鄭瑜宏+鐘鳳金+陳巖松

[摘要] 目的 評價磁珠核酸提取方法在血漿EB病毒DNA（EBV-DNA）實時熒光定量PCR檢測中應(yīng)用的性能。 方法 采用自動化磁珠法提取核酸，并結(jié)合實時熒光定量PCR測定EBV-DNA，利用第三方定值參考物質(zhì)評價該方法的檢測性能。同時選取100例鼻咽癌患者，分別用磁珠法與煮沸法定量檢測其血漿EBV-DNA，比較分析兩種方法的相關(guān)性。 結(jié)果 基于自動化磁珠法的實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測EBV-DNA，其低、中、高水平的重復性精密度均<3/5 TEa（TEa=靶值±0.4 lg），中間精密度<4/5 TEa；在5.4×101～5.4×105 U/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；最低檢測限約為3.334×101 U/mL；樣本中Hb干擾物濃度低于8.667 g/L，對磁珠法檢測結(jié)果無明顯影響。磁珠法與煮沸法的檢測結(jié)果呈線性相關(guān)，陰陽性符合率為83%。 結(jié)論 采用自動化磁珠核酸提取方法結(jié)合實時熒光定量PCR檢測血漿EBV-DNA，具備良好的檢測性能。

[關(guān)鍵詞] 磁珠法；EB病毒；核酸；提取；性能；血漿

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0013-05

[Abstract] Objective To evaluate the application performance of magnetic bead nucleic acid extraction method in real-time fluorescence quantitative PCR detection for plasma Epstein-Barr virus （EBV） DNA. Methods Automated magnetic bead method was used to extract nucleic acid， and combined real-time fluorescence quantitative PCR assays for quantitative EBV-DNA. The detection performance of the method was evaluated by using the third-party reference materials. In addition， 100 patients with NPC were selected， and the plasma EBV-DNA was quantitatively detected by magnetic beads method and boiling method. The correlation between the two methods was analyzed. Results In the automated magnetic bead method-based real-time fluorescence quantitative PCR detection system for EBV-DNA， the repeatability precision of the low， medium and high were all <3/5 TEa （TEa = target ± 0.4 lg）， and the intermediate precision were all < 4/5 Tea. In the range of 5.4×101 - 5.4×105 U/mL， there had good linear relationship. The minimum detection limit was about 3.334×101 U/mL. And the concentration of Hb interference in plasma was lower than 8.667 g/L， the results of magnetic bead test were not significantly affected. The detection results between magnetic bead method and boiling method were linearly related， and the qualitative coincidence rate was 83%. Conclusion The detection of plasma EBV-DNA by automated magnetic bead nucleic acid extraction method can achieve good detection performance.

[Key words] Magnetic bead method； Epstein-Barr virus； Nucleic acid； Extraction； Performance； Plasma

目前國際上普遍采用Taqman探針技術(shù)用于EB病毒DNA（Epstein-Barr virus DNA，EBV-DNA）的檢測，為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR法[1]，其中核酸提取純化技術(shù)是檢測的關(guān)鍵?，F(xiàn)有國產(chǎn)試劑盒核酸提取部分大多采用煮沸法，核酸提取后無任何純化步驟，不能有效去除干擾因素，且手工操作誤差大、靈敏度低，已不能滿足臨床需求。近年來磁珠法逐漸成為核酸提取的新熱點，具有抗干擾能力強、易于自動化、操作簡便、較少核酸污染及丟失等優(yōu)點。本研究計劃采用自動化磁珠法提取核酸，并結(jié)合實時熒光定量PCR檢測血漿EBV-DNA，參考臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的EP系列文件以及中國合格評定國家認可委員會（CNAS）的《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[2]，對該自建系統(tǒng)進行正確度、精密度、線性范圍、最低檢測限以及抗干擾能力等性能參數(shù)的評價，同時與常規(guī)的煮沸法進行方法學比對，評價該方法的臨床應(yīng)用價值。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血漿樣本 選取2015年4月16日～2016年1月9日在福建省腫瘤醫(yī)院首診，經(jīng)病理證實為鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的患者100例，男69例，女31例，年齡11～74歲；采集患者治療前EDTA-K2抗凝血5 mL，室溫靜置30 min后，3000 r/min×5 min水平離心，收集上層分裝，置于-80℃保存。

1.1.2 血紅蛋白溶血液 取健康體檢者EDTA-K2抗凝全血5 mL，嚴格按照EP7-A2[3]附錄F1“滲透壓致溶血程序”制備血紅蛋白（Hb）溶血液，經(jīng)血液分析儀測定Hb濃度平均值為86.67 g/L，制備完成后立即使用。

