呂菲菲，孫佩文，劉培衛(wèi)，李俊，徐艷紅*，魏建和，*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 海口 570311；3.海南省食品藥品檢驗(yàn)所五指山分所，海南 五指山 572200)

·專題·

22個(gè)白木香倍半萜合酶(AsTPS)基因的健康與傷害誘導(dǎo)表達(dá)特性研究△

呂菲菲2，孫佩文1，劉培衛(wèi)2，李俊3，徐艷紅1*，魏建和1，2*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 海口570311；3.海南省食品藥品檢驗(yàn)所五指山分所，海南 五指山572200)

目的：明確22個(gè)AsTPS基因在健康和傷害白木香中的表達(dá)情況，篩選出催化沉香倍半萜合成的關(guān)鍵酶基因。方法：全斷法傷害處理白木香，常規(guī)PCR和熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)基因表達(dá)情況。結(jié)果：22個(gè)As-TPS基因中，1個(gè)基因在健康和傷害白木香中均不表達(dá)；3個(gè)基因在健康白木香中不表達(dá)，但明顯響應(yīng)于外界傷害；18個(gè)基因在健康白木香中均有一定量表達(dá)，而傷害處理后，其中7個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)數(shù)千倍，11個(gè)基因雖也被誘導(dǎo)表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量僅達(dá)幾十倍至幾百倍。結(jié)論：21個(gè)As-TPS基因?yàn)閭φT導(dǎo)型基因，其中3個(gè)是沉香倍半萜合成的關(guān)鍵催化酶基因；在傷害誘導(dǎo)后含量急劇表達(dá)上升的7個(gè)As-TPS是白木香傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期倍半萜合成的重要催化酶。

沉香，白木香，倍半萜合酶，傷害誘導(dǎo)，基因表達(dá)

沉香(LignumAquilarizeResindum)為瑞香科沉香屬或擬沉香屬植物含樹脂的木材，是樹體受傷后分泌出來的油脂成分和木質(zhì)成分的固態(tài)凝聚物[1]。經(jīng)研究證實(shí)沉香的主要藥用成分為倍半萜類和色酮類化合物，且健康的白木香中不能形成這些物質(zhì)，樹體只有受到各種外界刺激(物理、化學(xué)傷害或真菌侵染)后才能產(chǎn)生[2，3]。倍半萜合酶是倍半萜類化合物合成的關(guān)鍵催化酶，在其生化合成的最后催化階段發(fā)揮著舉足輕重的作用[4]。

倍半萜合酶的含量和活性是催化倍半萜類物質(zhì)產(chǎn)生的前提，主要受基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[5-6]。外界生物與非生物因素脅迫誘導(dǎo)，可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子響應(yīng)，傳遞信號(hào)給轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，增強(qiáng)或減弱倍半萜合酶基因表達(dá)，其具有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)特性[5]。研究已證實(shí)，AsTPS中AsASS1，AsASS2基因在健康白木香中表達(dá)水平極低，幾乎不表達(dá)，但傷害或MeJA處理后明顯被誘導(dǎo)表達(dá)[7]?；虮磉_(dá)特性研究發(fā)現(xiàn)，AsASS1，AsASS2表達(dá)積累與沉香倍半萜誘導(dǎo)合成具有一致性，同時(shí)AsASS1體外催化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其催化產(chǎn)物為沉香倍半萜主要成分[8-9]，可見，AsTPS是沉香倍半萜合成的關(guān)鍵催化酶。但往往因?yàn)槿觽?huì)造成一定的實(shí)驗(yàn)誤差，不能確定AsTPS基因在健康白木香中的表達(dá)情況，此外，AsTPS種類較多，催化合成的倍半萜成分多樣，很難確定發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。因此本研究在縮短取樣時(shí)間的基礎(chǔ)上，對(duì)包括AsASS1在內(nèi)的22個(gè)AsTPS在健康和傷害白木香中進(jìn)行基因表達(dá)分析，明確AsTPS基因在健康白木香中的表達(dá)情況，同時(shí)傷害響應(yīng)表達(dá)檢測(cè)篩選出關(guān)鍵催化酶基因。本研究有助于解釋在健康白木香中不合成沉香倍半萜而傷害脅迫后沉香倍半萜大量合成的生理調(diào)控機(jī)制，對(duì)沉香形成分子機(jī)制研究具有重大的推動(dòng)意義。

