范建偉，劉武占，李艷芳，張貴民，蘇瑞強(qiáng)*

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.山東省中藥制藥新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006)

·中藥工業(yè)·

小兒消積止咳口服液的HPLC指紋圖譜研究△

范建偉1，2，3，劉武占1，2，3，李艷芳1，2，3，張貴民1，2，3，蘇瑞強(qiáng)1，2，3*

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.山東省中藥制藥新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006)

目的：建立小兒消積止咳口服液的HPLC指紋圖譜，科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制該制劑的質(zhì)量，保證其生產(chǎn)的穩(wěn)定性。方法：采用HPLC建立小兒消積止咳口服液的指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件(2004 A版)對(duì)22批小兒消積止咳口服液樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：通過(guò)22批樣品的測(cè)定，以柚皮苷峰為參照峰，建立了小兒消積止咳口服液的HPLC指紋圖譜，相似度均在0.90以上，共確認(rèn)了19個(gè)共有色譜峰。結(jié)論：所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為小兒消積止咳口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

小兒消積止咳口服液；指紋圖譜；高效液相色譜

小兒消積止咳口服液是依據(jù)“食積咳嗽”論治理論研制的兒科用中藥制劑[1]，為國(guó)家中藥保護(hù)品種，由炒山楂、檳榔、枳實(shí)、瓜蔞、連翹、桔梗、蟬蛻等10味中藥組成，具有清熱肅肺、消積止咳的功能，臨床用于小兒飲食積滯、痰熱蘊(yùn)肺所致的咳嗽、夜間加重、喉間痰鳴、腹脹、口臭等癥[2]。現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該制劑的主要質(zhì)量控制方法為與檳榔、連翹、桔梗對(duì)照藥材及辛弗林對(duì)照品進(jìn)行TLC鑒別和HPLC測(cè)定辛弗林的含量，未對(duì)處方進(jìn)行整體質(zhì)量控制的研究，難以有效反映制劑的整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的鑒定手段，其信息量大、特征性強(qiáng)、整體性、模糊性等特點(diǎn)能全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，目前已成為符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式之一，并在中藥制劑質(zhì)量控制上的應(yīng)用愈加廣泛[3-6]。本研究通過(guò)建立小兒消積止咳口服液的HPLC指紋圖譜，運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)方法進(jìn)行分析，為小兒消積止咳口服液的全面質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation色譜工作站；國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)軟件。

柚皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201312)；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

22批小兒消積止咳口服液樣品(魯南厚普制藥有限公司，批號(hào)分別為00414003、00414004、00414005、00414006、00414053、00414055、00414156、00414043、00414047、00414048、00414050、00414058、00414059、00414132、11053020、11063026、11123016、12023020、12033028、00413305、00413238、00413484，依次編號(hào)為S1-S22號(hào))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(天津特納，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)和0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，梯度條件見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 流動(dòng)相梯度條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.44 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取小兒消積止咳口服液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S12號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。6張譜圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，相似度均大于0.99，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S12號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。6張譜圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，相似度均大于0.96，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S12號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。6張譜圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，相似度均大于0.99，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 參照峰的選擇 取對(duì)照品溶液和供試品溶液(S12號(hào)樣品)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。2張譜圖中，16號(hào)峰(柚皮苷峰)保留時(shí)間適中，分離度好，峰面積較大且穩(wěn)定，故選其為參照峰，標(biāo)記為S，見圖1。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；16.柚皮苷。圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC圖

2.5.2 指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn) 取小兒消積止咳口服液樣品，按2.3項(xiàng)下方法分別制備S1～S22號(hào)供試品溶液(共22批)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得的22批樣品的圖譜數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，以柚皮苷峰為參照峰，以S12號(hào)樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正以匹配色譜峰，采用平均值法生成對(duì)照指紋圖譜，見圖2～3。結(jié)果顯示，19個(gè)色譜峰為小兒消積止咳口服液所共有，故確認(rèn)為共有峰，且共有峰面積占總峰面積的90%以上。選取柚皮苷(16號(hào)峰)作為指標(biāo)成分，計(jì)算各共有峰對(duì)指標(biāo)成分的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果見表2～3。

