蔣超，趙群，金艷，袁媛*，趙玉洋

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.皖西學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽 六安 237012)

·專題·

快速PCR技術(shù)鑒別中藥材蛤蚧的方法研究△

蔣超1，趙群2，金艷1，袁媛1*，趙玉洋1

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京100700；2.皖西學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽 六安237012)

目的：建立簡單快速鑒別蛤蚧的特異性PCR方法。方法：對比蛤蚧及其偽品細(xì)胞色素C氧化酶I亞基基因(CO I)序列，設(shè)計蛤蚧特異性PCR鑒別引物，優(yōu)化特異性PCR條件，對蛤蚧及其7種常見混淆品進(jìn)行擴(kuò)增及熒光檢測。結(jié)果：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測，所有蛤蚧藥材均能擴(kuò)增出約400bp的特異性條帶，加入SYBR Green I染料后，在365nm下出現(xiàn)強(qiáng)烈綠色熒光，混偽品不具特異條帶和綠色熒光，鑒別操作可在30min內(nèi)完成。結(jié)論：快速PCR結(jié)合熒光染料檢測可快速鑒別蛤蚧及其常見偽品，為蛤蚧的快速鑒定提供了新的思路和方法。

快速PCR；分子鑒定；蛤蚧；熒光檢測

中藥蛤蚧來源于壁虎科動物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus.的干燥體，在臨床上主要用于肺腎不足、虛喘氣促、勞嗽咳血等。以蛤蚧為主要原料的中成藥，如蛤蚧精、蛤蚧補腎丸、蛤蚧定喘丸等應(yīng)用廣泛，用量甚大。近年來隨著蛤蚧資源的縮減，蛤蚧偽品時有出現(xiàn)，市場上出現(xiàn)過的蛤蚧偽品多達(dá)18種，包括東方蠑螈、中國瘰螈、變色樹蜥、無蹼壁虎、多疣壁虎、紅螺疣螈、喜山巖蜥、青海沙蜥、石龍子、變色沙蜥等[1-3]。對其中一些品種，蛤蚧正品與之形態(tài)學(xué)特征差別細(xì)微，傳統(tǒng)的方法難以對其藥材進(jìn)行鑒定[4]。為確保藥材市場中蛤蚧的質(zhì)量及其臨床療效，需要建立快速、準(zhǔn)確的方法進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為動物類中藥的鑒別提供了新的技術(shù)手段，尤其是特異性PCR技術(shù)，因其客觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點已用于蛤蚧[2]、蛇類[5-6]、鹿茸[7]、蛤蟆油[8]等動物類中藥的真?zhèn)舞b別。然而相對傳統(tǒng)方法其實驗周期較長，特別是完成PCR反應(yīng)后還需電泳與成像等步驟，嚴(yán)重制約了分子鑒定技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。快速PCR是在特異性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，通過結(jié)合DNA快速提取[9]、快速PCR擴(kuò)增和熒光檢測技術(shù)，能在30～40 min內(nèi)實現(xiàn)真?zhèn)舞b別。快速PCR技術(shù)自從在金銀花[10]和蛇類藥材[11]應(yīng)用以來快速發(fā)展，已用于魚腥草[12]、杜仲[13]、西紅花[14]、絞股藍(lán)[15]、人參[16]、艾納香[17]、菟絲子[18]等中藥的真?zhèn)舞b定與質(zhì)量控制。本研究擬通過利用堿裂解法快速提取DNA，優(yōu)化特異性PCR反應(yīng)程序，進(jìn)行快速擴(kuò)增，結(jié)合SYBR Green I熒光染料對真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行肉眼檢測，將蛤蚧PCR鑒制時間控制在40 min內(nèi)，為實現(xiàn)蛤蚧的現(xiàn)場DNA分子鑒別提供技術(shù)保障。

1 儀器與試藥

1.1儀器

PCR儀：VeritiTM型(AppliedBiosystem公司)、GeneAmp9700型(AppliedBiosystem公司)、PTC-100型(Gene公司)、TC-512型(Techne公司)、Mastercycler型(Eppendorf公司)；5810R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；VORTEX-2GENIE漩渦震蕩儀(Scientificindustries公司)；PowerPacTM型電泳儀(Bio-Rad公司)；HE99X-15-1.5型電泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司)；WD-9403C型紫外儀(北京市六一儀器廠)。

