劉正峰+郭大東+李姣

[摘要] 目的 觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（F-VEP）和閃光視網(wǎng)膜電圖（F-ERG）的改變。 方法 選取雌性Lewis大鼠（6～8周）12只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各6只。實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢足底、兩側(cè)腹壁和軀干上皮下各注射含有光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（IRBP，1177-1191）和結(jié)核菌素（TB）的完全弗氏佐劑（CFA）乳化液，對(duì)照組大鼠不做處理。EAU大鼠模型制備8 d后，用眼底光學(xué)相干斷層成像術(shù)（OCT）、眼底熒光素造影（FFA）及F-VEP和F-ERG等手段觀察眼底病變情況。 結(jié)果 與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠免疫后第8天眼底彩照、OCT及FFA等檢查結(jié)果均無(wú)明顯變化。兩組F-VEP結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠F-ERG有顯著改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 免疫后第8天，EAU大鼠視網(wǎng)膜電圖已經(jīng)發(fā)生改變，表明EAU大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞已經(jīng)受到損害。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎；眼底光學(xué)相干斷層成像術(shù)；眼底熒光素造影；閃光視覺(jué)誘發(fā)電位；閃光視網(wǎng)膜電圖

[中圖分類號(hào)] R773 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the changes of flash visual evoked potential （F-VEP） and flash electroretinogram （F-ERG） in experimental autoimmune uveitis （EAU） rats. Methods 12 female Lewis rats （6-8 weeks old） were randomly divided into the control group and the experimental group with a random number table method. Each group included 6 rats. EAU models were induced by injection of interphotor-eceptor retinoid binding protein （IRBP， 1177-1191） supplemented with complete Freund adjuvant （CFA） and tuberculin （TB） at footpads， napes and back of the body； while another 6 rats without any treatment were used as normal controls. After EAU induction for 8 days， both EAU and control rats were examined by Fundus， fundus fluorescein angiography （FFA）， optical coherence tomography （OCT）， F-VEP and F-ERG techniques， respectively. Results Compared with those in control group， the results of rats in EAU group determined by fundus photograph， OCT and FFA had no apparent alterations after induction for 8 days， and no significant difference in F-VEP measurement was found between the two groups （P > 0.05）， however， there was a significant difference for the result of F-ERG between EAU and control groups （P < 0.05）. Conclusion The F-ERG in EAU rats has been apparent changed after EAU induction for 8 days， indicating that the retinal cells have been damaged.

[Key words] Experimental autoimmune uveitis； Optical coherence tomography； Fundus fluorescein angiography； Flash visual evoked potential； Flash electroretinogram

葡萄膜炎是一類主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、可引起視力嚴(yán)重?fù)p害的眼科疾病[1]，其導(dǎo)致的盲多為不可治盲[2]，因而給社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫應(yīng)答可以導(dǎo)致絕大多數(shù)的葡萄膜炎[4]。由于人體病理取材研究的困難性，因此，研究人員在體外建立了葡萄膜炎的內(nèi)源性動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）[5]。EAU是以特異性的抗原來(lái)免疫敏感品系動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種組織特異性自身免疫性疾病，誘導(dǎo)的病變主要位于葡萄膜和視網(wǎng)膜，是實(shí)驗(yàn)最常用的人類后葡萄膜炎模型，與Vogt-小柳原田（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）綜合征、人類交感性眼炎和眼結(jié)節(jié)病等有相似的臨床和病理特征[6]。1968年，Wacher和Lipton首先創(chuàng)立了EAU的動(dòng)物模型[7]。EAU是一種成熟的與人類葡萄膜炎相似的動(dòng)物模型[8]，可以通過(guò)幾種視網(wǎng)膜抗原被誘導(dǎo)，其中視網(wǎng)膜光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP）和S抗原（S-antigen，S-Ag）是實(shí)驗(yàn)室常用的免疫用特征抗原[9]。本文應(yīng)用IRBP抗原成功誘導(dǎo)了大鼠葡萄膜炎動(dòng)物模型，并通過(guò)眼底彩照、OCT、FFA及F-VEP和F-ERG等技術(shù)手段對(duì)EAU大鼠發(fā)病后眼底的改變情況進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下：endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康雌性Lewis大鼠，鼠齡為6～8周，購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.11400700037148，水糧充足，12 h光照、12 h黑暗于SPF潔凈系統(tǒng)密閉環(huán)境中飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合ARVO對(duì)于動(dòng)物在眼睛和視覺(jué)方面應(yīng)用的要求。每2只大鼠飼養(yǎng)于一籠。結(jié)核菌素（Tuberculin，TB）購(gòu)于美國(guó)Difco公司；完全弗氏佐劑（complete Freund adjuvant，CFA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；IRBP（1177-1191，氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV）由上海生工生物公司合成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和飼養(yǎng)均遵循ARVO關(guān)于眼科研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

