童芯鋅，王藝璇，陳璐，邱乙，萬德光，任艷，彭成，沈才洪，李軍德，國錦琳,*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；2.瀘州老窖博士后工作站，四川 瀘州 646000；3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·專題·

雙向電泳技術(shù)篩選鑒定冬蟲夏草中指標(biāo)性蛋白質(zhì)研究△

童芯鋅1，王藝璇1，陳璐1，邱乙1，萬德光1，任艷1，彭成1，沈才洪2，李軍德3，國錦琳1,2*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611137；2.瀘州老窖博士后工作站，四川 瀘州646000；3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京100700)

對(duì)名貴中藥材冬蟲夏草及其偽品建立穩(wěn)定可靠的雙向電泳鑒定方法。正品冬蟲夏草中共同表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為88個(gè)，偽品穩(wěn)定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為21個(gè)，提示可作為下一步冬蟲夏草鑒定的指標(biāo)性組分。進(jìn)一步質(zhì)譜分析與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)表明：6種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數(shù)據(jù)庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數(shù)據(jù)庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫和全庫，提示下一步可進(jìn)行冬蟲夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)功能研究，為冬蟲夏草有效成分研究奠定基礎(chǔ)。

冬蟲夏草；雙向電泳；指標(biāo)性蛋白質(zhì)；功能蛋白質(zhì)

冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的幼蟲尸體及子座的復(fù)合體[1]，屬國家二級(jí)保護(hù)名貴藥材。由于其野生資源分布區(qū)域狹窄，目前尚無成熟人工培植技術(shù)，藥材需求量大，市場供求嚴(yán)重失衡。加之全球變暖、雪線上移，蝙蝠蛾大量死亡，產(chǎn)量逐年減少，資源缺乏，故極為珍貴[2-3]。全世界已報(bào)道的蟲草屬真菌有400多種，我國有60多種，可寄生于9個(gè)目昆蟲的幼蟲、蛹和成蟲，但中華人民共和國藥典收載的冬蟲夏草其寄主是產(chǎn)于我國青藏高原特殊高寒生境的蝠蛾幼蟲，因而市場摻偽、摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[4-5]，嚴(yán)重影響了市場流通和臨床安全[6]。目前，鑒別冬蟲夏草及其混偽品多采用外觀、顯微、理化等方法與技術(shù)，由于冬蟲夏草品種繁多，種間相似度較高，憑借外觀或經(jīng)驗(yàn)不能很好地進(jìn)行鑒別。尤其是將其加工成粉末產(chǎn)品，常規(guī)鑒定方法基本不能有效鑒定，因此，亟需建立一種全新而可靠的冬蟲夏草鑒定方法[7-8]。

冬蟲夏草含量最高的一類化學(xué)成分即為蛋白質(zhì)，約25%～32%。作為初級(jí)代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)(肽)，在物種體內(nèi)具有穩(wěn)定的含量和物種特異性，可以作為物種鑒定的有效依據(jù)，目前在中藥材鑒定中未能受到重視[9-14]。雙向電泳技術(shù)可將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離，且重現(xiàn)性高。本研究首次應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)尋找到正品冬蟲夏草中的特異性蛋白質(zhì)(多肽)，作為冬蟲夏草的指標(biāo)性組分，開拓了新的鑒定思路，為后續(xù)動(dòng)物藥材和果實(shí)種子類藥材的鑒定進(jìn)行了有益的探索。

1 材料

1.1藥材

藥材均為實(shí)驗(yàn)室采集或收集，經(jīng)國錦琳教授鑒定后留樣成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 蟲草類藥材信息表

表1(續(xù))

1.2試劑

丙烯酰胺、N，N′-甲叉丙烯酰胺、Tris堿、甘氨酸、碘乙酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、過硫酸銨、BSA均為Sigma產(chǎn)品；IPG膠條(17cm，pH3～10)、兩性電解質(zhì)(Bio-lyte，pH3～10)、Readyprep2-Dcleanup試劑盒、礦物油購自Bio-rad公司；DTT為Merck產(chǎn)品；其余化學(xué)試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1樣品制備

