李昆+孫國平+盧豪忠

[摘要] 目的 探討曲古抑菌素A對慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）模型大鼠抑郁樣行為及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、氟西汀組和曲古抑菌素A組。采用不同應(yīng)激因子交替刺激加孤養(yǎng)復(fù)制CUMS模型；采用體重增長率、糖水偏嗜試驗(yàn)和曠場試驗(yàn)評估大鼠的行為學(xué)變化；采用Western blot測定大鼠海馬組織中BDNF和磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）的表達(dá)水平。 結(jié)果 造模21 d后，模型組大鼠體重增長率、糖水偏嗜度、水平和垂直運(yùn)動評分較正常對照組顯著降低（P < 0.05）；氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠體重增長率、糖水偏嗜度、垂直和水平運(yùn)動評分均較模型組顯著增加（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬區(qū)BDNF和p-CREB表達(dá)水平顯著低于正常對照組（P < 0.05），而氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬區(qū)BDNF和p-CREB表達(dá)水平顯著高于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 曲古抑菌素A可有效改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，其抗抑郁作用可能與調(diào)節(jié)CREB-BDNF通路促進(jìn)BDNF表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 抑郁癥；曲古抑菌素A；氟西汀；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白

[中圖分類號] R749.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Trichostatin A on behaviors and expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in model rats with chronic unpredictable mild stress-induced depression （CUMS）. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， Fluoxetine group and Trichostatin A group. The model of depression was established with alternative unpredictable stress combining isolated living conditions. The rat ethological changes were assessed by body weight， sucrose consumption and open field test. The protein expressions of BDNF and phosphorylated cAMP responsive element binding protein （p-CREB） were measured by Western blot. Results After modeling for 21 days， the body weight， sucrose consumption， horizontal motion and vertical motion scores in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）； however， these ethological indexes in Fluoxetine group and Trichostatin A group were obviously increased compared with those of model group （P < 0.05）. The results of Western blot showed that the expression of BDNF and p-CREB in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）， while the expression of BDNF and p-CREB in Fluoxetine group and Trichostatin A group were significantly higher than those of model group （P < 0.05）. Conclusion Trichostatin A can effectively improve depression-like behaviors in CUMS model rats， its anti-depressive effect may be attributed to up-regulation of the CREB-BDNF signaling pathway.

[Key words] Depression； Trichostatin A； Fluoxetine； Brain-derived neurotrophic factor； cAMP response element-binding protein

抑郁癥是一種心境障礙性精神疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響人類的精神健康和生存質(zhì)量[1]。表觀遺傳學(xué)的研究為闡明抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和尋求新的治療靶點(diǎn)提供了新的方向。組蛋白的乙?；揎検潜碛^遺傳學(xué)的重要組成部分，既往研究證實(shí)由組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）介導(dǎo)的組蛋白修飾在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。HDAC6是HDACs ⅡB類成員，研究表明HDAC6在海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性方面起著重要的調(diào)控作用，并且抑制HDAC6活性可顯著改善小鼠的抑郁樣行為，這表明HDAC6有望成為治療抑郁癥的潛在藥物靶點(diǎn)[3-4]。進(jìn)一步研究顯示，HDAC6調(diào)控神經(jīng)突觸重塑可能與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的磷酸化水平及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)相關(guān)[5-7]。曲古抑菌素A是HDAC6的一種小分子選擇性抑制劑，其在抑郁癥中的藥理作用研究鮮有報道。本研究以慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠為研究對象，通過觀察其行為學(xué)的改變以及腦內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，對曲古抑菌素A的抗抑郁作用及其對海馬CREB-BDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響進(jìn)行初步探討。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重180～200 g，7～9周齡，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（合格證號：中科動管第003號），自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1周后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)評分，選取評分相近的大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為四組：正常對照組、模型組、氟西汀組和曲古抑菌素A組，每組10只。

1.2 藥物與試劑

曲古抑菌素A和鹽酸氟西汀購自Sigma公司；磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）抗體、BDNF抗體和β-actin抗體購于Abcam公司；其他Western blot相關(guān)試劑均購自中國碧云天生物科技有限公司。

1.3 造模與給藥

正常對照組每籠5只飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食，不給予任何刺激。其余各組采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方法建立大鼠抑郁模型[8]。CUMS包含以下7種不同的刺激因子：①禁食24 h；②禁水24 h；③高速水平震蕩5 min；④晝夜顛倒；⑤4℃冷刺激5 min；⑥45℃熱刺激5 min；⑦夾尾5 min。每日隨機(jī)給予一種應(yīng)激刺激，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，應(yīng)激前10 min按分組（正常對照組：3 mL生理鹽水；模型組：造模刺激+3 mL生理鹽水；氟西汀組：10 mg/kg氟西??；曲古抑菌素A組：25 mg/kg曲古抑菌素A）腹腔注射（ip）給藥，連續(xù)21 d。

1.4 行為學(xué)評估

①體重增長率的測定：在實(shí)驗(yàn)第l天和第21天分別稱取各組大鼠體重，計算體重增長率：體重增長率=（第21天體重-第1天體重）/第1天體重。②糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)21 d后，當(dāng)晚20：30禁水，第2天早上8：30給予每只大鼠等量的1%蔗糖水和純水，測定每只大鼠1 h內(nèi)蔗糖水和純水消耗量，計算糖水偏嗜度：糖水偏嗜度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。③曠場實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入100 cm×100 cm×60 cm的四壁黑色、底壁白色的無蓋方箱內(nèi)，底面由面積相等的100個方格組成。以大鼠穿越底面格子數(shù)為水平運(yùn)動得分（每格計1分），直立次數(shù)為垂直運(yùn)動得分（雙足離開底面并放下雙足計1分）。每只動物測定1次，每次5 min。