1.1.3 第三方定值參考物質(zhì) 采用“EB病毒脫氧核糖核酸（EBV DNA）液體標準物質(zhì)”（國家二級），購自廣州邦德盛公司，其低、中、高值含量分別為（5.0±1.8）×103、（5.1±1.1）×104、（5.4±1.0）×105 U/mL[標準文號GBW（E）090679～GBW（E）090681]，購入后置-80℃保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Pre-NAT全自動核酸提取工作站產(chǎn)自上海PerkinElmer公司，ABI 7500實時熒光定量PCR儀產(chǎn)自美國Life Technology公司，XN-1000全自動血液分析儀產(chǎn)自日本Sysmex株式會社，Multiskan Go超微量紫外分光光度計產(chǎn)自美國Thermo Fisher公司，凝膠電泳系統(tǒng)產(chǎn)自美國Bio-Rad公司，JS-689D全自動凝膠成像分析系統(tǒng)產(chǎn)自上海培清公司。

1.2.2 試劑 磁珠法提取使用PerkinElmer核酸提取試劑，產(chǎn)自上海浩源公司（批號EA20160201）；煮沸法提取及兩種方法擴增均使用EB病毒核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒，產(chǎn)自廣州達安公司（批號2016004）。

1.3 方法

1.3.1 磁珠法 將試劑盒內(nèi)各種試劑、耗材以及待檢樣本400 μL分別置于核酸提取工作站相應(yīng)位置，按作業(yè)指導書操作，執(zhí)行預設(shè)的自動核酸提取程序，最后得到60 μL洗脫液為核酸提取產(chǎn)物。

1.3.2 煮沸法 取待檢標本400 μL，首先加入400 μL DNA沉淀劑，振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入60 μL DNA提取液，充分振蕩1 min，瞬時離心數(shù)秒，100℃干?。?0±1）min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液為核酸提取產(chǎn)物。

1.4 DNA質(zhì)量評價

核酸提取產(chǎn)物中取5 μL/份，用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸片段完整性；另取2 μL/份用超微量紫外分光光度計測定A260與A280，計算A260/A280，比值在1.8～2.0范圍確認純度符合要求。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測EBV-DNA

將提取產(chǎn)物取4 μL/份，加入達安試劑盒內(nèi)單管單人份PCR反應(yīng)管，低速離心后，移至核酸擴增區(qū)。用核酸擴增儀進行實時熒光定量分析，PCR反應(yīng)條件、參數(shù)設(shè)定按試劑盒說明書進行。通過試劑盒自帶標準品建立定值標準曲線并計算樣品濃度值。

1.6 質(zhì)量控制

每次實驗均做室內(nèi)質(zhì)控，將達安試劑盒的3個水平陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品共同視為待檢樣本，參與核酸上樣及檢測。要求在同一實驗中4水平質(zhì)控結(jié)果均在控，實驗數(shù)據(jù)才能采用；否則該次實驗無效，需重新進行。

1.7 磁珠法性能評價

1.7.1 正確度與精密度 取低、中、高3個水平定值參考物，用磁珠法提取并檢測EBV-DNA，連測5 d，每天為一批，每批每個水平重復測3次，根據(jù)15個數(shù)據(jù)計算平均值，評估實測均值與理論值的偏倚（△lg），以及測定的重復性精密度（CVr，%）和中間精密度（CVi，%）。參照CNAS-CL36附錄A.2中對自建檢測系統(tǒng)不精密度的要求：以靶值±0.41 g作為允許總誤差（TEa），重復性精密度<3/5TEa、中間精密度<4/5TEa，表示可接受。

1.7.2 最低檢測限 取低水平定值參考物，用陰性質(zhì)控品分別稀釋至5.00×102、2.50×102、1.25×102、6.25×101、3.13×101、1.56×101、7.81×100 U/mL 7個濃度，每天每個濃度重復測2次，連續(xù)測3 d。以熒光曲線出現(xiàn)S型對數(shù)增長判為陽性，曲線無增長或者不呈S型判為陰性。根據(jù)EP17-A2[4]中關(guān)于建立檢測限（LoD）的概率單位（Probit）法：先計算每個濃度的陽性檢出率，利用SPSS軟件進行Probit回歸，當模型擬合可接受時，再通過曲線查找0.95陽性檢出率下的分析物濃度，以該值作為該方法的LoD。