1 材料與方法

1.1材料

栽培三年生的白木香(Aquilariasinensis)取自海南省海口市美蘭區(qū)演豐沉香基地，經(jīng)魏建和研究員鑒定為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)白木香(A.sinensis)，樹高1m，樹干直徑1.0cm，生長健壯，對(duì)其莖干進(jìn)行全斷干法物理傷害處理，并在0h和2h后取樣(時(shí)間控制在2～3s內(nèi))，立即投入液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

22個(gè)倍半萜合酶基因序列均由白木香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比對(duì)和注釋獲得。

1.2白木香莖干總RNA提取和cDNA合成

三年生白木香莖干經(jīng)物理傷害處理與健康材料用液氮冷凍研磨成粉，依據(jù)植物 RNA 提取純化試劑盒 EASY-spin plus RN38(Aidlab，China)說明書提取總RNA；利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA完整性，分光光度計(jì)Nano Drop2000C (Thermo Scientific，USA) 測(cè)定所提取RNA濃度。

取約500ng 所提取的RNA，以MMLV (TaKaRa)為逆轉(zhuǎn)錄酶，以O(shè)ligod(T)18(TaKaRa)為引物，d NTP Mix (TaKaRa)為原料，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，作為qRT-PCR的模版。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA的合成完整性，分光光度計(jì)Nano Drop2000C (Thermo Scientific，USA) 測(cè)定cDNA濃度。

1.3PCR檢測(cè)基因表達(dá)

根據(jù)白木香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比對(duì)和注釋的22個(gè)AsTPS基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，由上海生工合成；

常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板cDNA1ug，正反向引物均為1ul，2*Taq mix酶(TaKaRa)1ul，加水補(bǔ)至10ul反應(yīng)體系；運(yùn)用Bio-Rad T100梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序：95℃5min；95℃15s，根據(jù)不同基因引物退火溫度設(shè)定(表1)30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因擴(kuò)增結(jié)果。

熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量：儀器采用Bio-Rad的 iQTM5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)，擴(kuò)增體系為2×SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa)10μL； 正反向引物濃度均為1μL；c DNA 模板1μL；加超純水補(bǔ)足至20μL。實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增程序如下：95℃10min；95℃10s；退火根據(jù)不同基因引物退火溫度設(shè)定(表1)15s，延伸72℃20s，40個(gè)循環(huán)。所有PCR反應(yīng)均以三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH) 為內(nèi)參[10]，將Real-time PCR所得的樣品Ct 值，利用2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量值。

表1 As-TPS基因PCR擴(kuò)增所使用的特異性引物(primer 5.0 軟件設(shè)計(jì))

檢測(cè)結(jié)果使用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單樣本t-test顯著性檢測(cè)分析，每個(gè)反應(yīng)體系單獨(dú)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2結(jié)果與分析

通過常規(guī)PCR擴(kuò)增和qRT-PCR檢測(cè)22個(gè)AsTPS基因在健康和傷害白木香中的表達(dá)情況(表2)，根據(jù)健康白木香中表達(dá)情況大致可歸為兩類：(1)健康白木香中不表達(dá)的基因；(2)健康白木香中有一定量表達(dá)的基因。

表2 22個(gè)AsTPS基因在健康白木香樹中的本底與傷害誘導(dǎo)表達(dá)情況

2.1健康白木香中不表達(dá)的基因

健康白木香中AsTPS-10，AsTPS-16，AsTPS-19(AsASS1)基因經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增條帶；但傷害處理2h后出現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的基因擴(kuò)增條帶，其表達(dá)量明顯上升(見圖1)。說明這三個(gè)基因在健康白木香中不表達(dá)，但傷害誘導(dǎo)后會(huì)被激活，此結(jié)果與沉香倍半萜在健康白木香中不產(chǎn)生，而受傷害誘導(dǎo)合成的合成方式一致，所以這三個(gè)AsTPS是沉香倍半萜傷害誘導(dǎo)合成的關(guān)鍵催化酶。此外，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AsTPS-9在健康和傷害白木香中均無表達(dá)，說明此基因在健康白木香中沉默，同時(shí)也不響應(yīng)于植物的傷害誘導(dǎo)，其對(duì)白木香傷害誘導(dǎo)結(jié)香沒有催化作用。