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行樣品前處理。

制備樣品采用Bradford法[16]對(duì)樣品蛋白液進(jìn)行含量測定，上樣緩沖液稀釋至2μg·μL-1。

2.2雙向電泳(2-DE)

采用17 cm、pH3～10 IPG預(yù)制膠條，被動(dòng)水化上樣，上樣量為600 μg(上樣體積300 μL)[17]。

2.3染色

電泳結(jié)束后，采用BlueSilver染色法進(jìn)行凝膠染色[18]。

2.4掃描及圖像分析

染色后采用GEImageScannerIII投射掃描記錄，Imagemaster7.0雙向電泳分析軟件進(jìn)行圖譜分析。

2.5膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解

膠內(nèi)蛋白質(zhì)的脫色、烷基化、脫水消化、萃取按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

2.6質(zhì)譜分析

取10uL樣品上清液進(jìn)行質(zhì)譜儀分析。利用MASCOTServe軟件檢索數(shù)據(jù)庫鑒定信息，得質(zhì)譜結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1雙向電泳方法學(xué)研究

優(yōu)化雙向電泳方法后，取冬蟲夏草適量制樣后，在同等條件下進(jìn)行2-DE，重復(fù)3次。BlueSilver染色后，采用GEImageScannerIII掃描儀透射掃描凝膠，Imagemaster7.0軟件分析自動(dòng)點(diǎn)檢測，平均檢測蛋白點(diǎn)數(shù)為(827±34)個(gè)。見圖1。以其中一塊膠為參比膠進(jìn)行3塊凝膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配，平均匹配點(diǎn)數(shù)為711個(gè)，匹配率為86%。選擇3塊凝膠中相互匹配且分辨清晰的50個(gè)蛋白點(diǎn)，選擇位置偏中間的一個(gè)點(diǎn)為原點(diǎn)，以參比膠為參考位置進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)在等點(diǎn)聚焦(IEF)方向上其平均偏差為(1.64±0.23)mm，在SDS方向上其平均偏差為(2.09±0.36)mm。表明所建立的2-DE方法對(duì)冬蟲夏草蛋白質(zhì)具有良好的分辨率和重現(xiàn)性。

注：a、b、c為三次重復(fù)。圖1 雙向電泳重復(fù)性試驗(yàn)圖譜(n=3)

3.2冬蟲夏草共有蛋白分析

采用Imagemaster7.0雙向電泳分析軟件進(jìn)行圖譜分析，將所有冬蟲夏草樣品設(shè)為一組，以樣品1圖譜為參考膠，進(jìn)行組內(nèi)匹配分析。見圖2。以各圖譜間匹配蛋白點(diǎn)為共同點(diǎn)，經(jīng)圖譜分析得到共同表達(dá)蛋白點(diǎn)88個(gè)。

圖2 正品冬蟲夏草共有蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測圖

3.3冬蟲夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)(差異蛋白質(zhì))研究

利用Imagemaster7.0軟件對(duì)各產(chǎn)地冬蟲夏草2-DE圖譜進(jìn)行匹配分析后，建立平均凝膠圖作為參比膠，各蟲草2-DE圖譜為分析膠組間匹配，進(jìn)行差異表達(dá)分析，以平均凝膠圖譜中存在而不同組間無法匹配的蛋白點(diǎn)為差異點(diǎn)。經(jīng)過分析后得到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)21個(gè)。

理論上這21種蛋白質(zhì)均可作為冬蟲夏草鑒定的指標(biāo)性組分，從實(shí)際操作上可選擇豐度較高的蛋白質(zhì)作為其指標(biāo)性蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。見圖3。

圖3 21個(gè)指標(biāo)性蛋白質(zhì)(差異蛋白質(zhì))圖譜

3.4質(zhì)譜分析結(jié)果

將獲得的21種蛋白質(zhì)N-端序列與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)。6種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數(shù)據(jù)庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數(shù)據(jù)庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫和全庫。見表2～4。

