茍興，趙樹海，李先天，袁小慧，李祖泉，李小海 *

(1.四川千方中藥飲片有限公司，四川 成都 610500；2.巴中市通江銀耳科學(xué)技術(shù)研究所，四川 巴中 636700；3.通江縣食品藥品監(jiān)督管理局，四川 巴中 636700)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同來源銀耳中銀耳多糖差異分析△

茍興1，2，趙樹海2，李先天3，袁小慧1，李祖泉1，李小海1 *

(1.四川千方中藥飲片有限公司，四川 成都 610500；2.巴中市通江銀耳科學(xué)技術(shù)研究所，四川 巴中 636700；3.通江縣食品藥品監(jiān)督管理局，四川 巴中 636700)

目的：建立HPLC法測定銀耳中銀耳多糖單糖含量的方法，并比較不同來源銀耳中單糖含量的差異。方法：根據(jù)銀耳特性，優(yōu)化酸水解-PMP柱前衍生方法以及HPLC色譜條件，對12批次通江段木培育銀耳樣品以及8批次福建棉籽殼代料銀耳進(jìn)行多糖的單糖組成分析。結(jié)果：優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法適用于銀耳多糖中單糖組分的檢測。結(jié)論：通過數(shù)據(jù)對比分析可以看出，不同來源和培育方式的銀耳在甘露糖、葡萄糖、巖藻糖等含量上存在著比較明顯的差異；通過論證認(rèn)為，這些差異可以為制定銀耳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供必要的參考和借鑒。

銀耳多糖；柱前衍生；高效液相色譜；差異分析

銀耳(TremellafuciformisBerk)，又名白木耳，是擔(dān)子菌門真菌，其子實(shí)體長期以來都被作為食藥兩用。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，人們對銀耳的藥用價(jià)值也在不斷地深入。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道[1-3]，銀耳中最重要的活性物質(zhì)是銀耳多糖，也是到目前為止研究最多的銀耳成分。銀耳多糖主要分為五大類，分別是：酸性雜多糖，中性雜多糖，胞壁多糖，胞外多糖，酸性低聚糖。其含量和構(gòu)成是影響銀耳藥用、食用及保健作用的重要因素。

銀耳多糖種類偏多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，要直接分析銀耳多糖的含量和結(jié)構(gòu)有很大的難度。經(jīng)過對五大類銀耳多糖的分子結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖雖然結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但是構(gòu)成多糖的主要寡糖成分比較簡單，主要是：甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、果糖、巖藻糖、半乳糖，并且絕大部分銀耳多糖的主鏈都是由甘露糖聚合而成[4]。因此，通過測量銀耳多糖中甘露糖的含量就可以間接判斷銀耳多糖在銀耳中的含量高低。同時(shí)，對其他寡糖含量的分析也可有助于判斷銀耳多糖質(zhì)量的高低。這樣就可以把復(fù)雜大分子的測量轉(zhuǎn)化為對簡單小分子的測量。

目前測量多糖內(nèi)部單糖構(gòu)成主要采用的是酸水解-柱前衍生的方法。1989年Honda等[5-7]采用PMP柱前衍生法，使具有感光性的PMP衍生劑與糖類的羰基發(fā)生加成作用，就能夠通過HPLC-紫外檢測器對糖類的含量進(jìn)行精確測定。近年來，PMP柱前衍生的方法越來越多的運(yùn)用到了中藥多糖組分的分析中[8-10]。雖然PMP柱前衍生在糖類檢測方面具有一定的優(yōu)勢，但是仍存在一定的缺陷，特別是在樣品的處理過程中可能產(chǎn)生美拉德反應(yīng)[11]以及萃取過程中單糖衍生物在三氯甲烷中有微小的溶解度，都會造成實(shí)際測定值偏低。并且PMP與糖類羰基的反應(yīng)是可逆反應(yīng)，衍生之后的化合物如果放置時(shí)間過長，PMP會與羰基脫離，同樣可能造成測定的誤差。

本實(shí)驗(yàn)以銀耳的質(zhì)量分析為目的，根據(jù)銀耳及銀耳多糖的特點(diǎn)，改進(jìn)了酸解-PMP柱前衍生方法和液相條件。利用改進(jìn)后的方法對來源不同的銀耳樣品進(jìn)行定量檢測，分析差異，制定銀耳特征圖譜，為銀耳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供必要的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試劑試藥