1.7.3 線性范圍 取高水平定值參考物和陰性質(zhì)控品按比例精確配制成5.4×105、5.4×104、5.4×103、5.4×102、5.4×101由高到低5個濃度的待測樣品，每份樣品重復測3次取平均值。根據(jù)EP6-A[5]線性評價方法：設(shè)定重復性允許誤差為7.5%，目測沒有明顯離群值，不精密度符合要求后，使用SPSS軟件進行多項式回歸，并判斷最適多項式，當存在非線性時，以各水平濃度的線性偏差（DL）小于線性允許誤差（10%）為可接受標準。

1.7.4 抗血紅蛋白干擾能力 先將Hb溶血液與陰性質(zhì)控品按比例混合，配制成Hb濃度分別為0（對照）、21.67、43.33、65.00、86.67 g/L 5份干擾液。再取低、中、高3個水平定值參考物各360 μL，分別與40 μL不同濃度的干擾液進行混合，形成不同分析物濃度、不同干擾物濃度的待測樣本15份。每份樣品重復測3次取平均值，計算測量偏倚（%）=（干擾樣本測定值-對照測定值）/對照測定值×100%。參照CNAS-CL36附錄A.6中對抑制物的判斷標準：以測量偏倚小于±7.5%，表示未被干擾。endprint

1.7.5 方法學比對 取前述100例NPC首診患者的治療前血漿，分別采用磁珠法和煮沸法平行提取并檢測EBV-DNA，比較兩種方法檢測的陰陽性符合率、相關(guān)性等。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有測定的EBV-DNA濃度（U/mL）均經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)lg值后參與統(tǒng)計。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，線性范圍采用曲線擬合多項式回歸分析，最低檢測限采用Probit回歸分析，兩兩相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 磁珠法性能評價結(jié)果

使用第三方定值參考物質(zhì)對達安試劑盒工作標準曲線進行校準后，得到最適換算結(jié)果約為1 copies/mL=0.1 U/mL。

2.1.1 正確度與精密度 如表1～2所示，在低、中、高3個水平，磁珠法的檢測偏倚均小于允許總誤差，重復性精密度、中間精密度均符合要求，提示該法的正確度、不精密度均可接受。

2.1.2 最低檢測限 磁珠法在不同理論病毒載量下的陽性檢出率見表3。Probit回歸分析顯示，模型擬合可接受，最低檢測限在約3.334×101 U/mL。

2.1.3 線性范圍 各水平數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計后，測量不精密度均未超出允許誤差范圍（7.5%）。由P（bmax）均>0.05可知，數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計學線性。因此，磁珠法線性范圍為5.4×101～5.4×105 U/mL。見表4。

2.1.4 抗血紅蛋白干擾能力 由表5可知，血漿樣本中Hb干擾物的濃度低于8.667 g/L時，對3個水平定值參考物的檢測偏倚均小于±7.5%，表示檢測結(jié)果未被明顯干擾。

2.2 方法學比對結(jié)果

兩種方法檢測結(jié)果均陽性的樣本有78例，均陰性的樣本有5例，不符合的有17例，陰陽性符合率為83%。將兩組檢測結(jié)果做相關(guān)分析，可知二者呈線性相關(guān)，回歸方程為Y=0.324X+2.593，相關(guān)系數(shù)為R2=0.420，P=0.000。見圖1。

3 討論

近年來，隨著臨床對EBV-DNA檢測指標重視程度的逐漸提高，國內(nèi)開展EBV-DNA檢測的臨床實驗室數(shù)量越來越多，然而由于我國現(xiàn)有EBV-DNA試劑盒檢測結(jié)果不盡如人意，使得多數(shù)實驗室轉(zhuǎn)而采用自建方法進行檢測。CAP和ISO15189等認可體系都強調(diào)：新的檢測方法在應(yīng)用到患者臨床診斷之前必須進行方法學驗證，以了解該檢測的臨床表現(xiàn)，保證實驗結(jié)果可信度[6-10]。但目前在國內(nèi)血漿EBV-DNA的臨床檢測方面，關(guān)于各類方法的性能評價與驗證的相關(guān)報道還較為少見[11]。

本研究對自建的基于自動化磁珠法的血漿EBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行了方法學的性能評價，結(jié)果顯示：該方法的正確度、精密度均滿足CNAS-CL36的要求，且3個水平濃度的CVi都較小，體現(xiàn)出自動化系統(tǒng)操作穩(wěn)定的特點；該方法在5.4×101～5.4×105 U/mL范圍內(nèi)呈良好線性，最低檢測限在約3.334×101 U/mL，檢測靈敏度較高；抗干擾能力較強；而且該方法與煮沸法的檢測結(jié)果呈線性相關(guān)，陰陽性符合率達83%。提示該方法在臨床檢測過程中的分析性能穩(wěn)定、準確、可追溯，可以保證檢測結(jié)果的有效性。

