姜姣姣，閆慧嬌，文蕾，鄭秀花，王曉*，陳燕平

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014;3.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

·基礎(chǔ)研究·

高速逆流色譜技術(shù)分離純化藜蘆中甾體類生物堿

姜姣姣1，2，閆慧嬌2，文蕾1，2，鄭秀花1，2，王曉2*，陳燕平3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014;3.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

目的：采用高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)對(duì)藜蘆中的甾體類生物堿進(jìn)行分離鑒定。方法：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)為溶劑系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)速為850 r·min-1、流速為2.0 mL·min-1、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分離。結(jié)果：從300 mg粗提物中分離得到2.1 mg的藜蘆酰棋盤花胺(veratroylzygadenine)和9.3 mg的介芬胺(Jervine)，經(jīng)HPLC分析，其純度分別為91.34%、98.10%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、分離量大，適合于甾體類生物堿的分離純化。

高速逆流色譜；藜蘆；甾體類生物堿

藜蘆VeratrumnigrumL.為百合科藜蘆屬植物[1]，多年生草本，主要生長(zhǎng)在海拔較高的山坡林下或草叢中，主產(chǎn)于中國(guó)的東北、華北、貴州、陜西等地區(qū)[2]。藜蘆又名黑藜蘆、山蔥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《別錄》和《本草綱目》中均有記載，其味辛、苦，性寒，具有祛痰、催吐、殺蟲等作用[3]，通常用于治療中風(fēng)、癲癇、虐疾、跌打損傷、頭癬等疾病，此外還可滅蛆、蠅[4]，其主要藥效成分有藜蘆生物堿、茋類、二肽類、黃酮類及其他化合物[5]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)藜蘆中有效成分藜蘆生物堿還具有強(qiáng)心降壓、改善腦循環(huán)、抗癌等生理活性[6-7]，但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)藜蘆生物堿的研究還比較少。藜蘆生物堿主要為甾體類生物堿，其基本母核為膽甾烷類化合物，特點(diǎn)是沒有紫外吸收，且含量較低，為藜蘆生物堿的分離純化增加了很大的難度。傳統(tǒng)的分離方法主要包括柱色譜法[8]、薄層色譜法[9]、高效液相色譜法[10]等。這些方法不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、效率低，還容易對(duì)被分離成分產(chǎn)生死吸附、變性等影響。為了進(jìn)一步研究藜蘆生物堿的生理活性，更好地開發(fā)利用藜蘆生物堿，本文研究建立一種高效的分離制備藜蘆生物堿的方法，制備了純度較高的藜蘆酰棋盤花胺和介芬胺兩個(gè)單體化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)。

圖1 藜蘆酰棋盤花胺和介芬胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)，該系統(tǒng)由TBP5002泵、多層聚四氟乙烯螺旋管、8823-B紫外檢測(cè)器(上海勝斯貿(mào)易有限公司)、3057-11記錄儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)組成；Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)[配有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，美國(guó)Agilent 公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海況勝科技有限公司)。

樣品前處理以及高速逆流色譜中所用到的石油醚、乙酸乙酯、甲醇均為分析純(鄒平魯岳化工有限公司)，水為過濾蒸餾水；高效液相色譜所用乙腈為色譜純(美國(guó)天地公司)，實(shí)驗(yàn)用水為過濾蒸餾水及娃哈哈純凈水。

藜蘆藥材購(gòu)于哈爾濱三棵樹藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)山東中藥醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為百合科植物藜蘆VeratrumnigrumL.的干燥根莖。

2 方法

2.1藜蘆生物堿粗提物的制備

將藜蘆藥材5kg粉碎，過40目篩，將其平均置于3個(gè)10L的圓底燒瓶中，分別加入95%的乙醇6L回流提取3次(提取時(shí)間分別為3、2、2h)，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味道，得濃縮液1200mL。在濃縮液中慢慢加入10%HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值達(dá)到3，然后加入等體積的石油醚萃取3次，將石油醚萃取后的水相加入氨水調(diào)節(jié)溶液至pH值達(dá)到10，得沉淀105g。將105g沉淀溶于pH值為10的堿水溶液中，超聲振蕩后用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得乙酸乙酯萃取物，將其用酸水溶解后，再加入氨水調(diào)節(jié)pH值為10，過濾得較純樣品30g，用于進(jìn)一步分離。

