曹美嬌，張婷婷，許枬，陳俏，陶鑫，曹佳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

·基礎(chǔ)研究·

NMR法分析鑒定神曲的發(fā)酵產(chǎn)物△

曹美嬌，張婷婷，許枬*，陳俏，陶鑫，曹佳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的：鑒定神曲中的主要化學(xué)成分，分析產(chǎn)地、工藝和原料對(duì)神曲主要成分的影響。方法：采用HMBC、1H-1H COSY、TOCOSY等多種核磁共振技術(shù)(NMR)鑒定神曲中主要成分，利用多元統(tǒng)計(jì)分析36批神曲的主要成分差異。結(jié)果：從神曲中鑒定出琥珀酸(1)、乳酸(2)、甘油酸(3)、甲氧基乙酸(4)、甲氧基乙酸銨(5)、脂肪酸(6)、甘油(7)、長(zhǎng)鏈烯烴(8)、α-D-果糖(9)、α-D-葡萄糖(10)和β-D-葡萄糖(11)等成分，其中化合物1～9為從神曲中首次鑒定的成分。本研究還發(fā)現(xiàn)原料的成分幾乎不以原形進(jìn)入成品，而可能作為底物或調(diào)解微生物發(fā)酵環(huán)境的附加因子參與形成成品的成分，不同產(chǎn)地神曲的化學(xué)成分無(wú)顯著區(qū)別。結(jié)論：神曲的化學(xué)成分主要由發(fā)酵過(guò)程形成的，產(chǎn)地、工藝和原料對(duì)其終產(chǎn)物成分種類影響較小，發(fā)酵過(guò)程是其主要影響因素。

神曲；化學(xué)成分；核磁共振技術(shù)；多元分析；發(fā)酵

神曲臨床應(yīng)用廣泛，但主要成分不清楚，無(wú)法指導(dǎo)活性物質(zhì)篩選，致使其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)與工藝規(guī)范化研究一直是重要難題，中華人民共和國(guó)藥典也因此至今未收載該品[1-2]。神曲是由面粉等六種原料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵工藝制成的[3]。在復(fù)雜原料的基礎(chǔ)上引入微生物的作用是其化學(xué)成分研究困難的主要原因[4-7]。固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生著有序的動(dòng)態(tài)變化，化學(xué)成分隨之發(fā)生著復(fù)雜的變化。固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)物研究需要以明確優(yōu)勢(shì)微生物或已知優(yōu)勢(shì)微生物的發(fā)酵特征為前提[9]。但到目前為止，神曲在這兩個(gè)方面都不明確[8]。因此神曲主要成分研究需要特殊的手段。核磁共振技術(shù)(NMR)具有成分無(wú)歧視性、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，不僅可以識(shí)別復(fù)雜體系的化學(xué)成分類型，而且可以通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)照來(lái)鑒定具有特征信號(hào)的成分，常用于復(fù)雜體系的成分分析與鑒定[10-11]。本文首次采用NMR技術(shù)鑒定出神曲的11種成分，并通過(guò)對(duì)比分析不同產(chǎn)地的36批神曲，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)工藝、產(chǎn)地對(duì)其主要成分種類影響不大，發(fā)酵過(guò)程可能是主要影響因素。

1 儀器與材料

BRUKER Avance 600型核磁共振譜儀(德國(guó)布魯克公司)；超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司，250 Hz)；Satorius電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

氘代甲醇(國(guó)貿(mào)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；自制神曲(照部頒標(biāo)準(zhǔn)由本實(shí)驗(yàn)室自行制備)；不同地區(qū)神曲(收集于四川、陜西、廣西等地，不同地區(qū)收集樣品7批)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

取赤小豆0.7 g、苦杏仁0.7 g、面粉10 g、辣蓼、青蒿和蒼耳草各0.4 g，精密稱定，分別加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)与状?.5 mL使溶解，作為神曲各原料成分分析的供試品I-1～I(xiàn)-6。

取神曲樣品各10 g，精密稱定，分別加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)与状?.5 mL使溶解，作為神曲成品成分分析的供試品I-7。

取神曲樣品各10 g，精密稱定，分別加入三氯甲烷25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)与燃淄?.5 mL使溶解，作為神曲成分分析的供試品II-1～I(xiàn)I-7。