注：H：healthy；W：wound圖1 健康白木香中沉默基因表達(dá)情況

2.2健康白木香中有所表達(dá)的基因

常規(guī)PCR和qRT-PCR共同檢測(cè)18個(gè)AsTPS基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)基因(AsTPS-6，AsTPS-11，AsTPS-12，AsTPS-13，AsTPS-14，AsTPS-17，AsTPS-18)在健康白木香中都有微弱表達(dá)，傷害后其表達(dá)量會(huì)急劇增加，短短2h內(nèi)高達(dá)數(shù)千倍(見圖2)，這些基因明顯受到傷害誘導(dǎo)，且對(duì)傷害刺激響應(yīng)較為強(qiáng)烈，活性明顯增強(qiáng)，可能是結(jié)香早期倍半萜合成的主要催化酶。

其他11個(gè)AsTPS基因經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，健康白木香中也都有微弱表達(dá)，同時(shí)傷害誘導(dǎo)后其表達(dá)量也會(huì)上升，但是相對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)較前7個(gè)基因(相對(duì)誘導(dǎo)數(shù)千倍表達(dá))弱一些，只達(dá)到十幾到幾百倍(見圖3)，它們可能對(duì)傷害誘導(dǎo)早期沉香倍半萜的合成具有一定的響應(yīng)和催化作用，但不發(fā)揮主導(dǎo)作用。

綜上，從白木香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比對(duì)到的22個(gè)AsTPS基因，除AsTPS-9外，均屬于誘導(dǎo)型基因，且都響應(yīng)于外界傷害刺激，對(duì)傷害誘導(dǎo)倍半萜合成都具有一定的催化作用，但每個(gè)AsTPS基因在健康白木香中的本底表達(dá)和傷害情況下的誘導(dǎo)響應(yīng)特點(diǎn)各不相同，需要進(jìn)一步的具體探索，尤其應(yīng)針對(duì)響應(yīng)傷害誘導(dǎo)劇烈的關(guān)鍵酶基因展開研究；并且從檢測(cè)到的AsTPS表達(dá)模式也可以說明：倍半萜類物質(zhì)是白木香傷害誘導(dǎo)的產(chǎn)物，本研究即從AsTPS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的角度進(jìn)一步證實(shí)本課題組前期提出的白木香“防御反應(yīng)結(jié)香假說”。

注：H：healthy；W：wound 圖2 對(duì)傷害刺激早期響應(yīng)強(qiáng)烈的AsTPS基因表達(dá)情況

3 討論

倍半萜類物質(zhì)是沉香的主要成分之一，其在健康白木香中不存在，只有樹體受到外界傷害才會(huì)誘導(dǎo)合成[1，3]。倍半萜的合成是一種復(fù)雜的生理生化過程，需要多種酶類的催化和輔助，其中倍半萜合酶作為倍半萜類物質(zhì)骨架形成的直接催化作用酶，對(duì)倍半萜的合成具有不可替代的催化作用[11，12]。倍半萜合酶的活性主要受基因表達(dá)調(diào)控，本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白木香22個(gè)AsTPS基因在健康白木香中沉默或微弱表達(dá)，而傷害誘導(dǎo)后21個(gè)基因的表達(dá)都會(huì)有所上升，說明AsTPS的活性是受傷害誘導(dǎo)調(diào)控的，此結(jié)果與前期課題組基因克隆的AsTPS基因表達(dá)特性[8-9]一致，并更全面的檢測(cè)了其他倍半萜合酶基因，進(jìn)一步證明了AsTPS活性增強(qiáng)是外界植物傷害刺激的防御反應(yīng)結(jié)果，與沉香倍半萜傷害誘導(dǎo)合成方式一致，間接證實(shí)了白木香“防御反應(yīng)結(jié)香假說”[1]。