2.2兩相溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)所采用的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)，將上述溶劑按比例置于2000mL的分液漏斗中，充分振蕩，靜置，使其分層。使用前分出上下相，將上層溶液作為固定相，下層作為流動(dòng)相，放于不同容器中，然后超聲脫氣5min，待用。

取400mg純化后的樣品，因其溶解性差，在上相中稍好，故取上述溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，作為樣品溶液。

2.3分離和鑒定

2.3.1HSCCC的分離制備過程 將預(yù)先準(zhǔn)備好的上相，以20mL·min-1的流速泵入HSCCC的螺旋管中，待上相充滿HSCCC的螺旋管時(shí)，啟動(dòng)儀器，順時(shí)針緩慢調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至850r·min-1，轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2mL·min-1的流速泵入下相，當(dāng)在出口觀察到有下相流出時(shí)，說明上下相已經(jīng)建立了動(dòng)態(tài)平衡。將樣品溶液通過進(jìn)樣閥注入分離柱中，然后開啟紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)和記錄儀，根據(jù)HSCCC圖譜手動(dòng)收集餾分。

2.3.2HPLC分析 根據(jù)HSCCC圖譜將分離得到的餾分及吹出液用HPLC進(jìn)行分析。色譜柱為InertsilODS-SP(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm；流動(dòng)相為乙腈(A相)、0.1%三氟乙酸水溶液(B相)，梯度洗脫(0～5min，20%A；5～30min，20%A～40%A；30～40min，40%～100%A；40～45min，100%A)；流速為1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：20μL。

3 結(jié)果與討論

3.1HPLC條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液、甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液等作為流動(dòng)相時(shí)樣品中各組分的分離效果，也考察了等度洗脫和梯度洗脫的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈-0.1%三氟乙酸的水溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，樣品中的各組分具有較好的分離效果，如圖3所示。

3.2HSCCC分離條件的優(yōu)化

HSCCC分離效果的好壞關(guān)鍵在于所選擇的溶劑系統(tǒng)是否合適，而溶劑系統(tǒng)是根據(jù)兩相溶劑中的分配系數(shù)(KD)為指標(biāo)來決定的。通常，KD值范圍是0.5～2.0時(shí)說明此溶劑系統(tǒng)較好[11]。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC測(cè)定了在不同比例的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水中目標(biāo)化合物的KD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的比例為5∶5∶3∶7時(shí)，樣品中的兩個(gè)生物堿具有合適的KD值，見表1。

表1 樣品中的2個(gè)生物堿在不同溶劑系統(tǒng)中的KD值

從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，樣品中的2個(gè)生物堿在石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶4∶6∶4，V/V)的溶劑系統(tǒng)中KD值較小，使用這個(gè)溶劑系統(tǒng)能夠很快洗脫樣品中的2個(gè)生物堿，因此兩組分將得不到較好的分離。當(dāng)溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6，V/V)時(shí)，化合物1、2的KD值分別為1.12和2.34，可以看出此時(shí)的KD偏大，需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能使兩個(gè)組分洗脫出來。而溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水5∶5∶4∶6和5∶5∶3∶7時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)化合物的KD值基本符合要求。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體積比為5∶5∶3∶7更為合適，兩組分的分離效果更好，且分離時(shí)間較短。

3.3HSCCC分離純化

利用上述優(yōu)化的溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)進(jìn)行化合物的分離。一次進(jìn)樣300mg藜蘆生物堿粗提物，在5.5h內(nèi)完成一次分離，根據(jù)圖2進(jìn)行餾分的手動(dòng)收集，最終得到藜蘆酰棋盤花胺(峰1)2.1mg和介芬胺(峰2)9.3mg，分離制備的化合物經(jīng)HPLC進(jìn)行分析，其純度分別為91.34%和98.10%(見圖3)。