2.2 測(cè)試條件

供試品在配置BBO探頭的Bruker AV 600 MHz型超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振波譜儀上進(jìn)行分析，在298.2 K的溫度下，采用30度單脈沖程序zg30(Avance version：07/04/03)采集圖譜。采樣時(shí)間：5.453 s；譜寬：6 009.6 Hz；時(shí)域數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)：64 K；累加次數(shù)：128次；弛豫時(shí)間：1 s。自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過(guò)傅立葉變換得到一維NMR圖譜；內(nèi)標(biāo)物四甲基硅烷(TMS)的化學(xué)位移規(guī)定為δ。手動(dòng)進(jìn)行基線校正和相位校正。

2.3 譜圖處理和數(shù)據(jù)分析

采用TOPSPIN 2.1采集原始圖譜，經(jīng)分段積分，去除溶劑氘代甲醇及水產(chǎn)生的共振信號(hào)區(qū)域δ3.30～3.30 及δ4.78～5.04的數(shù)值，并將所有數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為相對(duì)于總峰面積的積分值，保存為數(shù)據(jù)文件。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-p 11.5(Umetrics，Sweden)進(jìn)行偏最小二乘法判別(PLS-DA)分析。

2.4 神曲主要成分鑒定

由神曲甲醇提取物的HSQC(見(jiàn)圖1、3)中觀察到δ5.17(d，J=3.7 Hz)質(zhì)子，其碳信號(hào)為δ92.5。結(jié)合HMBC譜與TOCSY譜確認(rèn)其與δ73.4、72.5、72.4、70.3、61.3等碳信號(hào)為同一化合物的信號(hào)(見(jiàn)圖3)，該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中α-D-葡萄糖基本一致[12]，故鑒定神曲中含有α-D-葡萄糖；另有δ4.54(d，J=7.8 Hz)的質(zhì)子，其在TOCOSY譜中與δ96.8、76.7、76.6、74.9、70.4、61.4的碳信號(hào)的質(zhì)子在同一個(gè)偶合系統(tǒng)，該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中β-D-葡萄糖基本一致[12]，故鑒定神曲中含有β-D-葡萄糖。由δ98.1、70.1、69.8、68.1、64.4、62.9的碳信號(hào)在HSQC-TOCOSY譜中為同一個(gè)化合物的信號(hào)，且δ98.1的碳信號(hào)為季碳，其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中α-D-果糖基本一致[12]，故確定神曲中含有α-D-果糖。在1H-1H COSY譜觀察δ4.21(q，J=6.8 Hz)，1.41(d，J=6.8 Hz)質(zhì)子相互偶合，在HSQC譜中分別與δ67.1、19.6的碳信號(hào)相關(guān)，二者在HMBC譜中同與δ178.6的碳信號(hào)相關(guān)，確定提取物中含有乳酸，TOCSY譜證實(shí)上述推測(cè)[13]。另由HQSC譜確定δ3.33(s)及δ3.91(s)質(zhì)子的碳信號(hào)分別為δ52.6和δ53.8，結(jié)合在HMBC譜中δ3.91(s)質(zhì)子分別與δ52.6，65.9和167.6相關(guān)，δ3.33(s)分別與δ53.8，68.0，167.0相關(guān)，提示神曲中含有甲氧基乙酸和甲氧基乙酸銨[14]。由HSQC譜確定δ3.56(dd，J=6.1，11.3 Hz)，δ3.64(dd，J=4.9，11.3 Hz)質(zhì)子的碳信號(hào)為δ63.0，δ3.72(m)質(zhì)子的碳信為δ72.5，在1H-1H COSY譜中觀察到兩組質(zhì)子相關(guān)，在HMBC譜中觀察到δ3.56(dd，J=6.1，11.3 Hz)，δ3.64(dd，J=4.9，11.3 Hz)質(zhì)子與δ72.5的碳信號(hào)相關(guān)，δ3.72(m)質(zhì)子與δ63.0的碳信號(hào)相關(guān)，確定神曲中含有甘油[15]。HSQC-TOCSY譜證實(shí)上述推測(cè)。

