32(C-22)、27.73(C-23)、124.21(C-24)、130.94(C-25)、24.93(C-26)、18.22(C-27)、29.56(C-28)、28.14.(C-29)、18.08(C-30)以上數(shù)據(jù)對(duì)比文獻(xiàn)[8-11]中環(huán)阿爾廷醇波譜學(xué)數(shù)據(jù),除了3-C位變成了羰基,少了一個(gè)連氧碳上質(zhì)子信號(hào),其他部分都一致,故鑒定化合物BLM-1為環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone),有報(bào)道菠蘿蜜樹的葉子和莖中存在該化合物[12],但本研究是首次從菠蘿蜜果皮中純化得到。

表1 化合物BLM-1的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR of compound BLM-1

綜上所述分析,結(jié)合1H-NMR和13C-NMR譜中數(shù)據(jù)見(jiàn)表1,鑒定化合物BLM-1為環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone),化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖2 化合物BLM-1的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Thestuctures of compound BLM-1

2.2化合物BLM-2:環(huán)桉樹醇(cycloeucalenol)的結(jié)構(gòu)

白色細(xì)小針狀晶(氯仿),分子式C30H50O,分子量426.72。通過(guò)Liebermann-Burchard反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性,示為甾類或三萜類化合物。在1H-NMR(CDCl3,600 MHz)譜中,δ4.73(1H,t,J=6.3 Hz,H-24)為1個(gè)雙鍵碳上質(zhì)子信號(hào),δ0.17、δ0.38處是環(huán)丙基的兩個(gè)質(zhì)子信號(hào),δ1.08-1.39處是亞甲基的質(zhì)子信號(hào),δ0.91-1.60處是甲基的質(zhì)子信號(hào),δ3.20-3.28處是羥基附近的次甲基的質(zhì)子信號(hào)。

13C-NMR(151 MHz,CDCl3)譜共給出30個(gè)碳信號(hào):31.32(C-1)、37.81(C-2)、76.80(C-3)、43.33(C-4)、44.59(C-5)、24.67(C-6)、27.25(C-7)、46.88(C-8)、21.87(C-9)、29.71(C-10)、26.97(C-11)、35.34(C-12)、45.35(C-13)、48.90(C-14)、32.88(C-15)、25.17(C-16)、52.21(C-17)、17.79(C-18)、29.52(C-19)、19.13(C-20)、36.13(C-21)、35.01(C-22)、30.80(C-23)、156.92(C-24)、34.81(C-25)、23.55(C-26)、22.00(C-27)、105.93(C-28)、18.34.(C-29)、14.40(C-30)以上數(shù)據(jù)對(duì)比文獻(xiàn)[13-17]中環(huán)阿屯醇波譜學(xué)數(shù)據(jù),除了24-C和25-C位變成了雙鍵,其他部分都一致,故鑒定化合物BLM-2為環(huán)桉樹醇(cycloeucalenol),有報(bào)道菠蘿蜜樹的葉子和莖中存在該化合物,但本研究是首次從菠蘿蜜果皮中純化得到。

表2 化合物BLM-2的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)Table 2 1H-NMR and 13C-NMR of compound BLM-2

綜上所述分析,結(jié)合1H-NMR和13C-NMR譜中數(shù)據(jù)見(jiàn)表2,鑒定化合物BLM-2為環(huán)桉樹醇(cycloeucalenol),化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖3 化合物BLM-2的結(jié)構(gòu)式Fig.3 The stuctures of compound BLM-2

3 結(jié)論

本研究采用柱層析分離方法對(duì)菠蘿蜜果皮乙醇提取物進(jìn)行分離純化,利用硅膠柱、薄層層析和凝膠柱等分離手段,從乙酸乙酯部純化鑒定出BLM-1和BLM-2兩種化合物,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜、1H-NMR和13C-NMR核磁共振波譜儀檢測(cè)后結(jié)構(gòu)已確定,分別為環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone)和環(huán)桉樹醇(cycloeucalenol),均為三萜類的化合物,由于時(shí)間關(guān)系未能對(duì)化合物進(jìn)行進(jìn)一步的活性鑒定,據(jù)多處文獻(xiàn)報(bào)道,此類化合物都共同具有溶血、抗癌、抗炎、殺菌、殺軟體動(dòng)物、抗生育、增強(qiáng)免疫力等活性[18]。如,Titov等[5]對(duì)一些四環(huán)和五環(huán)三萜對(duì)七種人癌細(xì)胞的抗癌活性的構(gòu)效進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)3β,16α-二羥基-齊墩果-12烯在體外對(duì)HE6-1-A等6種癌細(xì)胞有抑制活性。用菌種Saccharomycescarlsbergensiss在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn),研究了49種五環(huán)三萜類化合物的抗真菌活性,結(jié)果表明C-27或28位有游離羧基的齊墩果酸和常春藤皂苷元的皂苷具有較強(qiáng)的抗真菌活性[19-20]。以上兩種化合物均有報(bào)道存在于菠蘿蜜樹的葉子和莖中,但果皮中尚未有報(bào)道。本研究對(duì)菠蘿蜜的進(jìn)一步研究有理論意義。

[1]Isabelle M,Lee B L,Lim M T,et al. Antioxidant activity and profiles of common fruits in Singapore[J]. Food Chemistry,2010,123(1):77-84.