表2 蛋白質(zhì)檢索來源

表3 21個(gè)指標(biāo)性蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)范圍分類

表4 21個(gè)指標(biāo)性蛋白按分子量范圍分類

4 討論

首次采用高分辨率2-DE技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地冬蟲夏草和其他種蟲草進(jìn)行差異蛋白組學(xué)研究，建立各種蟲草蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，比對(duì)冬蟲夏草與其他種蟲草蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，驗(yàn)證得到21個(gè)冬蟲夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)。課題組后期將繼續(xù)增加冬蟲夏草及混偽品樣本量，以及使用不同pH范圍IPG膠條獲得更高分辨率電泳圖譜，對(duì)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。2-DE對(duì)分離低豐度蛋白、極酸極堿蛋白、極大(>200 kD)、極小蛋白(<10 kD)以及難溶蛋白，如膜蛋白等有局限性[19]，同時(shí)高豐度蛋白干擾低豐度蛋白檢出率，掩蓋分子量相似的低豐度蛋白質(zhì)，限制其裝載容量，同時(shí)影響聚焦效果[20]。本課題2-DE檢出可分析斑點(diǎn)平均為(537±25)個(gè)，且功能性蛋白質(zhì)大多屬于低豐度蛋白，可預(yù)先使用親和層析等方法除去部分高豐度蛋白，將獲得分辨率更高、蛋白質(zhì)信息更加豐富的電泳圖譜，為后續(xù)分離更多功能性蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

差異斑點(diǎn)大多分布在pH 4.5～6.5，分子量20～50 kD，15～25 kD范圍內(nèi)蛋白質(zhì)僅3種，提示可選擇低分子量蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步制備。

6種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數(shù)據(jù)庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數(shù)據(jù)庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數(shù)據(jù)庫和全庫。可能為冬蟲夏草菌在浸染蝙蝠蛾科蝠蛾屬昆蟲幼蟲過程中形成的特殊產(chǎn)物，對(duì)深入了解冬蟲夏草菌特異性浸染機(jī)制、冬蟲夏草特殊藥理作用相關(guān)蛋白質(zhì)具有重要意義。提示后期可針對(duì)篩選得到的具生物活性差異蛋白來源選取相應(yīng)冬蟲夏草子座或蟲體。

本研究首次利用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選到冬蟲夏草特有的21種蛋白質(zhì)，下一步可以作為指標(biāo)性組分進(jìn)行鑒定研究與實(shí)踐。動(dòng)物藥及種子果實(shí)類中藥蛋白質(zhì)含量豐富，在現(xiàn)有鑒定方案難以突破的前提下，嘗試蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量篩選技術(shù)無疑是一種有意義的嘗試。

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StudyonCharacteristicProteinsandIdentificationofOphiocordycepssinensisUsing2-DElectrophoresis

TONG Xinxin1，WANG Yixuan1，CHEN Lu1，QIU Yi1，WAN Deguang1，REN Yan1，PENG Cheng1，SHEN Caihong2，LI Junde3，GUO Jinlin1,2*

(1.Key Laboratory of Standardization of Chinese Medicine，Ministry of Education，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，611137，China；2.LuzhouLaoJiao Co.，Ltd.，Luzhou，646000，China；3.National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100700，China)

The study is aimed to establish an efficient two-dimensional gel electrophoresis protocol for proteomic studying ofOphiocordycepssinensis.Using two-dimensional electrophoresis，a proteomic analysis ofO.sinensisfrom different areas and other Cordyceps fungi were compared.88 kinds of proteins inO.sinensiswere found.Compared with other Cordyceps fungi，21 kinds of characteristic proteins spots inO.sinensiswere found.These indicated that the 21 kinds of proteins were able to be used to authenticateO.sinensisfrom other Cordyceps fungi.Then further analysis of the proteins Mass Spectra Database of NCBI，6 kinds of proteins came from the fungi database，6 kinds of proteins from insect database，12 kinds of proteins from the total database，3 kinds of proteins were found both in insect database and fungi database，1 kinds of proteins was found in the fungi database and total database.These indicate that further study is needed for some function protein.

Ophiocordycepssinensis；characteristic proteins；2-D electrophoresis(2-DE)；function protein

國家自然科學(xué)基金(30801522，81373920)

] 國錦琳，博士，教授，研究方向：名貴中藥資源與鑒定；Tel：(028)85214048，E-mail：guo596@163.om

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.005

2016-09-02)

*[