韓喜國(guó)+任英+聶振波

摘 要：從目前蕨菜組織培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)狀出發(fā)，闡述了外植體、培養(yǎng)基成分、消毒方式及外源添加物對(duì)培養(yǎng)效果的影響，并對(duì)蕨類組織培養(yǎng)存在的問題、發(fā)展趨勢(shì)及前景進(jìn)行分析和討論。

關(guān)鍵詞：蕨菜；組織培養(yǎng)；影響因素；發(fā)展趨勢(shì)

中圖分類號(hào)：S647 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2017）16-0030-04

蕨菜是醫(yī)食兩用的林下野生蔬菜，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和保健功能?；谛枨罅亢统掷m(xù)性發(fā)展的要求，其繁殖方式越來越受到研究者及生產(chǎn)者的關(guān)注。目前，蕨菜人工馴化繁殖方式主要有3種：根莖繁殖、孢子繁殖和組織培養(yǎng)繁殖。根莖繁殖雖然簡(jiǎn)單易操作，成株率和成活率較高，但費(fèi)工費(fèi)時(shí)且對(duì)野生資源破壞嚴(yán)重；孢子繁殖雖應(yīng)用廣泛，但從孢子萌發(fā)到孢子體形成和生長(zhǎng)，期間所需環(huán)境條件極其嚴(yán)苛，而孢子萌發(fā)所需溫、濕度與真菌孢子萌發(fā)的條件相似，導(dǎo)致孢子繁殖成苗率低；組織培養(yǎng)是近年來備受重視的一種快速繁殖方法，它具有取材少、成苗量大、不受季節(jié)限制、速度快等優(yōu)點(diǎn)。

目前，蕨菜組織培養(yǎng)所用外植體材料可分為配子體和孢子體2類，配子體包括孢子和原葉體；孢子體包含根狀莖、葉柄、幼葉等。從適宜的外植體、培養(yǎng)基種類、成分、激素的種類及用量、有機(jī)物的添加及培養(yǎng)條件等方面對(duì)蕨類組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究。

1 蕨菜組織培養(yǎng)技術(shù)

1.1 以孢子為外植體的組培技術(shù)

一般以MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH值5.8～6.0，根據(jù)需要加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。然后將培養(yǎng)基在120℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min備用。

將采集到的成熟孢子用無菌濾紙包好，曲別針固定封口，將紙包置于70%的酒精溶液中消毒30 s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1% HgCl2消毒150 s，無菌水清洗4～5次。然后用滴管吸取孢子溶液，滴于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)室溫度控制在25℃左右，光強(qiáng)2 500～3 000 lx，每天保證16 h光照。

郭宇蘭等[1]認(rèn)為，在孢子組織培養(yǎng)的過程中，孢子萌發(fā)與無機(jī)鹽濃度有關(guān)，過高過低都不利于孢子萌發(fā)及原葉體形成，適宜的培養(yǎng)基為MS和1/2 MS；最適宜的增殖培養(yǎng)基為：1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.2 mg/L。生根率達(dá)98.6%。

1.2 以原葉體為外植體的組培技術(shù)

1/2 MS為基本培養(yǎng)基，pH值5.8，在壓力1.0～1.2 kg/cm2，經(jīng)20～25 min 高壓滅菌待用。

取成形的原葉體，用清水漂洗干凈，0.1% HgCl2消毒5～8 min，再用酒精消毒30 s，最后用無菌水沖洗3～5次，接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度20～28℃，光照時(shí)間3～10 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)時(shí)間1～2個(gè)月。最適宜的原葉體增殖培養(yǎng)基為：1/2 MS +6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L；草炭+松針土是適合原葉體生根的最佳基質(zhì)[2]。

1.3 以葉柄為外植體的組培技術(shù)

1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂

8 g/L，高溫高壓滅菌后備用。取幼嫩蕨菜葉柄沖洗凈浮土，再用洗潔精溶液浸泡10 min，之后用軟毛刷多次刷洗，用自來水沖洗至無泡沫，再用75%酒精消毒20 s，后用0.1% HgCl2消毒5 min，最后用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干表面水分后接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度

2 000 lx，光照時(shí)間為每天13 h。方利娟等[3]、姜長(zhǎng)陽(yáng)等[4]研究證明，蕨菜葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA；愈傷組織增殖最佳培養(yǎng)基是1/2 MS +0.2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)為8.07；不定苗的生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.4 mg/L IBA[3]。