1.2材料

選取來自于不同產(chǎn)地的蛤蚧正品及7種蛤蚧類偽品共79份材料進(jìn)行快速PCR鑒別研究。樣品采自安徽亳州、廣西玉林、成都荷花池等藥材市場，憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。見表1。

表1 材料詳表

1.3試劑

不同特性TaqDNA聚合酶：低保真的rTaq(Takara公司)、中度保真的SpeedStarHSTaq(Takara公司)、高度保真的Q5TaqDNA聚合酶(NEB公司)；I-52×High-FidelityMasterMix預(yù)混液(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖(Promega公司)；溴化乙啶(Fluka公司)；DL2000DNAMarker(Takara公司)；10000×SYBRGreenI(Invitrogen公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1引物設(shè)計

2.1.1序列比對 從NCBI數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中下載蛤蚧(HM362960.1、F920686.1)及其可能的偽品東方蠑螈(CynopsorientalisEU880311.1)、變色樹蜥(KC016067.1)、無蹼壁虎(EU417712.1)、中國壁虎(GekkochinensisKP666135.1)、青海沙蜥(PhrynocephalusvlangaliiKF691719.1)、喜山巖蜥(LaudakiahimalayanaHM362935.1)、變色沙蜥(KF691736.1)、麗斑麻蜥(HQ733935.1)的CO I序列，對于網(wǎng)上無序列的中國瘰螈、紅瘰疣螈、中國石龍子樣品和蛤蚧正品使用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198[19]，按照標(biāo)準(zhǔn)程序(見表2)進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行雙向測序，序列經(jīng)拼接后與下載的序列一起利用Clustal W程序進(jìn)行多重序列比對，選擇蛤蚧與其偽品差異大的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計。

2.1.2引物設(shè)計 使用Premier Primer5.0(http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/)設(shè)計特異性PCR鑒別引物，調(diào)整參數(shù)使引物為3′末端位于蛤蚧與其偽品差異區(qū)域，PCR產(chǎn)物長度為100～400bp，Tm值為55～65℃，引物命名為GeJie.F和GeJie.R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.2基因組總DNA的提取

取2g樣品，使用Retsch MM400球磨粉碎至能過80目篩，取20mg粉末，使用堿裂解法[9]提取總DNA，所提取DNA稀釋10倍用于PCR反應(yīng)。通用引物對LCO1490/HCO2198用于PCR反應(yīng)，以檢測DNA質(zhì)量。20μL PCR反應(yīng)體系包含2μL10×FBI緩沖液、1μL10mmol·L-1dNTPs、0.25μmol·L-1上游及下游引物、1U Speedstar HS Taq酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10mg·mL-1BSA溶液、1μL DNA模板，反應(yīng)程序見表2。

表2 引物及PCR反應(yīng)條件

2.3PCR擴(kuò)增條件的確定

通過調(diào)整PCR體系和反應(yīng)程序確定蛤蚧特異性鑒別的最優(yōu)條件。25μL初始PCR反應(yīng)體系包含2.5μL10×PCR buffer、1μL10m mol·L-1dNTPs、0.25μmol·L-1上游及下游引物、1U快速Taq酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10mg·mL-1BSA溶液、1μL(約20ng)DNA模板，PCR反應(yīng)在VeritiTM型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。初始反應(yīng)程序見表2。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5μL6×Loading buffer(Takara公司)，混勻后于EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

使用蛤蚧鑒別引物對蛤蚧正品及其常見偽品總DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并分別考察退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、模板DNA濃度、變性和退火時間、Taq種類、不同PCR儀對PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

2.4PCR產(chǎn)物檢測

為達(dá)到快速鑒別的目的，PCR產(chǎn)物使用熒光發(fā)光的方式進(jìn)行檢測。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，置96孔微孔板中，加入2μL100×SYBR Green I，于365nm紫外波長下檢測熒光，出現(xiàn)強(qiáng)烈綠色熒光則表明有擴(kuò)增。

3 結(jié)果

3.1蛤蚧特異性鑒別引物的設(shè)計

使用ClustalW軟件對蛤蚧、東方蠑螈、變色樹蜥、無蹼壁虎、中國壁虎、青海沙蜥、喜山巖蜥、變色沙蜥、麗斑麻蜥、中國瘰螈、紅瘰疣螈、中國石龍子的COI序列進(jìn)行多重序列比對，以蛤蚧與偽品具有差異的SNP位點為基礎(chǔ)設(shè)計引物，蛤蚧預(yù)期擴(kuò)增長度為413bp，見圖1。