沉香倍半萜種類較多，而倍半萜合酶的催化特性具有專一性，即一種酶可催化合成一種或幾種倍半萜類物質(zhì)[13]，本課題對(duì)22個(gè)As-TPS基因的傷害誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在白木香中個(gè)體表達(dá)模式存在較大差異，AsTPS-10，AsTPS-16，AsTPS-19健康白木香中不表達(dá)，傷害誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯升高(見圖1)，這些基因可能對(duì)沉香倍半萜被誘導(dǎo)合成的關(guān)鍵催化作用，由于其在健康白木香中不表達(dá)，所以健康白木香中相應(yīng)的檢測(cè)不到倍半萜含量，該類酶的深入研究可很好地闡述沉香形成機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)植物倍半萜合成具有一定的時(shí)序性，即植物會(huì)在不同生長期或不同響應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)期合成不同的倍半萜成分，且受不同倍半萜合酶的催化[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，有18個(gè)AsTPS基因在健康白木香中微弱表達(dá)，含量極低不足以催化倍半萜合成，其中AsTPS-6，AsTPS-11，AsTPS-12，AsTPS-13，AsTPS-14，AsTPS-17，AsTPS-18傷害誘導(dǎo)后表達(dá)量會(huì)急劇上升，短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)上千倍，含量變化較大(見圖2)，說明它們響應(yīng)于早期的傷害誘導(dǎo)，對(duì)沉香倍半萜早期合成起催化作用。故在白木香中此類AsTPS的研究可以很好地分析傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期倍半萜成分的變化，對(duì)研究白木香防御反應(yīng)啟動(dòng)和沉香形成具有關(guān)鍵指導(dǎo)意義；其他11個(gè)AsTPS基因也響應(yīng)于白木香的傷害誘導(dǎo)，但在短期內(nèi)其表達(dá)量上升幅度相對(duì)較弱(見圖3)，說明此類基因?qū)Τ料惚栋胼坪铣梢簿哂幸欢ǖ拇呋饔?，但?duì)早期沉香倍半萜的合成催化作用較弱，可能對(duì)中后期沉香形成起催化作用，但需要后續(xù)進(jìn)一步研究分析。

本文研究證實(shí)，AsTPS的傷害誘導(dǎo)表達(dá)是沉香倍半萜合成的關(guān)鍵機(jī)制，其對(duì)沉香倍半萜合成是不可或缺的，但其種類較多，催化合成的倍半萜組分也較多樣化，故還需對(duì)篩選出的關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)一步深入研究。本文將對(duì)研究沉香倍半萜多成分原因及合成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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StudyonBackgroundandWoundInducedExpressionof22SesquiterpeneSynthaseGenesofAquilariasinensis

LV Feifei2，SUN Peiwen1，LIU Peiwei2，LI Jun3，XU Yanhong1，*，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China2.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China3.Wuzhishan branch of Food and Drug inspection of Hainan，Wuzhishan，572200，China)

Objective：TO confirm the expression mode of 22 sesquiterpene synthase in healthy and woundAquilariasinensis，and selected the key enzymes for catalyzing agarwood sesquiterpene synthesis.Methods：The branch ofA.sinensiswere treated by all broken method，the gene expression was tested by PCR and qRT-PCR.Results：1 gene expressed neither in the healthy nor wound trees.3 genes were silenced in healthey trees，but were obviously response to the external stimuli.Other 18 genes expressed in healthy samples among which 7 genes expression increased rapidly and the relative expression level was thousands of times and 11 genes also were induced to express but the relative expression level was dozens to hundreds times in short time after trees were wounded.Conclusion：21 sesquiterpene synthase genes are induced-genes and catalyze synthesis of agarwood sesquiterpenes.Among of them，3 enzymes are the pivotal enzymes for catalyzing sesquiterpene synthesis and 7 enzymes are the key enzymes for sesquiterpene synthesis in early period of agarwood formation in woundA.sinensis.

Agarwood，Aquilariasinensis，sesquiterpene synthase，wound-induce，gene expression

國家自然科學(xué)基因項(xiàng)目(NO.：81673549)，海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016004)；海南省自然科學(xué)基金(NO.20163150)

] 徐艷紅，博士，副研究員，研究方向：藥用植物次生代謝調(diào)控研究，Tel：010-57833363，E-mail：xuyanhong99@163.com；魏建和，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥用植物基因資源與分子育種及次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究，Tel：010-57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.005

2017-05-31)

*[