對照品：D-甘露糖(批號：140651-201403)、D-葡萄糖(批號：110833-201205)、L-巖藻糖(批號：112014-201601)、半乳糖(批號：100226-201105)、D-葡萄糖醛酸(批號：140648-200602)，購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑(色譜純)：甲醇、乙腈，購自科隆化工有限公司；試劑(分析純)：1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氟乙酸、三氯甲烷，購自科隆化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SSI高效液相色譜儀、紫外檢測器，系統(tǒng)：Chromatography Data System-Version3.6；Waters高效液相色譜儀、紫外檢測器，系統(tǒng)：Empowaer 3；漩渦混合器；鼓風(fēng)干燥箱；超聲清洗器；水浴鍋，等。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

從銀耳道地藥材原產(chǎn)地四川通江采集得到12批段木銀耳樣品，經(jīng)通江縣食品藥品監(jiān)督管理局監(jiān)督抽樣，由通江縣食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心主任李先天工程師鑒定，均符合段木銀耳特征。批號：T2016-31、T2016-32、T2016-41、T2016-42、T2016-51、T2016-52、T2016-61、T2016-62、T2016-X2、T2016-A2、T2016-X1、T2016-A1

從福建古田采購得到8批棉籽殼代料銀耳樣品，由通江縣食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心主任李先天工程師鑒定，均符合棉籽殼代料銀耳特征。批號：F2015-01、F2015-02、F2015-71、F2015-72、F2015-91、F2015-82、F2015-81、F2015-92

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以15%乙腈-85%磷酸鹽緩沖液為流動相A，以40%乙腈-60%磷酸鹽緩沖液為流動相B。磷酸鹽緩沖液：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液(pH 6.7)(磷酸二氫鉀6.8 g和NaOH 0.9 g溶解于1 L水中)。按表1中的方案進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為250 nm，進(jìn)樣量為20 μL。理論塔板數(shù)按特征圖譜中的6個(gè)特征峰計(jì)算，均不得低于5000。

表1 流動相梯度洗脫方案

2.2 對照品溶液制備

取甘露糖、葡萄糖對照品，精密稱定，加水制成每1mL含200 μg的溶液。精密量取400 μL，加入0.5 mol·L-1PMP(1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400 μL，再加入0.3 mol·L-1NaOH溶液400 μL，渦旋混合30 s，置70 ℃水浴中加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol·L-1HCl溶液400 μL，再加入水800 μL稀釋混勻，加入三氯甲烷洗滌2次，每次2 mL，棄去三氯甲烷，水層離心，取上清液即得。

2.3 供試品溶液制備

取60 ℃干燥至恒重的本樣品粉末(過5號篩)約0.1 g，精密稱定，置頂空瓶或安培瓶中，加2 mol·L-1三氟乙酸6 mL，漩渦震蕩30 s混勻；置120 ℃烘箱中加熱4 h。取出，放冷，30 ℃以下低溫減壓濃縮至干，殘?jiān)铀? mL洗滌，繼續(xù)低溫減壓濃縮至干。殘?jiān)铀?0 mL，使充分溶解，濾過，精密吸取續(xù)濾液400 μL，照參照物溶液的制備方法，自“加入0.5 mol·L-1PMP(1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液”起，依法操作，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取D-甘露糖對照品溶液，加水稀釋成濃度分別為114.3125、228.625、457.25、914.5、1371.75 μg·mL-1，精密吸取D-葡萄糖對照品溶液，加水稀釋成濃度分別為73.625、147.25、294.5、589、883.5 μg·mL-1，在上述條件下測定峰面積，以峰面積(Y)與D-甘露糖濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=151 48X(r=0.999 5)，以峰面積(Y1)與D-葡萄糖濃度(X1)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y1=12455X1(r=0.9997)。結(jié)果表明D-甘露糖在114～1371 μg·mL-1，葡萄糖在73～883 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性試驗(yàn)