圖2 22批小兒消積止咳口服液的HPLC指紋圖譜

圖3 小兒消積止咳口服液的HPLC對(duì)照指紋圖譜

樣品峰號(hào)12345678910111213141516171819S10065007700870122015401620190021502240272047908380873089109631000102610611202S20066007800880122015501630190021502250273047908360871088909621000102610621204S30066007700880123015601650192021802280275048008370872089009621000102610611203S40066007700880124015801680193022002300276048108370872089009621000102610611203S50066007700880124015901680193022002300276048108370872089009621000102610611203S60066007700880124015901690193022002300276048108370872089009621000102610611203S70066007700880124015901690194022002300276048208370872089009621000102610611203S80066007700880125015701670193022302320277048608380872089009621000102610611203S90066007700880124015701670193022102300276048208370872089009621000102610611203S100066007700880124015701660192022102290275048108370872089009621000102610611203S110066007700880124015701660192022102290275048108370872089009621000102610611202S120066007700880125015801680193022202310276048208370872089009621000102610611202S130066007700880125015801680193022202300276048108370872089009621000102610611203S140066007700880125015801680193022102300276048108370872089009621000102610611203S150066007700880123015401620190021602250272047908360871089009621000102610611204S160066007700880122015401620190021702260273047908370872089009621000102610621204S170066007700880123015401630191021802260273047908360871088909621000102610621205S180066007700880124015601650192022002280274048008370872089009621000102610621204S190066007700880124015701660193022102300275048108370872089009621000102610611204S200066007700880125015801680193022202300276048108370872089009621000102610621204S210066007700880124015801680193022202300276048108360872089009621000102610611204S220066007700880124015801670193022102300276048008370872089009621000102610611204

表3 22批小兒消積止咳口服液共有峰相對(duì)峰面積

2.5.3 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，將所得的22批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)與生成的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果22批樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度依次為0.989、0.986、0.992、0.984、0.996、0.996、0.994、0.991、0.987、0.994、0.993、0.998、0.998、0.987、0.980、0.967、0.968、0.978、0.972、0.908、0.994、0.995，其相似度均在0.90以上，表明該制劑質(zhì)量穩(wěn)定，其產(chǎn)品一致性程度較高。

3 討論

小兒消積止咳口服液作為兒科用藥，為提高兒童用藥的依從性，于制劑中加入了β-環(huán)糊精、蔗糖等矯味劑。因此，在樣品溶液處理上，為減少此類矯味劑所致的分析干擾，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)醇沉原理，采用以甲醇稀釋后直接微孔濾膜濾過(guò)制備供試品溶液。結(jié)果按此法處理的樣品圖譜中檢測(cè)的成分較多，各色譜峰間比例適中，基線平穩(wěn)，樣品未經(jīng)復(fù)雜的前處理較多地保留了其中的化學(xué)成分。

根據(jù)制劑組成，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]，本實(shí)驗(yàn)比較了203、254、285、330 nm波長(zhǎng)處的樣品圖譜，結(jié)果在203 nm波長(zhǎng)下的圖譜中色譜峰相對(duì)較多，能較全面表達(dá)制劑中所含的全部化學(xué)成分，且各色譜峰間分離效果較好，基線較平穩(wěn)，故確定203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)還分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%冰乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1甲酸水溶液、甲醇-0.1%冰乙酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液共8組流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)所得色譜圖中出峰較多，各主要色譜峰峰形尖銳且峰間分離度良好，基線平穩(wěn)，因此采用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)。

本研究針對(duì)現(xiàn)有小兒消積止咳口服液質(zhì)量控制之不足，建立了該制劑的HPLC指紋圖譜，確認(rèn)了19個(gè)共有峰；通過(guò)與所生成的對(duì)照指紋圖譜對(duì)比共有峰的有無(wú)、多少，可進(jìn)一步對(duì)小兒消積止咳口服液的生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行全面質(zhì)量評(píng)價(jià)，以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、安全、有效，更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價(jià)值。

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HPLCFingerprintStudyofXiao’erXiaojiZhikeOralLiquid

FANJianwei1，2，3，LIUWuzhan1，2，3，LIYanfang1，2，3，ZHANGGuimin1，2，3，SURuiqiang1，2，3*

(1.LunanPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Linyi276006，China； 2.StateKeyLaboratoryofGenericManufactureTechnologyofChineseTraditionalMedicine，Linyi276006，China； 3.ShandongProvincialKeyLaboratoryofNewManufactureTechnologyofChineseTraditionalMedicine，Linyi276006，China)

Objective：To establish HPLC fingerprint of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid for evaluating and controlling its quality scientifically，and ensuring its production stability.Methods：The fingerprint of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid was acquired by HPLC，and the similarities of HPLC chromatograms of 22 batches of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid were analyzed by means of Fingerprint Similarity Evaluation Software(edition 2004 A)of Chinese Pharmacopoeia Commission.Results：Using the peak of naringin as a reference peak，the HPLC fingerprint common mode was established with the similarities of 22 samples all exceeding 0.90，and 19 mutual peaks were obtained and identified from 22 HPLC chromatograms.Conclusion：The method has good precision，stability and repeatability，which will be conductive to the quality control of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid.

Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid；fingerprint；HPLC

山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(2013CXC20001)

] 蘇瑞強(qiáng)，研究員，研究方向：藥品生產(chǎn)工藝技術(shù)研究與新產(chǎn)品研發(fā)；Tel：(0539)8336079，E-mail：ruiqiangsu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.024

2016-06-02)

*[