由神曲三氯甲烷提取物的氫譜中δ2.30(m)的質(zhì)子信號(hào)(見(jiàn)圖3)在HMBC譜中與δ173.3的碳信號(hào)相關(guān)，提示神曲中含有丁二酸[16]。由氫譜(見(jiàn)圖2)中觀察到δ4.27(dd，J=11.9，4.3 Hz)，4.12(dd，J=11.9，6.0 Hz)與δ5.24(m)兩組質(zhì)子，質(zhì)子數(shù)比為2∶1。由HSQC譜可知，二者的碳信號(hào)分別為δ62.2、69.2；在HMBC譜中觀察到兩組質(zhì)子均與δ172.8的碳信號(hào)相關(guān)，其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中甘油酸基本一致，故鑒定該成分為甘油酸[17]。綜合多種譜圖推測(cè)，神曲中還含有具有HCOO-(CH2)n-CH3結(jié)構(gòu)的脂肪酸及具有CH3-(CH2)n-CH2-CH=CH-CH2-(CH2)m-CH3結(jié)構(gòu)的烯烴，從積分比例可知脂肪酸含量較高，長(zhǎng)鏈烯含量略低。此外，由神曲甲醇提取物的氫譜中糖區(qū)(δ3.00～4.30)信號(hào)裂分復(fù)雜，對(duì)應(yīng)的碳信號(hào)為碳譜中的sp3雜化連氧碳信號(hào)，提示神曲成分體系中可能還存在其他含量較大的多元醇類成分。綜上結(jié)果，說(shuō)明神曲主要成分為糖類、有機(jī)酸、脂肪酸和長(zhǎng)鏈烯烴類成分。

表1 神曲中鑒定的化合物NMR數(shù)據(jù)

注：a.神曲氫譜；b.神曲碳譜。圖1 神曲甲醇提取物的碳譜與氫譜

注：a.神曲氫譜；b.神曲碳譜。圖2 神曲三氯甲烷提取物的氫譜和碳譜

經(jīng)神曲的原料與成品中各成分信號(hào)的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖4)，α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、甘油酸、甘油、乳酸在原料中未檢出，而在成品中信號(hào)明顯檢出，由此確定這些成分是神曲發(fā)酵后產(chǎn)物，而甲氧基醋酸及甲氧基醋酸銨在青蒿、辣蓼和蒼耳草中即可觀察到，因此可知其主要來(lái)自青蒿、辣蓼等原料。

2.5 產(chǎn)地對(duì)六神曲成分的影響

從四川、遼寧、山東、北京、陜西等地區(qū)收集36批神曲，測(cè)定其1H-NMR譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。為了分析各批次間主要成分差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的復(fù)雜數(shù)據(jù)通過(guò)降維處理后再進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)所用的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是有監(jiān)督的分析方法，可以有效減少系統(tǒng)誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，外部模型驗(yàn)證法常用于模型有效性判定。由PLS-DA分析的得分矢量圖(見(jiàn)圖6)可見(jiàn)，各組樣品分布均比較分散，說(shuō)明其主要成分無(wú)顯著性差異，提示產(chǎn)地、原料比例對(duì)神曲主要成分種類影響較小。該模型的t[1]和t[2]對(duì)X變量解釋達(dá)82.5%，(R2Y)：0.924的原始變量變異Q2(cum)為0.831，表明該模型穩(wěn)定性很好。

注：a.1H-1H COSY譜；b.TOCOSY譜；c.HSQC譜；d.HMBC譜。圖3 神曲甲醇提取物的多種NMR譜

注：1.面粉；2.杏仁；3.赤小豆；4.辣蓼；5.蒼耳草；6.青蒿；7.神曲；a.α-D-葡萄糖；b.β-D-葡萄糖；c.乳酸；d.甘油酸；e.甲氧基醋酸及甲氧基醋酸銨。圖4 神曲與其原料的成分的NMR譜(放大譜)

注：1.北京；2.四川；3.廣西；4.陜西；5.遼寧；6.安徽；7.上海。圖5 不同產(chǎn)地六神曲1H-NMR譜圖

注：1.四川；2.陜西；3.北京；4.山東；5.遼寧。圖6 不同地區(qū)神曲1H-NMR譜圖的PLS-DA得分矢量圖(n=7)

3 討論

3.1 供試品溶液的制備及測(cè)試溶劑的選擇

為減少混合物NMR譜圖中各成分間的信號(hào)重疊干擾，準(zhǔn)確鑒定神曲的成分，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，本實(shí)驗(yàn)確定依次用極性差異較大的甲醇和三氯甲烷作為提取溶劑，首次鑒定出神曲中含有甘油酸、乳酸、琥珀酸、甲氧基醋酸、甲氧基醋酸銨、α-D-果糖、脂肪酸和長(zhǎng)鏈烯烴類等成分。這些成分與神曲發(fā)酵過(guò)程存在多種微生物基本吻合[4-5]。NMR分析的檢測(cè)限一般在10-6μM以上，由此提示神曲中其他未檢出的產(chǎn)物含量較低。