1.4 以根狀莖為外植體的組培技術(shù)

采集根狀莖幼嫩先端0.5～1.0 cm，先用75%酒精浸30 s，無菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)入1.0% HgCl2中消毒5 min，再用無菌水沖冼3～5次，無菌紙吸干表面水分?；九囵B(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基附加1.0～1.5 g/L活性炭[5]。

適合誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 g/L活性炭+KT 2.0 mg/L+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

適合繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 g/L活性炭+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L。

適合壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 g/L活性炭+6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1～1.0 mg/L+GA3 0.2～0.5 mg/L+水解乳蛋白0.1%。

適合生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 g/L活性炭+NAA 0.5 mg/L[6]。

目前，在以上幾種蕨菜組織培養(yǎng)中，以孢子和根狀莖為外植體的組培技術(shù)應(yīng)用比較廣泛，且容易成功獲得組培苗。

2 影響蕨菜組織培養(yǎng)效果的因素

2.1 外植體和基本培養(yǎng)基的選擇

以孢子體為外植體，重要的是對(duì)外植體材料質(zhì)量的選擇和審定。外植體材料生理和營(yíng)養(yǎng)的不同可能會(huì)導(dǎo)致組織培養(yǎng)工作的混亂。經(jīng)過在30 余種培養(yǎng)基類型上的實(shí)踐證明，蕨菜不同類型的外植體中，以地下莖（根狀莖）最幼嫩的包括生長(zhǎng)點(diǎn)在內(nèi)的先端一小段，經(jīng)過誘導(dǎo)才具有產(chǎn)生大量不定芽的能力[6]，也最易誘導(dǎo)形成愈傷組織。選擇配子體材料進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，如果能獲得孢子，大多采用孢子作為外植體。endprint

蕨菜組培應(yīng)用的基本培養(yǎng)基大體有MS、1/2 MS、Knop、N6等，在用孢子體材料作初代培養(yǎng)或繼代增殖階段應(yīng)使用較高無機(jī)鹽濃度的基本培養(yǎng)基，1/2 MS最為常用。在孢子萌發(fā)、分化成苗、生根階段應(yīng)使用低鹽濃度的基本培養(yǎng)基，如Knop、1/8 MS等，因?yàn)楦啕}濃度往往抑制孢子萌發(fā)。全MS培養(yǎng)基對(duì)提高孢子的萌發(fā)量效果最佳。1/2 MS培養(yǎng)基則有利于蕨的組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)出綠色小球GGB，進(jìn)而誘導(dǎo)出叢生芽，分化出苗。但因蕨菜種類繁多，生育特性不同，對(duì)培養(yǎng)基成分的要求也有所不同：MS培養(yǎng)基對(duì)波士頓蕨和黑心蕨效果良好。

2.2 消毒方法對(duì)組織培養(yǎng)的影響

外植體消毒是組織培養(yǎng)技術(shù)的第一步基礎(chǔ)工作，也是最重要的步驟，消毒不徹底可能導(dǎo)致整個(gè)過程的成敗。植物組織培養(yǎng)中外植體的成活率與污染率不成一定的比例。蕨菜組織培養(yǎng)外植體消毒一般采用0.1%～1.0% HgCl2、70%～75%酒精等常用消毒劑。HgCl2雖然殺菌力強(qiáng)，但對(duì)外植體的傷害也很大，且不易去除，所以一般使用濃度不超過1.0%，而且要嚴(yán)格把握時(shí)間。李榮峰等[7]對(duì)蕨菜幼嫩莖段的消毒試驗(yàn)表明，在消毒時(shí)間相同的前提下，隨著HgCl2濃度的遞增，污染率降低，成活率先增后減，在1.0%時(shí)達(dá)到最大值；在相同的HgCl2濃度下，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率和成活率都呈下降趨勢(shì)。由此證明，高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的HgCl2消毒雖然降低了污染率，但同時(shí)也降低了成活率。另外，同樣的消毒時(shí)間和方法對(duì)不同大小的外植體效果也不同，將大塊的外植體消毒后再切成合適大小接種比把外植體切成合適大小消毒后再接種效果要好，并且成活率也較高。

2.3 外源激素對(duì)組織培養(yǎng)的影響

外源激素常用的有：植物生長(zhǎng)素GA3、IAA、NAA或IBA；細(xì)胞分裂素BA、KT等。

孢子萌發(fā)期：GA3能有效打破孢子休眠，促進(jìn)上一年常溫保存的孢子提早萌發(fā)，并能提高萌發(fā)率，而對(duì)當(dāng)年的孢子只有促進(jìn)提早萌發(fā)的作用，不能提高萌發(fā)率[8]。

