楊睿+董卓+王夢(mèng)琪

[摘要] 目的 探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠H9C2凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制。方法 H9C2細(xì)胞傳代培養(yǎng)后進(jìn)行隨機(jī)分組。陰性對(duì)照組（正常培養(yǎng)液培養(yǎng)），H2O2損傷組（100 μmol/L H2O2作用12 h），EGCG低濃度組（10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h），EGCG高濃度組（100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h）。MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，比色法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Caspses-3及Caspase-9的表達(dá)。 結(jié)果 10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用于H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別提高到66.68%和78.63%，與H2O2損傷組（57.33%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Hoechst33258染色及流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的EGCG作用于H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率逐漸下降，與氧化損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；此外，EGCG能夠有效抑制H9C2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)。 結(jié)論 EGCG通過(guò)抑制Caspses-3及Caspase-9的表達(dá)有效抑制了H9C2細(xì)胞的氧化損傷，從而為其用于治療心肌細(xì)胞損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；H9C2細(xì)胞；Caspses-3；Caspase-9；凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R54 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（c）-0034-04

[Abstract] Objective To discuss the protective effects and possible mechanisms of epigallocatechin gallate （EGCG） in oxidative damage of rat H9C2 cells induced by oxidative stress. Methods H9C2 cells were random grouped after subcultured. There were negative control group （cultured with normal nutrient solution）， H2O2 injury group （incubated with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）， EGCG low dose group （incubated with 10 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h） and EGCG high dose group （incubated with 100 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection， apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining， apoptosis rate was detected by flow cytometry， expression of apoptosis-related factors Caspses-3 and Caspase-9 were tested by colorimetric detection. Results The cell survival rate increased to 66.68% and 78.63% after treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L EGCG compared with H2O2 injury group （57.33%）， with statistically significant difference （P < 0.05）. Hoechst33258 dying and flow cytometry technology results showed that cell apoptosis rate dropped gradually after treated with different concentration of EGCG with H2O2 injury group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Besides， the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were inhibited after treated with EGCG. Conclusion EGCG effective inhibit H9C2 cells oxidative damage by inhibiting the expression of Caspses-3 and Caspase-9， which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in myocardial cells.

[Key words] Epigallocatechin gallate； H9C2 cells； Caspses-3； Caspase-9； Apoptosis

人體的許多疾病都與細(xì)胞的氧化損傷和凋亡密切相關(guān)，其中，氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與心肌缺血、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[1-4]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從天然植物綠茶中提取的一種兒茶素單體。EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化能力，長(zhǎng)期飲用綠茶可以明顯改善心肌細(xì)胞功能，降低心肌的缺血再灌注損傷[5-6]。本研究通過(guò)在培養(yǎng)基中加入外源性活性氧H2O2誘導(dǎo)鼠H9C2心肌細(xì)胞凋亡，探索EGCG對(duì)氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡保護(hù)作用及機(jī)制。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠H9C2心肌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），EGCG（分子量：458.37832，純度≥99%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)50299），DMEM培養(yǎng)基（Sigma公司，批號(hào)D0819），30% H2O2（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20131016），CCK-8試劑盒（廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號(hào)C0038），Hoechst33258試劑盒（南京碧波生物科技有限公司，批號(hào)BA50），Annexin V FITC/PI（美國(guó)BD公司，批號(hào)556570），Caspase-3、Caspase-9試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)G015、G018）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞培養(yǎng)在100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含15%胎牛血清，培養(yǎng)箱溫度為37℃。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 H9C2細(xì)胞接種于96孔板后進(jìn)行分組。①陰性對(duì)照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；②H2O2損傷組：將培養(yǎng)融合狀態(tài)達(dá)到80%的H9C2細(xì)胞每孔加入100 μmol/L H2O2作用12 h；③EGCG低濃度組：10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h；④EGCG高濃度組：100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，隨機(jī)分為4組。細(xì)胞接種于96孔板（細(xì)胞密度5×104/mL，每孔120 μL），按上述分組方法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)孔按1∶10比例加入CCK-8液，孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm的吸光度值。每組設(shè)3復(fù)孔，取平均值。

1.2.4 Hoechst33258核染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組H9C2細(xì)胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，PBS沖洗3次并在空氣中干燥，每孔加入5 g/L的Hoechst33258染色液1 mL，室溫下于暗室內(nèi)固定20 min，吸掉染色液后空氣中干燥，于倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)（400×）?；罴?xì)胞呈均勻淡藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，熒光顯微鏡下可見(jiàn)濃染致密的顆粒狀熒光，呈亮藍(lán)色熒光。

