趙孟雷

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

·基礎(chǔ)研究·

番茄紅素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制△

趙孟雷*

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的：研究番茄紅素(Lycopene，LP)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌HepG2細(xì)胞，分別給予不同質(zhì)量濃度LP(5、10、20 μg·mL-1)和順鉑(40 μg·mL-1)進(jìn)行干預(yù)，48 h后通過(guò)MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡狀況，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)Bax、bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)LP或順鉑干預(yù)48 h能夠有效提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率，延長(zhǎng)細(xì)胞周期G0/G1期并縮短G2/M期，提高細(xì)胞凋亡率(Apoptosis Index，AI)，上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)bcl-2表達(dá)、提高Bax/bcl-2比值，上調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，LP上述作用均具有一定的劑量依賴性。結(jié)論：LP能夠通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡而對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與LP能夠影響細(xì)胞周期進(jìn)程并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

番茄紅素；肝癌；HepG2細(xì)胞；生長(zhǎng)；抑制

肝癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，肝癌具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移及侵襲能力強(qiáng)、惡性度高的特點(diǎn)[1-2]，我國(guó)每年約11萬(wàn)人死于肝癌，居惡性腫瘤致死率第二位，急需研究能夠有效控制肝癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)的新型藥物和新的治療方案。番茄紅素(Lycopene，LP)是一種具有抗氧化、降低血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)活性的胡蘿卜素[3-6]，且近年來(lái)LP抗腫瘤作用也逐漸得到廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注，既往研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素對(duì)肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等均具有一定的抑制作用[7-10]，茄紅素是否對(duì)肝癌具有治療作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞并給予LP進(jìn)行干預(yù)，探討番茄紅素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株(河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物研究室)；番茄紅素(南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%)；注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司)；bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥

人肝癌HepG2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)：0.25%胰酶消化、調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104·mL-1后分為空白對(duì)照組、番茄紅素組(5、10、20 μg·mL-1)和順鉑組(40 μg·mL-1)[11]，n=10；各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別給予相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，48 h后進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定

調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104·mL-1，接種于96孔板，每孔滴加20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，培養(yǎng)4 h后去上清液，加入DMSO 200 μL，振蕩10 min后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光度(A)值，計(jì)算各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

2.3 細(xì)胞周期的檢測(cè)和細(xì)胞凋亡狀況的觀察

各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，加入70%乙醇水5 mL，混勻并置4 ℃環(huán)境48 h培養(yǎng)后離心取細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌并打散細(xì)胞團(tuán)后加5μL水解酶Rnase(10 mg·mL-1)，置37 ℃環(huán)境1 h，加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用CELL Quest軟件分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相及凋亡狀況。

2.4 各組HepG2細(xì)胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)PBS溶液洗滌后行超聲裂解，低溫離心(4 ℃，12 000 r·min-1，20 min)取沉淀，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性(沸水浴加熱5 min)、上樣(每孔上樣30 μg)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3，β-actin)4 ℃過(guò)夜，洗膜，二抗(1∶100)室溫孵育1 h后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測(cè)定bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)相對(duì)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用軟件SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率的影響

MTT比色法檢測(cè)結(jié)果見表1，經(jīng)番茄紅素或順鉑干預(yù)48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率，且番茄紅素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的劑量依賴性；番茄紅素20 μg·mL-1組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于順鉑組。

表1 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率的影響

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較,△P<0.05，△△P<0.01；下同。

3.2 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表2，經(jīng)番茄紅素干預(yù)48 h能夠顯著延長(zhǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞周期G0/G1期、縮短S期和G2/M期，其中番茄紅素20 μg·mL-1組較空白對(duì)照組和順鉑組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示番茄紅素能夠阻滯細(xì)胞周期而起到抑制細(xì)胞增殖的作用。

表2 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響

3.3 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡狀況的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖1，經(jīng)番茄紅素或順鉑干預(yù)48 h，能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，數(shù)量明顯增多，番茄紅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用具有一定的劑量依賴性。各組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)結(jié)果見表3，經(jīng)番茄紅素或順鉑干預(yù)48 h能夠有效提高人肝癌HepG2細(xì)胞AI，且番茄紅素20 μg·mL-1組人肝癌HepG2細(xì)胞AI顯著高于順鉑組。

注：A.空白對(duì)照組；B.番茄紅素5 μg·mL-1組；C.番茄紅素10 μg·mL-1組；D.番茄紅素20 μg·mL-1組；E.順鉑40 μg·mL-1組。圖1 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡狀況的影響

組別AI(%) 空白對(duì)照組36±17番茄紅素5μg·mL-1組195±48??番茄紅素10μg·mL-1組430±92??番茄紅素20μg·mL-1組676±101??△△順鉑40μg·mL-1組369±68??