進入21世紀以來，隨著高分子材料學的發(fā)展，病毒核酸的分離與提取技術(shù)不斷進步[12]。相較傳統(tǒng)的液相抽提方法，煮沸法的提取效率有所提高，但由于不能有效去除干擾物質(zhì)、提取的核酸含量較低、接近臨界值標本的提取結(jié)果不穩(wěn)定等原因，煮沸法在臨床檢測中容易產(chǎn)生假陰性[13]。而磁珠法相比煮沸法的抗干擾能力更強，因為磁珠能夠高效吸附核酸，然后通過洗滌等步驟能有效去除樣本中的干擾物質(zhì)[14]，極大地提高了試劑盒的靈敏度，降低了假陰性率。同時，煮沸法一般多采用手工提取，存在操作誤差大、結(jié)果可重復性差、容易造成交叉污染、人員工作時間長、生物安全風險大等問題。而磁珠法可以用自動化儀器進行核酸模板的提取與上樣，有效降低了手工操作帶來的污染及誤差，顯著提高了實驗效率，節(jié)約了勞動力成本。因此，自動化磁珠核酸提取系統(tǒng)必將成為今后實驗室核酸提取的一種趨勢。

由于目前國內(nèi)血漿EBV-DNA檢測項目還沒有相應(yīng)正式的實驗室間比對活動，各試劑生產(chǎn)廠商所用工作標準品均為自主定值所得，導致不同試劑盒的檢測結(jié)果間可能存在較大偏差。本研究采用了可以溯源到SI單位的標準物質(zhì)對測量系統(tǒng)進行校準以及真實性驗證，顯著提高了檢測結(jié)果的準確性和可比性，并有效保證了檢測的質(zhì)量[15]。若我國相關(guān)部門能及早建立統(tǒng)一的室間質(zhì)控品，對促進EBV-DNA檢測項目的準確化、標準化，滿足實驗室認可提出的溯源性要求，以及推進實驗室間檢驗結(jié)果的互認都將具有重要意義[16]。

[參考文獻]

[1] Le QT，Zhang Q，Cao H，et al. An international collaboration to harmonize the quantitative plasma Epstein-Barr virus DNA assay for future biomarker-guided trials in nasopharyngeal carcinoma [J]. Clin Cancer Res，2013，19（8）：2208-2215.

[2] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL36：2012醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S]. 2015.

[3] NCCLS. CLSI EP7-A2：Interference Testing in Clinical Chemistry； Approved Guideline-Second Edition [S]. 2005.

[4] NCCLS. CLSI EP17-A2：Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline-Second Edition [S]. 2012.endprint

[5] NCCLS. CLSI EP6-A：Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures：A Statistical Approach；Approved Guideline [S]. 2003.

[6] Allen TC. Quality：walk the walk [J]. Arch Pathol Lab Med，2011，135（11）：1384-1386.

[7] Allen TC，Hammond ME，Robboy SJ. Quality and the college of american pathologists [J]. Arch Pathol Lab Med，2011， 135（11）：1441.

[8] Jennings L，Van DV，Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests [J]. Arch Pathol Lab Med，2009，133（5）：743-755.

[9] Guzel O，Guner EI. ISO 15189 accreditation：Requirements for quality and competence of medical laboratories，experience of a laboratory Ⅰ [J]. Clin Biochem，2009，42（4-5）：274-278.

[10] Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation：Requirements for quality and competence of medical laboratories，experience of a laboratory Ⅱ [J]. Clin Biochem，2009，42（4-5）：279-283.

[11] 胡榮盛，薛靜俊，朱振坤，等.自動核酸提取實時熒光定量PCR檢測全血及血漿中EBV DNA載量的性能評價[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學，2013，25（8）：940-943.

[12] Thatcher SA. DNA/RNA preparation for molecular detection [J]. Clin Chem，2015，61（1）：89-99.

[13] 劉佳，徐軍，王雪飛，等.三種HBV DNA提取方法對熒光定量PCR檢測結(jié)果影響的比較[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2008，31（7）：780-783.

[14] 陸佳飛，周科隆，王縵.磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA方法的建立及其應(yīng)用研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2012，35（9）：843-850.

[15] Hayden RT，Yan X，Wick MT，et al. Factors contributing to variability of quantitative viral PCR results in proficiency testing samples：a multivariate analysis [J]. J Clin Microbiol，2012，50（2）：337-345.

[16] 李金明.臨床實驗室分子診斷的標準化[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29（6）：483-486.

（收稿日期：2017-05-19 本文編輯：程 銘）endprint