圖1 蛤蚧特異性鑒別引物設(shè)計結(jié)果

3.2蛤蚧類樣品DNA提取

堿裂解法提取的蛤蚧及其偽品總DNA經(jīng)NanoDrop核酸蛋白儀檢測，濃度為(233.6±79.2)ng·μL-1，A260/A280為(1.42±0.17)，符合PCR擴(kuò)增的要求；由于使用堿裂解法提取的DNA不適宜使用凝膠電泳檢測[9]，故本文采用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198檢驗擴(kuò)增效率。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測均可獲得約700bp DNA條帶，表明堿裂解法對蛤蚧類材料具有良好的提取效果，見圖2。

注：M.100 bp DNA ladder；1～4.蛤蚧；5～7.變色樹蜥；8～10.變色沙蜥；11～13.麗斑麻蜥；14.紅螺疣螈；15～17.中國石龍子；18～22.無蹼壁虎；23.中國瘰螈；24.空白對照(以dd H2O為模板)。圖2 LCO1490/HCO2198引物擴(kuò)增堿裂解法提取DNA結(jié)果

3.3快速PCR鑒別條件考察

由于影響特異性鑒別準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素包括退火溫度、循環(huán)數(shù)和模板DNA濃度，而決定PCR反應(yīng)速度的核心因素為循環(huán)數(shù)和退火/延伸時長，本研究以正品擴(kuò)增強(qiáng)度和偽品條帶有無為指標(biāo)，依次對退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA濃度、變性/退火時間進(jìn)行系統(tǒng)考察，同時考察篩選的條件對不同Taq DNA聚合酶及不同PCR擴(kuò)增儀的耐受性。結(jié)果表明，退火溫度為63～67℃，循環(huán)數(shù)為25～35，DNA模板濃度為4～100ng·μL-1，變性時間和退火時間在5～30s時均可準(zhǔn)確鑒別蛤蚧及其常見偽品，見表3。在此條件下對不同保真度的Taq酶和不同型號PCR儀均具有耐受性，見表3。而退火溫度過低(<61℃)、循環(huán)數(shù)過大(>40)則會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，模板濃度過低(<1ng·μL-1)則會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最終確定蛤蚧快速PCR鑒別反應(yīng)條件為95 ℃，1 min；95 ℃，10 s；65 ℃，10 s，30個循環(huán)，在Veriti PCR儀上可于30 min內(nèi)完成PCR反應(yīng)。

表3 蛤蚧特異性PCR條件考察結(jié)果

3.4適用性考察

使用蛤蚧特異性鑒別引物，采用篩選出的體系和PCR條件，對亳州、玉林、成都等不同藥材市場的32批正品蛤蚧樣品及變色樹蜥、變色沙蜥、麗斑麻蜥、紅瘰疣螈、中國石龍子、無蹼壁虎、中國瘰螈7種共47批蛤蚧偽品進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，僅蛤蚧正品在250-500bp間產(chǎn)生明亮單一條帶，偽品無條帶，不同市場來源的正品蛤蚧均產(chǎn)生一致結(jié)果，表明該體系能穩(wěn)定準(zhǔn)確地鑒別蛤蚧。

由于凝膠電泳較費時費力，本研究在蛤蚧PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)直接加入2μL100×SYBRGreenI，于365nm紫外燈下肉眼觀察，所有蛤蚧正品均產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，而偽品無熒光，可達(dá)到快速鑒別目的。見圖3～4。

注：A.PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果；B.PCR產(chǎn)物加入SYBR Green I后于365 nm紫外下檢視結(jié)果；M.DL2000 Marker；1～4.蛤蚧；5～7.變色樹蜥；8～10.變色沙蜥；11～13.麗斑麻蜥；14.紅螺疣螈；15～17.中國石龍子；18～22.無蹼壁虎；23.中國瘰螈；24.空白對照(以dd H2O為模板)。圖3 蛤蚧正偽品鑒別結(jié)果