1.2 動(dòng)物分組及EAU大鼠的誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組大鼠均為6只。EAU模型的制備參照文獻(xiàn)[10-11]方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在Lewis大鼠的后肢足底、兩側(cè)的腹壁和軀干上皮下各注射100 μL完全乳化的含有35 μg TB和35 μg IRBP的CFA。對(duì)照組注射不含IRBP多肽的TB和CFA溶液。所有實(shí)驗(yàn)均在免疫后第8天進(jìn)行。

1.3 對(duì)Lewis大鼠眼底照片、OCT和熒光造影檢查

各組大鼠實(shí)驗(yàn)前10 min滴加復(fù)方托吡卡胺散瞳，再在角膜表面滴加氧氟沙星滴眼液，然后腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉。肌肉松弛情況通過(guò)檢查四肢是否有抵抗進(jìn)行判斷。將大鼠固定于Micron Ⅳ小動(dòng)物眼底成像系統(tǒng)儀器小鼠XY調(diào)節(jié)托盤上，調(diào)節(jié)高度使眼球?qū)?zhǔn)顯微鏡頭，1檔拍攝明場(chǎng)照片。腹腔注射熒光素鈉注射液0.2 mL，2檔拍攝眼底熒光造影。眼底明場(chǎng)、眼底熒光造影同步拍攝Micron Ⅳ OCT造影檢測(cè)視網(wǎng)膜厚度。

1.4 F-VEP檢查

在完全暗室條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠首先暗適應(yīng)半小時(shí)，然后采用全視野內(nèi)閃光刺激器給予強(qiáng)度2 cd/sm2、頻率2.0 Hz的光刺激，通頻帶為1～100 Hz，疊加次數(shù)64。參考電極置于大鼠嘴里，作用電極不銹鋼針直接刺于大鼠枕部?jī)啥B線中點(diǎn)皮下，接地電極刺于大鼠右前肢皮下。試驗(yàn)時(shí)，向上的P1波和向下的N1波波形和潛伏期均非常穩(wěn)定，重復(fù)性好，在每只大鼠每只眼睛固定出現(xiàn)。N2波在部分大鼠不是很清晰，故本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)P1波和N1波進(jìn)行分析。將一只眼睛用黑布完全遮蓋，另一只眼睛進(jìn)行檢查，并記錄。以每只大鼠每只眼睛兩次檢查所得均值確定其潛伏期和波幅的99%正常值范圍（雙側(cè)屆值）。潛伏期、波幅分別以ms、μV為單位。

1.5 F-ERG檢查

在完全暗室條件下，對(duì)照組大鼠和實(shí)驗(yàn)組EAU大鼠首先暗適應(yīng)3 h以上，實(shí)驗(yàn)前10 min滴加復(fù)方托吡卡胺散瞳，然后將大鼠固定于Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統(tǒng)儀器托盤上，在角膜表面滴黏彈劑，參考電極和接地電極由不銹鋼針制成，記錄電極為0.2 mm銀-氯化銀制成的環(huán)形電極，尾部、左側(cè)頰部和左眼角膜表面分別安放接地電極、參考電極和記錄電極，采用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統(tǒng)進(jìn)行最大反應(yīng)（max-response）、振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）、桿細(xì)胞反應(yīng)（rod-response）、20 Hz閃爍反應(yīng)（20 Hz-flicker response）記錄和明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖（photopic electroretinograph，pho-t ERG）。桿細(xì)胞反應(yīng)光強(qiáng)為0.011 cd/sm2，pho-t ERG、OPs和20 Hz閃爍反應(yīng)光強(qiáng)為3.5 cd/sm2。記錄ERG的通頻帶為1～300 Hz，OPs為100～300 Hz。pho-t ERG和20 Hz閃爍反應(yīng)之前進(jìn)行10 min的明適應(yīng)（明適應(yīng)光強(qiáng)37 cd/sm2）。觀察ERG a波、b波、OPs波和20 Hz閃爍反應(yīng)P1波潛伏期和幅值的變化。應(yīng)用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統(tǒng)進(jìn)行波形幅值和潛伏期的測(cè)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼底彩照