3.4 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)并通過(guò)灰度值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見圖3、表5，經(jīng)番茄紅素或順鉑干預(yù)48 h能夠顯著上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，顯著提高Bax/bcl-2比值；番茄紅素該作用具有一定的劑量依賴性；其中番茄紅素20 μg·mL-1組bcl-2 mRNA表達(dá)較順鉑組顯著降低，Bax/bcl-2比值顯著升高，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高。

注：A.空白對(duì)照組；B.番茄紅素5 μg·mL-1組；C.番茄紅素10 μg·mL-1組；D.番茄紅素20 μg·mL-1組；E.順鉑40 μg·mL-1組。圖3 LP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞bcl-2、Bax、 Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

組別bcl?2/β?actinBax/β?actinBax/bcl?2CleavedCaspase?3/β?actin空白對(duì)照組059±017018±006031±012008±003番茄紅素5μg·mL-1組046±013027±010058±017?025±007??番茄紅素10μg·mL-1組042±009?043±014??102±039??034±011??番茄紅素20μg·mL-1組027±008??076±019??281±085??△△046±018??△順鉑40μg·mL-1組034±011?031±009??091±040??017±005?

4 討論

目前臨床上對(duì)于肝癌的治療主要采取手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放化療的綜合治療方案[12]，但大多數(shù)患者就診時(shí)已達(dá)病程中晚期、失去手術(shù)機(jī)會(huì)，目前臨床上手術(shù)切除率僅為20%[13]，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%以上[14]，嚴(yán)重危害著人類的生命健康，以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)為切入點(diǎn)研究新型抗腫瘤藥物成為提高臨床療效的新思路。

LP是一種具有廣泛生物學(xué)活性的萘醌類化合物[3-10]，張玉江等[7]研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠抑制人肺癌H520細(xì)胞的侵襲和遷移而抑制肺癌細(xì)胞的擴(kuò)散；范現(xiàn)英等[8]總結(jié)分析發(fā)現(xiàn)LP具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用；張?chǎng)蔚萚9]研究發(fā)現(xiàn)LP能夠抑制前列腺癌LnCaP細(xì)胞增殖；于海榮等[15]研究發(fā)現(xiàn)LP能夠通過(guò)改變膜電位以及促進(jìn)內(nèi)源性活性氧的生成而抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖；魯昊等[16]通過(guò)體外培養(yǎng)人喉癌Hep-2細(xì)胞并給予番茄紅素進(jìn)行干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過(guò)改變細(xì)胞周期而起到抑制Hep-2細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LP干預(yù)治療48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率，能夠?qū)⑷烁伟〩epG2細(xì)胞阻滯于G0/G1期并提高細(xì)胞凋亡率，且LP 20 μg·mL-1劑量組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率均顯著高于順鉑組；提示LP能夠通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡而對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定抑制作用。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase和Bcl-2兩大基因家族發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，其中caspase-3是激活各種凋亡刺激因子(Apaf-1)的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及整個(gè)凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)；bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結(jié)合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細(xì)胞毒性作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[17]；Bax屬于Bcl-2基因家族成員，具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變而釋放細(xì)胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[18]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LP干預(yù)能夠有效上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)并提高Bax/bcl-2比值，上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，這可能是LP誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

總之，LP能夠通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡而對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定抑制作用，其機(jī)制可能與LP能夠阻滯細(xì)胞周期并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表達(dá)有關(guān)。

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EffectsofLycopeneonGrowthofHumanHepG2Cell

ZHAOMenglei*

(HandanCentralHospital，Handan056001，China)

Objective：To investigate the effects of lycopene on the growth of human HepG2 cell.Methods：The human HepG2 cells in logarithmic growth phase was treated with lycopene (5，10，20 μg·mL-1) groups and cisplatin (40 μg·mL-1).The cellular growth inhibition rate was calculated by MTT，cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry，the expression of Bax，bcl-2 and cleaved caspase-3 protein was detected by western blotting.Results：The cellular growth inhibition rate of human HepG2 cell in lycopene treated groups and cisplatin treated group were significantly increased，the cell cycle was arrested at G0/G1phase，the apoptosis rate was significantly increased，the expression of Bax mRNA was significantly increased，while the expression of bcl-2 was significantly decreased，and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased；the expression of Cleaved Caspase-3 protein was significantly increased；all of the effects of Lycopene above were dose-dependent with a certain.Conclusion：Lycopene has inhibitive effects on the growth of human HepG2 cells perhaps through inhibiting proliferation and inducing apoptosis；which perhaps related to its effects of altering the cell cycle and the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Lycopene；hepatic carcinoma；HepG2 cell；growth；inhibitive effects

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(1623208086ZC)

] 趙孟雷，主治醫(yī)師，研究方向：普外科疾病研究；E-mail：hdzhml@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.008

2016-11-13)

*[