注：A.PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果；B.PCR產(chǎn)物加入SYBR Green I后于365 nm紫外下檢視結(jié)果；M.100 bp ladder Marker；1～4.蛤蚧(亳州)；5～20.蛤蚧(玉林)；21～24.蛤蚧(成都)。圖4 不同批次蛤蚧鑒別結(jié)果

4 分析與討論

進(jìn)行DNA分子鑒定的前提條件是正品與混偽品間存在明顯的種間序列差異，本研究對正品蛤蚧及來源相近、外觀形態(tài)相似的7種混偽品COI序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)正偽品序列存在顯著差異，系統(tǒng)發(fā)育樹分析亦呈單系[20]，從而設(shè)計特異性引物進(jìn)行鑒別研究。蛤蚧有兩種形態(tài)：紅斑蛤蚧和灰斑蛤蚧，其中紅斑蛤蚧主要為進(jìn)口，產(chǎn)自泰國、越南等地，量大；灰斑蛤蚧主要產(chǎn)自廣西，量很少。為保證方法的適用性，我們采集了廣西的灰斑蛤蚧和不同來源的紅斑蛤蚧進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，該方法對紅斑和灰斑蛤蚧均能進(jìn)行鑒別。本研究也對這兩種蛤蚧COI片段進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其序列沒有區(qū)別，該結(jié)果與張月云等人通過12S測序的結(jié)果一致[21]。用于鑒別研究的蛤蚧混偽包括鬣蜥科變色樹蜥和變色沙蜥、蜥蜴科麗斑麻蜥、石龍子科中國石龍子、蠑螈科中國瘰螈和紅螺疣螈，雖然形態(tài)相似，其COI序列差異明顯，設(shè)計的引物能達(dá)到良好的鑒別效果。同屬的無蹼壁虎COI序列與蛤蚧序列差異小，為防止鑒別時出現(xiàn)條帶產(chǎn)生假陽性，本研究使用較高的退火溫度(65℃)，以保障鑒別的特異性；同時，在引物設(shè)計上盡量使差異位點位于3′末端，在使用較高的退火溫度時，實驗使用的幾種TaqDNA聚合酶均能很好的對蛤蚧及其混偽品進(jìn)行鑒別。

為達(dá)到快速鑒定的目的，本研究利用堿裂解法提取總DNA，并使用SYBRGreenI熒光染料進(jìn)行熒光檢測。SYBRGreenI能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光，從而監(jiān)測PCR產(chǎn)物的有無，具有靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點，但同時也可與引物二聚體等非特異性產(chǎn)物發(fā)生假陽性反應(yīng)，影響鑒別的準(zhǔn)確性。在引物設(shè)計時需嚴(yán)格避免二聚體的形成，并通過凝膠電泳進(jìn)行檢測。堿裂解法是一種DNA快速提取技術(shù)，能在5～10min內(nèi)獲得足以進(jìn)行PCR的DNA，已成功用于蛇類、冬蟲夏草[22]、桑螵蛸[23]等多種動物藥材的DNA提取。本研究表明，堿裂解法也可用于蛤蚧的DNA提取，并且不需要大型儀器，為動物藥快速、現(xiàn)場鑒定提供了技術(shù)保障。

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Molecular Authentication of Gecko and Its Adulterants by Rapid Specific PCR

JIANG Chao1，ZHAO Qun2，JIN Yan1，YUAN Yuan1*，ZHAO Yuyang1

(1.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing，100700，China；2.DepartmentofChemistryandLifeSciences，WestAnhuiUniversity，Lu’an，Anhui，237012，China)

Objective：To establish a rapid specific PCR method to authenticate gecko and its adulterants.Methods：Specific PCR primers were designed based on CO I sequences and the annealing temperature of PCR reaction conditions was optimized，which was performed to authenticate gecko and its 7 adulterants combined with fluorescence analysis.Results：Gecko could obtain a 400 bp specific band in electrophoresis and a great green fluorescence was also observed under 365 nm UV lamp，while the adulterants did not.Conclusion：The results indicated that rapid specific PCR combined with SYBR green I fluorescence detection could authenticate gecko and its adulterants rapidly and simply，which provided a new idea and way for gecko rapid identification.

Rapid PCR；molecular authentication；gecko；fluorescence detection

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407003)

] 袁媛，研究員，研究方向：中藥功能基因組研究及中藥分子鑒定；Tel：(010)64014411-2956，E-mail：y_yuan0732@gmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.004

2016-08-14)

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