1.2.5 Annexin V-FITC染色流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組H9C2細(xì)胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，用0.1%胰酶消化后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min離心（離心半徑500 mm） 20 min后收集細(xì)胞，用Annexin V-FITC試劑盒中binding buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/mL，分別加入Annexin和PI，混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以上操作均在暗室內(nèi)避光進(jìn)行。

1.2.6 Caspase活性檢測(cè) 胰酶消化后收集細(xì)胞，1200 r/min離心（離心半徑500 mm）10 min，PBS沖洗2次后加入30 μL細(xì)胞裂解液，置于冰上低溫孵育20 min，3000 r/min離心10 min，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行Caspase活性檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)H9C2細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)用CCK-8法進(jìn)行EGCG對(duì)H9C2細(xì)胞活性分析，發(fā)現(xiàn)H2O2損傷組H9C2細(xì)胞經(jīng)氧化損傷處理后，細(xì)胞存活率明顯下降，加入10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG后細(xì)胞存活率分別提高到66.68%和78.63%，與H2O2損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 EGCG對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33258染色法是一種檢查凋亡細(xì)胞數(shù)量的形態(tài)學(xué)染色方法，陰性對(duì)照組見(jiàn)正常細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)黑色彌散低熒光，未見(jiàn)明顯凋亡染色的細(xì)胞核，H2O2損傷組見(jiàn)散在的亮藍(lán)色類(lèi)圓形高熒光，為凋亡的細(xì)胞核；給予10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用后，亮藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)量減少，證明凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。見(jiàn)圖1（封三）。

2.3 EGCG對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡的抑制作用

流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞發(fā)生凋亡，H2O2損傷組細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。結(jié)果表明H2O2可以導(dǎo)致H9C2細(xì)胞凋亡的發(fā)生，經(jīng)10 μmol/L及100 μmol/L EGCG處理后，其凋亡率分別下降至（23.23±3.29）%和（16.23±1.94）%，與H2O2損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 EGCG對(duì)H9C2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性的影響

H2O2可以誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9表達(dá)增加，EGCG能夠有效抑制H9C2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡反應(yīng)的發(fā)生。經(jīng)10 μmol/L及100 μmol/L EGCG處理后，H9C2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9活性均下降，與H2O2損傷組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

細(xì)胞的氧化損傷與凋亡反應(yīng)互相影響，互相關(guān)聯(lián)[7-8]。當(dāng)體內(nèi)活性氧升高并打破機(jī)體平衡時(shí)，大量生成的自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激損傷與多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[11-13]。過(guò)量的活性氧可直接攻擊細(xì)胞膜及細(xì)胞器影響細(xì)胞的正常生理功能。endprint

CCK-8法是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)存活的方法。本研究利用100 μmol/L H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型，檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2 可以引起H9C2細(xì)胞存活率下降，EGCG能夠劑量依賴(lài)性的抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。Hoechst33258核染色法是一種快速簡(jiǎn)單的檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的凋亡染色方法，正常未發(fā)生凋亡的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)黑色彌散低熒光，凋亡細(xì)胞的胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的顆粒狀高熒光。本實(shí)驗(yàn)中的凋亡染色結(jié)果同樣表明，EGCG有效抑制了H2O2誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)的發(fā)生。流式細(xì)胞技術(shù)通過(guò)定量分析凋亡細(xì)胞比例檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，本實(shí)驗(yàn)中的流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8及Hoechst33258核染色法結(jié)果。

EGCG天然無(wú)毒，其抗氧化活性是維生素E的20倍，使其具有了較強(qiáng)的藥用價(jià)值，將其作為藥物應(yīng)用于人體，具有很高的安全性[14-15]。國(guó)內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)EGCG在清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡方面有一定作用[16-17]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EGCG對(duì)H9C2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

細(xì)胞代謝過(guò)程中會(huì)不斷生成氧化代謝產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)胞活性下降或者細(xì)胞功能受損時(shí)，氧化代謝產(chǎn)物會(huì)在細(xì)胞內(nèi)聚集進(jìn)一步引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。這些積累性氧化損傷是導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是心肌病變發(fā)生的一個(gè)重要原因[18]。細(xì)胞凋亡由Caspase家族的蛋白酶介導(dǎo)，對(duì)維持生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶[19-20]。本研究結(jié)果顯示，100 μmol/L H2O2作用于H9C2細(xì)胞后，Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)量均明顯上升，EGCG有效抑制了Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)，提示EGCG可能通過(guò)減少凋亡因子的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，EGCG可在體外發(fā)揮較好的抗心肌細(xì)胞氧化損傷所導(dǎo)致的凋亡作用，并且能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞。

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（收稿日期：2017-05-17 本文編輯：李岳澤）endprint