兩組大鼠的眼底彩照未見明顯差異。見圖1。

2.2 眼底熒光造影和OCT

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均未見明顯熒光的滲漏，OCT也未見明顯變化。見圖2。

2.3 兩組F-VEP和F-ERG比較

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠均可引出典型波形呈N-P-N形狀，F(xiàn)-VEP的P1波和N1波波形和潛伏期穩(wěn)定，重復(fù)性好。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組P1波和N1波振幅差值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。F-ERG中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠a波和b波的振幅差值分別為（72.86±6.63）μV和（43.98±13.34）μV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3～4。

3 討論

VEP已經(jīng)可以成熟運(yùn)用于多種動(dòng)物模型視神經(jīng)功能的測(cè)定，在視神經(jīng)缺血[12]、視神經(jīng)損傷[13-14]、EAE等模型[15]中均有報(bào)道。VEP檢測(cè)易受儀器、麻醉深度、電極放置位置、瞳孔大小、刺激參數(shù)、溫度、環(huán)境亮度等因素影響，因而各研究機(jī)構(gòu)所得正常參考值差異較大。本實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格規(guī)定了溫度、亮度電極位置等參數(shù)，使實(shí)驗(yàn)誤差盡量減少。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組F-VEP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明EAU大鼠的視神經(jīng)沒(méi)有受到損傷。

ERG是受閃光或模式圖形刺激時(shí)從角膜電極記錄到的視網(wǎng)膜總和電反應(yīng)，即由閃光刺激引起視網(wǎng)膜各級(jí)神經(jīng)元電活動(dòng)的綜合反應(yīng)，是從視網(wǎng)膜的細(xì)胞水平來(lái)評(píng)價(jià)視神經(jīng)功能，可反映視網(wǎng)膜各個(gè)層次細(xì)胞功能狀態(tài)的客觀檢查。ERG的a波起源于視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)段，是一種超極化動(dòng)作電位，可以反映光感受器細(xì)胞的生物電活動(dòng)[16]。ERG的b波一般認(rèn)為起源于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞或雙極細(xì)胞[17]，其變化可以反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞（主要是雙極細(xì)胞）的電活動(dòng)，在視網(wǎng)膜功能的診斷上是一個(gè)可靠而靈敏的客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，EAU大鼠的a波與b波振幅明顯降低，說(shuō)明視網(wǎng)膜的細(xì)胞已經(jīng)受到了損害。endprint

OCT具有非侵入性、非接觸性等特點(diǎn)，有高分辨率的組織斷層成像優(yōu)勢(shì)[18]，可以起到與組織病理學(xué)觀察結(jié)果相一致的作用。目前，OCT已經(jīng)被應(yīng)用于EAU小鼠視網(wǎng)膜微結(jié)構(gòu)的破壞成像[19]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用OCT對(duì)葡萄膜炎大鼠的眼底進(jìn)行相關(guān)檢查，以明確葡萄膜炎大鼠眼底的改變情況。

臨床實(shí)踐中筆者發(fā)現(xiàn)，雖然葡萄膜炎的患者在治愈以后的客觀檢查中眼底并未發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性改變，但是視力卻未能提高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄膜炎大鼠的ERG發(fā)生了明顯改變，而FFA、OCT和VEP沒(méi)有變化，說(shuō)明葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展可能影響了大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能。筆者在此前的研究中，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞中出現(xiàn)髓樣小體和RPE細(xì)胞中出現(xiàn)線粒體空泡[20]。EAU大鼠ERG的改變，Müller細(xì)胞和RPE細(xì)胞的受損，可以解釋前葡萄膜炎患者在經(jīng)過(guò)治療后，視力仍然不能恢復(fù)到正常的原因。