注：1.藜蘆酰棋盤花胺峰；2.介芬胺峰。圖2 藜蘆中甾體生物堿的的HSCCC圖譜

注：A.藜蘆粗提物；B.藜蘆酰棋盤花胺；C.介芬胺；1.藜蘆酰棋盤花胺峰；2.介芬胺峰。圖3 藜蘆粗提物及得甾體生物堿的HPLC圖

3.4化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針狀結(jié)晶，碘化鉍鉀試劑顯黃色，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ：1.06 (3H，s，H-19)，1.08 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，1.25 (3H，s，H-21)，3.29 (1H，s，OH-20)，3.81 (3H，s，OMe-4′)，3.84 (3H，s，OMe-5′)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6) δ：32.64 (C1)，26.76 (C2)，75.47 (C3)，104.15 (C4)，46.64 (C5)，19.17 (C6)，17.02 (C7)，43.92 (C8)，95.41 (C9)，43.92 (C10)，95.41 (C11)，46.92 (C12)，32.85 (C13)，80.52 (C14)，69.58 (C15)，70.30 (C16)，45.56 (C17)，63.52 (C18)，19.51 (C19)，72.06 (C20)，19.71 (C21)，70.75 (C22)，17.59 (C23)，30.93 (C24)，26.76 (C25)，62.52 (C26)，17.42 (C27)，165.30 (C1′)，122.70 (C2′)，111.57 (C3′)，148.91 (C4′)，153.48 (C5′)，112.22 (C6′)，123.63 (C7′)，56.14 (COMe-4′)，55.95 (COMe-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)比[12-13]，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為藜蘆酰棋盤花堿(veratroylzygadenine) 。

化合物2：無色針狀結(jié)晶，碘化鉍鉀試劑顯黃色，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ：0.93(3H，d，J=6.4Hz，H-27)，1.12(3H，d，J=7.1Hz，H-21)，1.09(3H，s，H-19)，2.06(3H，s，H-18)，2.50(1H，m，H-8)，2.52(1H，m，H-14)，3.05(1H，m，H-22)，3.28(1H，m，H-23)，3.52 (1H，m，H-3)，5.33(1H，m，H-6)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)，δ：36.95 (C1)，31.26 (C2)，70.48 (C3)，41.82 (C4)，142.75 (C5)，120.79 (C6)，30.42 (C7)，38.37 (C8)，62.09 (C9)，38.17 (C10)，206.88 (C11)，137.05 (C12)，145.75 (C13)，44.09 (C14)，24.51 (C15)，30.61 (C16)，85.1 (C17)，12.08 (C18)，18.51 (C19)，41.23 (C20)，11.13 (C21)，66.39 (C22)，75.58 (C23)，38.94 (C24)，32.07 (C25)，54.06 (C26)，19.08 (C27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)比[14-15]，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為介芬胺(jervine)。

4 結(jié)論

藜蘆具有廣泛的藥用價(jià)值，為了進(jìn)一步篩選出具有藥理活性的化學(xué)成分，需要高純度的單體化合物，因此高效快速地分離純化技術(shù)顯得尤為重要。本研究采用酸溶堿沉的方法對(duì)藜蘆中生物堿進(jìn)行提取，然后將粗提物作為樣品，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)為溶劑系統(tǒng)，經(jīng)一次高速逆流色譜分離，在5 h內(nèi)從300 mg藜蘆粗提物中得到藜蘆酰棋盤花胺(2.1 mg)和介芬胺(9.3 mg)，純度分別為91.34%和98.10%。該方法簡(jiǎn)便易操作，且所得單體純度高，為甾體類生物堿制備及分離提供了一種新思路。

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SeparationandPurificationofSteroidalAlkaloidsfromVeratrumnigrumbyHigh-speedCounter-currentChromatography

JIANG Jiaojiao1，2，YAN Huijiao2，WEN Lei1，2，ZHENG Xiuhua1，2，WANG Xiao2*，CHEN Yanping3

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.YantaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yantai264000,China)

Objective：To separate and purify steroidal alkaloids from the crude extract ofVeratrumnigrumL.by HSCCC.Methods：Petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶3∶7，V/V) was used as the solvent system.Separation was performed at a rotating speed of 800 r·min-1.The flow rate was 2.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 280 nm.Results：2.1 mg veratroylzygadenine and 9.3 mg jervine were purified from 300 mg of the crude extract with the purity of 91.34% and 98.10% determined by HPLC，respectively.Conclusion：The method is simple，good reproducible and efficient which is suitable for the separation of steroidal alkaloids.

High-speed counter-current chromatography；VeratrumnigrumL.；steroidal alkaloids

國(guó)家自然基金(ZR2016YL006)；山東省科技進(jìn)步計(jì)劃(2014GZX219003)

] 王曉，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)；Tel：(0531)82605319，E-mail：wangx@sdas.org

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.011

2016-07-20)

*[