用未經(jīng)酸水解的銀耳提取液進(jìn)行PMP柱前衍生-HPLC測定，結(jié)果如圖1。

注：峰1.甘露糖；峰2.葡萄糖醛酸；峰3.葡萄糖； 峰4.巖藻糖。圖1 未水解銀耳樣品單糖成分

由圖1結(jié)果可知，未經(jīng)酸水解的銀耳提取液中幾乎不含游離的甘露糖，因此用酸水解-PMP柱前衍生法測定所得甘露糖幾乎全部是由甘露聚糖水解而來，證明本實(shí)驗(yàn)用于測定銀耳多糖中的甘露糖含量具有可靠的專屬性。

2.6 精確度試驗(yàn)

設(shè)計(jì)了3組不同濃度的淀粉處理樣品(S11、S12、S13為一組，高效液相進(jìn)樣時(shí)濃度以淀粉計(jì)為240 μg·mL-1左右；S21、S22、S23為一組，高效液相進(jìn)樣時(shí)濃度以淀粉計(jì)為200 μg·mL-1左右；S31、S32、S33為一組，高效液相進(jìn)樣時(shí)濃度以淀粉計(jì)為170 μg·mL-1)，用9個(gè)測定結(jié)果評價(jià)酸水解-PMP柱前衍生法用于淀粉測定的回收率，中間濃度(S21、S22、S23)與供試品含量之比接近1∶1。檢驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 淀粉回收率實(shí)驗(yàn)

由表2計(jì)算可得，經(jīng)過酸水解和柱前衍生，再用高效液相測定，回收率如果僅以葡萄糖的含量計(jì)算為100.9%～107.5%。因?yàn)槠咸烟堑姆肿邮綖镃6H12O6，淀粉的分子式為(C6H10O5)n，淀粉水解為葡萄糖后分子量會上升10%，扣除分子量上升的因素，則淀粉實(shí)際回收率為90.5%～95.6%。銀耳多糖是由甘露糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖等以糖苷鍵聚合而成，構(gòu)成方式與淀粉相同，因此酸水解-PMP柱前衍生法用于銀耳多糖檢測的回收率應(yīng)與淀粉相近，精確度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試樣品(批號：T2016-X1)，平行6份，按供試品溶液同法制備，注入高效液相色譜儀，測定甘露糖峰面積，RSD為2.3731%，表明本法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取三份銀耳樣品G1、G2、G3作葡萄糖的加樣回收試驗(yàn)。G1+、 G2+、G3+分別為樣品G1、G2、G3中精密加入0.02 g左右的D-葡萄糖對照品。按供試品溶液同法制備，測定葡萄糖含量，結(jié)果表明，三組樣品的平均回收率為92.1%，結(jié)果見表3。

表3 葡萄糖加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.9 耐用性

分別用5個(gè)不同品牌和規(guī)格的C18柱子在Waters 2695和奧泰SSI兩種高效液相色譜儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均可得到標(biāo)準(zhǔn)的特征圖譜，未發(fā)生色譜峰重疊及交換現(xiàn)象，證明本實(shí)驗(yàn)用于銀耳多糖的測量具有較好的耐用性。

2.10 特征圖譜建立

供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，其中峰1、峰4應(yīng)與參照物甘露糖、葡萄糖保留時(shí)間一致；以葡萄糖的特征峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間，相對保留時(shí)間為：0.753(峰2)、0.898(峰3)、1.0(峰S)、1.082(峰5)、1.182(峰6)，各峰與S峰的相對保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。

注：峰1.甘露糖；峰2.未知峰；峰3.葡萄糖醛酸； 峰4(S).葡萄糖；峰5.木糖；峰6.巖藻糖。圖2 銀耳對照特征圖譜

2.11 樣品含量測定

從銀耳道地藥材原產(chǎn)地四川通江采集得到12批銀耳樣品，以及從福建采購棉籽殼代料銀耳8批依照方法進(jìn)行檢測，測定結(jié)果如表4。

甘露糖含量測定計(jì)算公式：

表4 段木銀耳與棉籽殼代料銀耳檢測數(shù)據(jù)對比

3 討論

根據(jù)《中國藥典附錄標(biāo)準(zhǔn)起草指導(dǎo)原則》的要求進(jìn)行的可靠性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明：優(yōu)化后的酸水解-PMP柱前衍生法及HPLC方法對于銀耳中多糖組分的檢測具有比較高的可靠性。