1.5 Western blot法測定海馬組織中p-CREB和BDNF的表達(dá)

將大鼠斷頭處死后，于冰板上迅速分離兩側(cè)海馬，超聲勻漿后離心2次取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，冰浴下轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h后，加入一抗（p-CREB、BDNF和β-actin），稀釋比例均為1∶1000，4℃下孵育過夜。洗膜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯影劑曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作為蛋白表達(dá)水平的定量指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件（La Jolla，CA）進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠體重增長率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，21 d后模型組大鼠的體重增長率較正常對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；氟西汀組和曲古抑菌素A組的大鼠體重增長率較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組的大鼠體重增長率與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠糖水偏嗜度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組糖水偏嗜度比較，模型組大鼠糖水偏嗜度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠的糖水偏嗜度均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠的糖水偏嗜度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 曲古抑菌素A對 CUMS 抑郁模型大鼠曠場行為的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠海馬p-CREB表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組海馬p-CREB表達(dá)較正常對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中p-CREB表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠海馬組織中p-CREB表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

2.5 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探究曲古抑菌素A對CUMS模型大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響，本研究采用Western blot檢測了大鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖5。endprint

3 討論

表觀遺傳學(xué)是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的變化。研究表明包括組蛋白乙?；?、DNA甲基化、miRNA及l(fā)ncRNA調(diào)控在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)修飾在抑郁癥中起著重要作用[9-10]。與核苷酸序列改變引起的疾病不同，表觀遺傳變異可通過相關(guān)藥物予以逆轉(zhuǎn)，因此，對表觀遺傳修飾進(jìn)行深入研究在抑郁癥的治療中具有重要意義。既往研究表明，HDACs廣泛性抑制劑如丙戊酸鹽、丁酸鹽及環(huán)庚烷異羥肟酸（SAHA）等可顯著改善抑郁動物模型的抑郁樣行為[11-14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HDACⅡB類中的HDAC6在海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性方面起著重要的調(diào)控作用，并且特異性抑制HDAC6活性可顯著改善小鼠的抑郁樣行為。因此，研究和開發(fā)HDAC6抑制劑對于抗抑郁藥物開發(fā)具有重要的研究意義[3-4]。本研究采用CUMS抑郁模型大鼠為研究對象，以臨床一線抗抑郁藥物氟西汀作為陽性對照，考察了HDAC6選擇性抑制劑曲古抑菌素A對大鼠抑郁樣行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過21 d的CUMS抑郁造模，模型組大鼠體重增長率和糖水消耗率降低，曠場試驗(yàn)中運(yùn)動能力下降（P < 0.05）；而給予曲古抑菌素A治療的大鼠體重增長率、糖水消耗率以及曠場試驗(yàn)中的運(yùn)動能力較模型組比較顯著改善（P < 0.05），且曲古抑菌素A在實(shí)驗(yàn)濃度下抗抑郁效果與氟西汀比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示，曲古抑菌素A可顯著改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，具有顯著的抗抑郁作用。

CREB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，CREB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能受自身磷酸化的調(diào)節(jié)[15]。CREB在細(xì)胞核內(nèi)以去磷酸化狀態(tài)存在時沒有轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度升高激活蛋白激酶A（PKA）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等后可使CREB磷酸化為有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的p-CREB[16]。cAMP-CREB通路與抑郁癥密切相關(guān)，研究表明抑郁模型動物海馬cAMP-CREB通路下調(diào)，抗抑郁治療后可顯著提高其海馬區(qū)cAMP及p-CREB的蛋白表達(dá)[17]。表觀遺傳學(xué)的研究表明HDAC6可通過調(diào)控CREB影響神經(jīng)突觸重塑，這表明曲古抑菌素A的抗抑郁機(jī)制可能與調(diào)控CREB的磷酸化水平相關(guān)[6]。本研究采用Western blot檢測了各組大鼠海馬p-CREB的表達(dá)水平，結(jié)果顯示應(yīng)激抑郁大鼠海馬組織中p-CREB表達(dá)下調(diào)，而曲古抑菌素A能顯著逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠海馬p-CREB的表達(dá)下調(diào)。

BDNF是cAMP-CREB通路介導(dǎo)抗抑郁治療的重要靶標(biāo)，BDNF因其在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)中的重要作用，被認(rèn)為是抑郁癥發(fā)生的多通路調(diào)節(jié)的交匯點(diǎn)，同時也是抗抑郁治療的重要靶點(diǎn)之一[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清BDNF水平較正常人群顯著下降，抗抑郁治療可明顯提高其血清BDNF水平[20]。動物實(shí)驗(yàn)表明，抑郁模型動物海馬組織中的BDNF表達(dá)水平會發(fā)生顯著下調(diào)，給予抗抑郁藥物治療后可明顯提高海馬組織中的BDNF表達(dá)水平[21-22]。為了探究曲古抑菌素A對海馬BDNF表達(dá)的調(diào)控作用，本研究采用Western blot檢測了實(shí)驗(yàn)各組大鼠海馬區(qū)的BDNF表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬BDNF表達(dá)水平較正常對照組明顯下調(diào)，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)較模型組明顯升高，而氟西汀組和曲古抑菌素A組的BDNF表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示曲古抑菌素A的抗抑郁樣作用可能是通過增加CREB的磷酸化促進(jìn)BDNF表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究提示曲古抑菌素A能夠顯著改善CUMS 模型大鼠的抑郁樣行為，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，曲古抑菌素A可能是通過調(diào)控CREB-BDNF通路而發(fā)揮上述抗抑郁樣作用，在一定程度上為抗抑郁癥新藥物的開發(fā)提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-04-26 本文編輯：張瑜杰）endprint