愈傷組織誘導(dǎo)與增殖：在不含有任何激素的

1/2 MS 培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率極低，向培養(yǎng)基中添加了6-BA、IBA、NAA后，誘導(dǎo)率與增殖率均有所提高。方利娟等[9]的試驗(yàn)表明，0.2 mg/L的6-BA和0.4 mg/L的IBA或NAA是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳

濃度，這與周曉麗等[10]、華智銳等[11]的研究結(jié)果相近。而KT、Zip和Zeatin等細(xì)胞分裂素在適宜的水平均具有較好的誘導(dǎo)芽增殖的效果。

2.4 糖源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及世代轉(zhuǎn)換的影響

在蕨類植物的組培中，一般以蔗糖為糖源，其次為葡萄糖。高濃度的糖會(huì)抑制孢子萌發(fā)，但加入適量的糖有利于原葉體的進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。華智銳等[11]試驗(yàn)表明，1/2 MS培養(yǎng)基中加入30 g/L的蔗糖，愈傷組織誘導(dǎo)率為20.6%，比蔗糖濃度15 g/L的誘導(dǎo)率高18.4%，但有關(guān)蔗糖的最佳濃度尚無定論。糖源對(duì)蕨類植物的世代轉(zhuǎn)換也有重要的影響。一般認(rèn)為在無糖源或在低糖源水平的饑餓狀態(tài)下， 容易誘導(dǎo)無孢子生殖，而含高濃度糖的培養(yǎng)基有利于無性生殖配子體的誘導(dǎo)。

3 存在的問題及發(fā)展趨勢(shì)

盡管蕨類植物有很多組織培養(yǎng)成功的報(bào)道，但真正用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的并不多。因?yàn)樵谀壳暗霓ь惤M織培養(yǎng)技術(shù)條件下，組培苗生長(zhǎng)緩慢、污染嚴(yán)重、成活率低、成本過高、煉苗階段的小苗存活率低等，都是阻礙蕨類組培技術(shù)發(fā)展的突出問題。為此，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者將環(huán)境控制技術(shù)和組培技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來做了大量研究。

3.1 采用新技術(shù)

由于傳統(tǒng)的組培技術(shù)中使用的含糖培養(yǎng)基極易受到污染，日本千葉大學(xué)古在豐樹教授發(fā)明了一種全新的植物組培技術(shù)——無糖組培技術(shù)[12]，其優(yōu)點(diǎn)是用CO2氣體代替常規(guī)培養(yǎng)基中的糖源作為組培過程中所需要的碳源，通過環(huán)境控制技術(shù)，為組培苗提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的光、溫、水、氣、營(yíng)養(yǎng)等條件，避免了因污染而引起的損失，減少了生理及形態(tài)的異常。

3.2 改善培養(yǎng)方式

利用氣升式生物反應(yīng)器[13]進(jìn)行組織培養(yǎng)，是一種模仿蕨類植物自然生長(zhǎng)環(huán)境的培養(yǎng)方式，以蕨菜在自然界里生長(zhǎng)的土壤為基質(zhì)，做適當(dāng)調(diào)節(jié)，消毒滅菌應(yīng)用于組織培養(yǎng)。它具有更強(qiáng)的抗雜菌能力，流動(dòng)性也更為均勻，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易操作。目前，這種培養(yǎng)方式已用于蕨類生產(chǎn)。

3.3 通過培育健壯的組培苗、調(diào)控環(huán)境因素、選擇適宜的基質(zhì)來提高蕨菜組培苗的成活率

近年來，多項(xiàng)組培新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生 ，如植物開放式組織培養(yǎng)、無糖組培技術(shù)（光獨(dú)立培養(yǎng)法）、多因子綜合控制技術(shù)、新型光源的應(yīng)用等[14]，這些新技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)組培技術(shù)的缺陷，如能將其引入蕨類組織培養(yǎng)中，無疑將推動(dòng)蕨類組培技術(shù)的創(chuàng)新和在生產(chǎn)中的應(yīng)用。蕨菜種類繁多，還有許多有價(jià)值的蕨類植物需要通過組培技術(shù)進(jìn)行研究和開發(fā)，以實(shí)現(xiàn)蕨菜高品質(zhì)、低成本的規(guī)?；a(chǎn)。

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