由表1中段木銀耳和代料銀耳的數(shù)據(jù)范圍可以大體判斷出，通江段木培育銀耳相比棉籽殼代料銀耳在多糖指標(biāo)上具有如下特點(diǎn)：1)甘露糖含量總體較高；2)甘露糖峰面積/葡萄糖峰面積比值總體較高；3) 葡萄糖峰面積/巖藻糖峰面積比值總體較低(其中葡萄糖含量為銀耳中結(jié)合葡萄糖與游離葡萄糖總和)。

由于銀耳含有大量的膠質(zhì)成分，且吸水性很強(qiáng)，在液體中加熱會迅速膨脹，如果取樣量過大會在一定程度上影響酸解效果，因此經(jīng)過試驗(yàn)，最終將酸解體系定為：2 mol·L-1三氟乙酸6 mL，樣品0.1 g。用同一銀耳樣品和相同的酸解體系進(jìn)行酸解，設(shè)置不同的酸解終止時(shí)間，再進(jìn)行PMP柱前衍生-HPLC測定，最后結(jié)果表明，在酸解3 h后，所得單糖的量并無明顯增加，因此本實(shí)驗(yàn)酸解時(shí)間定為4 h。在三氯甲烷萃取PMP過程中，對比了兩次和三次萃取對最終回收率的影響。結(jié)果表明，兩次萃取回收率要略高于三次萃取，殘留PMP的濃度要明顯高于三次萃取，但并不影響液相效果，因此本實(shí)驗(yàn)采用兩次三氯甲烷萃取。根據(jù)銀耳多糖的單糖組成，在乙腈-磷酸鹽溶液作混合流動相的基礎(chǔ)上重新制訂了液相梯度條件，盡可能使各個(gè)單糖組分在HPLC圖譜中分開且排列整齊，見圖2。

結(jié)合前文中提到，絕大多數(shù)銀耳多糖都是以甘露糖為主鏈(極少數(shù)以半乳糖為主鏈)，可以間接判斷通江段木銀耳含有的銀耳多糖總量較多。由銀耳的生活規(guī)律可知，銀耳菌本身含有的木質(zhì)素酶、纖維素酶活性不高[12]，不能直接從培養(yǎng)基上來獲得營養(yǎng)，必須通過香灰菌分解木質(zhì)素和纖維素才能獲得必需養(yǎng)分。利用酸水解-PMP柱前衍生方法分別進(jìn)行銀耳與香灰菌的單糖組分測定，HPLC圖譜如圖3。

注：峰1.甘露糖；峰2.葡萄糖；峰3.半乳糖； 峰4.木糖；峰5.巖藻糖。圖3 銀耳與香灰菌單糖對照圖

由色譜圖可以看出，香灰菌主要含有甘露糖、葡萄糖(香灰菌樣品中檢出較多量的半乳糖，根據(jù)分析有可能是樣品中帶有的培養(yǎng)基成分)，幾乎不含有木糖和巖藻糖成分。根據(jù)前文所述，自然存在的甘露糖一般都是以聚合物形式存在，此前未見報(bào)道銀耳中含有降解甘露聚糖的酶，因此可以推斷，銀耳菌從香灰菌中獲得的糖類成分主要是葡萄糖，再通過葡萄糖的烯醇化等途徑轉(zhuǎn)化為甘露糖、木糖、巖藻糖等，最終聚合成銀耳多糖。巖藻糖及其聚合物具有很高的藥用價(jià)值[13-14]，其含量的多少直接影響著銀耳在抗癌、抗腫瘤等方面的藥用效果?！捌咸烟欠迕娣e/巖藻糖峰面積”這一比值間接反應(yīng)了銀耳菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為巖藻糖的轉(zhuǎn)化效率，通江段木銀耳的比值要明顯低于棉籽殼代料銀耳說明，段木培育的銀耳將葡萄糖轉(zhuǎn)化為巖藻糖的效率會更高。

綜上所述，酸水解-PMP柱前衍生法是一種可行的分析銀耳多糖總量和質(zhì)量的方法。由測定所得的數(shù)據(jù)可以看出，在不同來源和培育方式的銀耳樣品之間存在著明顯的差異，可以依據(jù)這些差異并結(jié)合銀耳的實(shí)際用途制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

[1] Hirano E，Saito H，Ito Y，et al.PB-2，a polysaccharide fraction from lichen Flavoprmelia baltimorensis，peripherally promotes the induction of long-term potentiation in the rat dentate gyrus in vivo[J].Brain Research，2003，963(1-2)：307-311.