本研究對(duì)IRBP（1177-1191）抗原和TB、CFA誘導(dǎo)的EAU大鼠的眼底病變特點(diǎn)進(jìn)行了分析，在Lewis大鼠免疫誘導(dǎo)后第8天出現(xiàn)了F-ERG的改變，說(shuō)明EAU大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞已經(jīng)受到了損害，該結(jié)果可以解釋臨床上相應(yīng)的葡萄膜炎患者的癥狀及病程進(jìn)展情況。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Li Z，Liu B，Maminishkis A，et al. Gene expression profiling in autoimmune non-infectious uveitis disease [J]. Immunol，2008，181（7）：5147-5157.

[2] 劉瑩，李林，高曉唯，等.玻璃體內(nèi)注射Infliximab 對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用[J].眼科新進(jìn)展，2012，32（5）：119-122.

[3] Gregerson DS，F(xiàn)ling SP，Obritsch WF，et al. Identification of T cell recognition sites in S-antigen： dissociation of proliferative and pathogenic sites [J]. Cell Immunol，1989， 123（2）：427-440.

[4] 劉正峰，崔彥，畢宏生.先天性與獲得性免疫在葡萄膜炎發(fā)生中病理機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2013， 31（5）：505-509.

[5] Taylor AW. Ocular immune privilege [J]. Eye（Lond），2009， 23（10）：1885-1889.

[6] 龔文容，陳震，邢怡橋.輔助性T細(xì)胞17和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎[J].華西醫(yī)學(xué)，2011，26（2）：301-304.

[7] 李洋，崔彥，畢宏生.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型[J].國(guó)際眼科縱覽，2011，4（35）：263-266.

[8] Luger D，Silver PB，Tang J，et al. Either a Th17 or a Th1 effector response can drive autoimmunity：conditions of disease induction affect dominant effector category [J]. J Exp Med，2008，205（4）：799-810.

[9] Wildner G，Diedrichs-Mohring M，Thurau SR. Rat Models of Autoimmune Uveitis [J]. Ophthalmic Res，2008，40（3-4）：141-144.

[10] Cui Y，Shao H，Sun D，et al. Regulation of Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein （IRBP）-Specific Th1 and Th17 Cells in Anterior Chamber-Associated Immune Deviation（ACAID）[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2009， 50（12）：5811-5817.

[11] Tian Q，Bi H，Cui Y，et al. Qingkailing injection alleviates experimental autoimmune uveitis in rats via inhibiting Th1 and Th17 effector cells [J]. Biol Pharm Bull，2012， 35（11）：1991-1996.

[12] Bernstein SL，Guo Y，Kelman SE，et al. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（10）：4153-4162.

[13] Ohlsson M，Svensson M. Early decompression of the injured optic nerve reduces degeneration and improves functional outcome in the adult rat [J]. Exp Brain Res，2007，179（1）：121-30.

[14] 耿文靜，方超，王廣勇，等.大鼠眼挫傷后視覺(jué)誘發(fā)電位及形態(tài)學(xué)改變的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，12（11）：1356-1358.

[15] Diem R，Sttler MB，Merkler D，et al. Combined therapy with methylprednisolone and erythropoietin in a model of multiple sclerosis [J]. Brain，2005，128（2）：375-385.

[16] Goto Y，Peachey NS，Ziroli NE，et al. Rod phototransduction in transgenic mice expressing a mutant opsin gene [J]. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis，1996，13（3）：577-585.

[17] Hood DC，Birch DG. Beta wave of the scotopic（rod）electroretinogram as a measure of the activity of human on-bipolar cells [J]. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis，1996，13（3）：623-633.

[18] Huang D，Swanson EA，Lin CP，et al. Optical coherence tomography [J]. Science，1991，22，254（5035）：1178-1181.

[19] Oh HM，Yu CR，Lee Y，et al. Autoreactive memory CD4+ T lymphocytes that mediate chronic reside in the bone marrow through STAT3-dependent mechanisms [J]. J Immunol，2011，187（6）：3338-3346.

[20] 劉正峰，崔彥，李姣，等.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的發(fā)病特點(diǎn)[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2014，32（7）：588-592.

（收稿日期：2017-02-24 本文編輯：程 銘）endprint