3.2 神曲發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生途徑分析

依據(jù)微生物代謝可知，甘油是酵母菌的代謝產(chǎn)物。在好氧條件下，酒酵母可以將葡萄糖和蔗糖發(fā)酵為甘油[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，神曲中含有較大含量的甘油，提示神曲發(fā)酵過(guò)程中涉及酵母菌。這與神曲中鑒定出多種酵母菌[7]及本次研究發(fā)現(xiàn)神曲中含有大量的葡萄糖和果糖相吻合。乳酸是乳酸菌的糖酵解途徑(EMP)或戊糖磷酸途徑(HMP)主產(chǎn)物。在EMP途徑，1 mol葡萄糖可轉(zhuǎn)化為2 mol的乳酸。但一般情況下產(chǎn)率只有80%。在HMP途徑，1 mol葡萄糖可轉(zhuǎn)化為1 mol乳酸、1 molCO2和1 mol乙醇。甘油酸是絲氨酸降解的中間產(chǎn)物，具有促進(jìn)醇類成分代謝等生物學(xué)功能。磷酸化后生成甘油酸3-磷酸，其有促進(jìn)糖酵解作用。α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、α-D-果糖是低聚糖、多糖(包括淀粉和纖維素)的基本單元。丁二酸(琥珀酸)是三羧酸循環(huán)的重要標(biāo)志物。脂肪酸和長(zhǎng)鏈烯類成分主要為微生物代謝產(chǎn)物[18]。綜上可見(jiàn)，神曲發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌種可能包括曲霉、酵母菌和乳酸菌，其主要涉及三條代謝途徑：三羧酸循環(huán)、糖酵解和微生物自身代謝。糖、脂類的水解產(chǎn)物及三羧酸循環(huán)特征物質(zhì)(琥珀酸)是神曲的主要成分，因此，糖的水解程度和琥珀酸含量變化可作為神曲發(fā)酵程度的考察指標(biāo)。

3.3 產(chǎn)地對(duì)神曲成分種類的影響

不同地區(qū)神曲生產(chǎn)工藝不同，其組方也有一定差異。北方地區(qū)生產(chǎn)神曲時(shí)往往不加麥麩，而南方地區(qū)神曲的麥麩用量較大，原料比例也不同。為深入揭示不同產(chǎn)地神曲成分的差異性，本文采用無(wú)監(jiān)督的PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)法，對(duì)從國(guó)內(nèi)六個(gè)省市收集36個(gè)樣品進(jìn)行分析。從結(jié)果看，產(chǎn)地、工藝、處方組成對(duì)神曲成分影響均很小，發(fā)酵過(guò)程是影響神曲成分種類的主要因素。由此提示，不同地區(qū)神曲可以采用統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。由于同一產(chǎn)地神曲的核磁共振氫譜相似度很高，無(wú)明顯差別，故比較不同產(chǎn)地神曲時(shí)只選擇代表性樣品。

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IdentificationofChemicalComponentinSHENQUBasedonNMRAnalysis

CAOMeijiao，ZHANGTingting，XUNan*，CHENQiao1，TAOXin，CAOJia

(SchoolofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian，116600,China)

Objective：To identify compounds and analyze the effect of producing area，procedure and ingredient on the components of SHEN QU.Method：1H-NMR，13C-NMR，HMBC，1H-1H COSY and TOCOSY were employed to identify the compounds from SHEN QU，multivariate analysis was applied to find the difference among 36 batch SHEN QU got from different county.Result：In this study，succinic acid(1)，lactic acid(2)，glyceric acid(3)，methoxyacetic acid(4)，methoxy acetic acid ammonium(5)，fatty acid(6)，glycerin(7)，long chain olefins(8)，α-D-fructose(9)，α-D-glucose(10)andβ-D-glucose(11)were elucidated in SHEN QU on the basis of NMR technology，compounds 1-9 were identified for the first time in it.1H-NMR analysis showed that the chemical component in stock material almost not be detected in end product of SHEN QU，while many new signals of saccharides，fatty acids and long chain alkenes were detected.The result of PLS-DA analysis of 36 batch sample indicated that chemical components of SHEN QU from different region are similar.Conclusion：The fermentation process of SHEN QU is more important factor affecting the chemical components than procedure，producing region and ingredients.

SHEN QU；chemical component；NMR；multivariate analysis；fermentation

國(guó)家公益性行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目(201507004-03)

] 許枬，教授，藥學(xué)博士，研究方向：中藥有效成分及其質(zhì)量研究；Tel：(0411)85890191；E-mail：xudanbs@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.004

2016-06-23)

*[