[2] Leao A M，Buchi D F，Iacomini M，Gorin P A，Oliveira MB.Cytotoxic effect against HeLa cells of polysaccharides from the lichen Ramalina celastri[J].J Submicroscopic Cytology Pathology，1997，29(4)：503-509.

[3] Olafsdottir E S.Ingolfsdottir Kpolysaccharides from lichens：structural characteristics and biological activity[J].Planta Medica，2001，67(3)：199-208.

[4] 馬素云，賀亮，姚麗芬.銀耳多糖結(jié)構(gòu)與生物活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31(23)：411-416.

[5] Honda S，Akao E，Su-uzki S，et al.High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly uitraciolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-pheny-3-methyl-5-pyrazolone derivatives[J].Analytical Biochemistry，1989，180(2)：351-357.

[6] Honda S，Togashi K，Taga A.Unusual separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives of aldoses by capillary zone electrophoresis[J].J Chormatogra，1997，791(1-2)：307-311.

[7] Honda S，Suuzki S，Taga A.Analysis of carbohydrates as 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by capillary/microchip electrophoresis and capillary electrochromatography[J].J Pharm.Biomed.Anal，2003，30(6)：1689-1714.

[8] 楊興斌，趙燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色譜儀分析當(dāng)歸多糖的單糖組成[J].分析化學(xué)，2005，33(9)：1287-1290.

[9] 戴軍，朱松，湯堅(jiān)，等.PMP柱前衍生高效液相色譜法分析杜氏鹽藻多糖的單糖組成[J].分析測試學(xué)報(bào)，2007，26(2)：206-210.

[10]錢韻旭，劉裴，李莉，等.白花蛇舌草多糖的分離純化及PMP柱前衍生高效液相分析[J].云南中藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33(3)：43-46.

[11]吳松，秦軍.Maillard反應(yīng)的機(jī)理研究[J].貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，34(4)：17-20.

[12]梁勤.我國銀耳種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及木質(zhì)素、纖維素酶活性測定[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[13]Alline R.Pacheco，Meredith M.Curtis，Jennifer M.Ritchie，et al.Fucose sensing regulates bacterial intestinal colonization[J].Nature，2012，492(7427)：113-117.

[14]劉穎，張敏，吳茜茜，等.巖藻多糖的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(6)：146-151.

VarianceAnalysisofPolysaccharideinDifferentSourcesofTremella

GOUXing1，2，ZHAOShuhai2，LIXiantian3，YUANXiaohui1，LIZuquan1，LIXiaohai1

(1.SichuanQianfangTraditionalChineseMedicineco.，Ltd，Chengdu610500，China；2.BazhongTongjiangtremellainstituteofscienceandtechnology，Bazhong636700，China；3.TongjiangFoodandDrugAdministration，Bazhong636700，China)

Objective：To establish an HPLC method for determination of monosaccharide content of polysaccharides inTremellafuciformis，and compare the difference of monosaccharide content in Tremella from different sources.Methods：The optimized method of the acid hydrolysis，and PMP precolumn derivative HPLC method were applied to analyze the monosaccharide composition of 12 batches Tremella cultivated from woods log in Tongjiang and 8 batch ones cultivated from artificial media(cottonseed hull) in Fujian.Results：The experiments results showed that the optimized method was appropriate，and there were significant differences in the content of mannose，glucose，fructose in different Tremella samples.Conclusion：There exist a significant differences in composition of Tremella polysaccharide of different sources and cultivating way of Tremella.The study provides reference for the establishment of the Tremella quality standard.

Tremella polysaccharide；precolumn derivatization；HPLC；variance analysis

《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015年版銀耳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

] 李小海，執(zhí)業(yè)藥師；Tel：13308236893，E-mail：qftcm@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.018

2016-11-10)

*[