[2]Saxena A,Bawa A S,Raju P S. Phytochemical changes in fresh-cut jackfruit(ArtocarpusheterophyllusL.)bulbs during modified atmosphere storage[J]. Food Chemistry,2009a,115(4):1443-1449.

[3]Saxena A,Bawa A,Raju P. Phytochemical changes in fresh-cut jackfruit(ArtocarpusheterophyllusL.)bulbs during modified atmosphere storage[J]. Food chemistry,2009b,115(4):1443-1449.

[4]Soong Y-Y,Barlow P J. Antioxidant activity and phenolic content of selected fruit seeds[J]. Food Chemistry,2004,88(3):411-417.

[5]Titov S. Antioxidant activities of some local Bangladeshi fruits(Artocarpusheterophyllus,Annonasquamosa,Terminaliabellirica,Syzygiumsamarangense,AverrhoacarambolaandOleaeuropa)[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2007,23(2):257-261.

[6]彭芍丹,李積華,唐永富,等.菠蘿蜜不同部位抗氧化性的研究.熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(9):1737-1741.

[7]彭芍丹,李積華,黃曉兵,等.菠蘿蜜果皮不同萃取部位抗氧化活性的研究.食品工業(yè)科技. 2014,35(20):82-85.

[8]Khan M,Omoloso A,Kihara M. Antibacterial activity of Artocarpus heterophyllus[J]. Fitoterapia,2003,74(5):501-505.

[9]Karthy E,Ranjitha P,Mohankumar A. Antimicrobial potential of plant seed extracts against multidrug resistant methicillin resistant Staphylococcus aureus(MDR-MRSA)[J]. International Journal of Biology,2009,1(1):34-40.

[10]Trindade M B,Lopes J L,Soares-Costa A,et al. Structural characterization of novel chitin-binding lectins from the genus Artocarpus and their antifungal activity[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,2006,1764(1):146-152.

[11]Ratnasooriya W,Jayakody J. Artocarpus heterophyllus seeds inhibits sexual competence but not fertility of male rats[J]. Indian journal of experimental biology,2002,40(3):304-308.

[12]Prakash O,Kumar R,Mishra A,et al. Artocarpus heterophyllus(Jackfruit):an overview[J]. Pharmacognosy Reviews,2009,3(6):353-358.

[13]Arung E T,Shimizu K,Kondo R. Inhibitory effect of isoprenoid-substituted flavonoids isolated from Artocarpus heterophyllus on melanin biosynthesis[J]. Planta medica,2006a,72(9):847-850.

[14]Arung E T,Shimizu K,Tanaka H,et al. 3-Prenyl luteolin,a new prenylated flavone with melanin biosynthesis inhibitory activity from wood of Artocarpus heterophyllus[J]. Fitoterapia,2010a,81(6):640-643.

[15]Arung E T,Wicaksono B D,Handoko Y A,et al. Cytotoxic effect of artocarpin on T47D cells[J]. Journal of natural medicines,2010b,64(4):423-429.

[16]Arung E T,Shimizu K,Kondo R. Inhibitory effect of artocarpanone from Artocarpus heterophyllus on melanin biosynthesis[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2006b,29(9):1966-1969.

[17]Sato M,Fujiwara S,Tsuchiya H,et al. Flavones with antibacterial activity against cariogenic bacteria[J]. Journal of ethnopharmacology,1996,54(2):171-176.

[18]喬鳳云,陳欣,余柳青. 抗氧化因子與天然抗氧化劑研究綜述[J]. 科技通報(bào),2006,22(3):332-336.

[19]Fernando M,Thabrew M,Karunanayake E. Hypoglycaemic activity of some medicinal plants in Sri-Lanka[J]. General Pharmacology:The Vascular System,1990,21(5):779-782.

[20]Fernando M,Wickramasinghe S,Thabrew M,et al. Effect of Artocarpus heterophyllus and Asteracanthus longifolia on glucose tolerance in normal human subjects and in maturity-onset diabetic patients[J]. Journal of ethnopharmacology,1991,31(3):277-282.

Separation,purificationandstructuralanalysisofactivecompoundfromjackfruitpeel

PENGShao-dan,LIJi-hua,HUANGXiao-bing,LINLi-jing*

(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001,China)

To further explore the active ingredients of jackfruit peel,cycloartenone and cycloeucalenol were isolated from the fraction of ethyl acetate by using modern isolation techniques such as silica gel,thin-Layer chromatography and sephadex LH-20,and had been elucidated from1H-NMR and13C-NMR spectral data. This research will be useful for the further study of effective material basic of jackfruit,especially the characteristic composition of terpenoids.

jackfruit peel;active ingredients;monomer;structural identification

2017-02-20

彭芍丹(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：282387502@qq.com。

*通訊作者:林麗靜(1978-)，男，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail:49031788@qq.com。

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303077-4)；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(1630122017T21)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)17-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.002