轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞老化及其作用機(jī)制的研究

孫晗趙亞亞裴小華趙衛(wèi)紅

目的本研究旨在明確轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)與腎臟老化之間的關(guān)系并初步探討其作用機(jī)制。方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn):自然狀態(tài)下不同年齡段C57小鼠通過(guò)腎臟免疫組化、蛋白改變來(lái)驗(yàn)證小鼠腎臟內(nèi)TGF-β1表達(dá)隨增齡發(fā)生的變化。體外實(shí)驗(yàn):不同濃度的TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞48 h,觀察老化指標(biāo)改變,并用其抑制劑Decorin進(jìn)行干預(yù)驗(yàn)證。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,小鼠腎臟內(nèi)TGF-β1的表達(dá)隨增齡而增加,幼齡組表達(dá)量很少或無(wú)表達(dá);體外實(shí)驗(yàn)中,20 ng/ml TGF-β1可明顯誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞老化,其中β-半乳糖苷酶、p53、p16等老化相關(guān)蛋白表達(dá)量均顯著增加;而加入TGF-β1抑制劑Decorin干預(yù)組,Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達(dá)減少,Smad7蛋白表達(dá)增加。結(jié)論TGF-β1在老化腎臟中表達(dá)顯著增加;其可能主要通過(guò)激活其下游信號(hào)分子Smad2、Smad3,抑制Smad7來(lái)激活腎小管上皮細(xì)胞肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用,繼而促進(jìn)了老化相關(guān)纖維化的發(fā)生。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1; 腎臟老化; 腎小管上皮細(xì)胞

老齡化已成為2l世紀(jì)不可逆轉(zhuǎn)的世界性趨勢(shì)。據(jù)預(yù)測(cè),到2037年我國(guó)老齡人口將達(dá)4億。腎臟是受老化影響最明顯的器官之一[1]。已知腎臟老化以腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化為主要表現(xiàn),而作為經(jīng)典的致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是否在腎臟老化中同樣發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,且其作用機(jī)制如何,目前尚無(wú)定論。

因此,本研究分別從體內(nèi)、外構(gòu)建老化模型,探索TGF-β1與腎臟老化之間的關(guān)系及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎近曲小管上皮細(xì)胞HK-2(美國(guó)ATCC公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康無(wú)特定病原體(healthy specific pathogen-free，SPF)級(jí)C57BL6/J小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心,體質(zhì)量16～30 g)。

1.2 方法

1.2.1 分組

1.2.1.1 不同年齡分組:(1)6周齡組(6W);(2)3月齡組(3M);(3)7月齡組(7M);(4)11月齡組(11M);(5)15月齡組(15M);(6)19月齡組(19M)。

1.2.1.2 TGF-β1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞老化分組:(1)HK2組,即本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組;(2)HK2+檸檬酸緩沖液(CB)組;(3)HK2+TGF-β1(10 ng/ml)組;(4)HK2+TGF-β1(15 ng/ml)組;(5)HK2+TGF-β1(20 ng/ml)組;(6)HK2+TGF-β1(40 ng/ml)組。

1.2.1.3 TGF-β1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞老化的機(jī)制研究分組:(1)HK2組,即本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組;(2) HK2+CB組;(3) HK2+TGF-β1(20 ng/ml)組,即老化模型組;(4) HK2+TGF-β1(20 ng/ml)+Decorin 組,即 TGF-β1抑制劑組。

1.2.2 HK2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):HK2細(xì)胞制成均勻懸液(細(xì)胞數(shù)量106/ml),在96孔板中接種細(xì)胞懸液100 μl/孔,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃、5%CO2),隨后按照10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml濃度梯度加入TGF-β1。

對(duì)照組加入相應(yīng)體積的PBS,不同TGF-β1濃度設(shè)立5個(gè)復(fù)孔,將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)48 h和72 h。取出后向每孔加入10 μl CCK-8溶液,將96板在培養(yǎng)箱中孵育3 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值。

本實(shí)驗(yàn)主要以此方法篩選出適宜的濃度和時(shí)間范圍。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色:將HK2細(xì)胞懸液接種于放置有玻片的6孔板中,按照不同濃度梯度加入TGF-β1。對(duì)照組加入相應(yīng)體積的PBS,培養(yǎng)48 h,PBS漂洗2次。用含2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在4 ℃固定5 min,然后用含1 mol/L MgCl2的PBS漂洗2次,加入SA-β-gal染色液在37 ℃孵育48 h。PBS漂洗終止反應(yīng),用伊紅套染未著色細(xì)胞胞漿。

1.2.4 western blot檢測(cè)各組蛋白水平的表達(dá):各組分別取20 μg蛋白,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后電轉(zhuǎn)移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的牛奶封閉2 h,分別用p53(1∶500;Abcam)、p16(1∶500;Abcam)、Smad2(1∶500;Proteintech)、Smad3(1∶500; Proteintech)和Smad7(1∶500; Proteintech)一抗4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后,以1∶10000稀釋的羊抗兔生物素標(biāo)記二抗,室溫孵育2 h,再次洗膜。ECL底物化學(xué)發(fā)光(Multi Sciences)顯色后機(jī)器掃描存盤,以Tanon Gis軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β1蛋白水平:采用SABC免疫組化試劑盒(SA1022),購(gòu)自武漢博士德公司。石蠟切片,二甲苯脫蠟至水,抗原修復(fù),BSA封閉,TGF-β1(Proteintech)一抗工作液濃度為1∶200,采用DAB顯色,蘇木素復(fù)染后,逐級(jí)脫水,中性樹(shù)膠封片。片中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果,每組染色均設(shè)以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1在不同年齡組小鼠中的自然表達(dá)情況

注:與6周齡組比較,*P<0.05,***P<0.001。圖1 TGF-β1在不同年齡組小鼠腎臟中的表達(dá)

western blot結(jié)果顯示: TGF-β1蛋白表達(dá)在11月齡后開(kāi)始明顯上升,19月齡時(shí)表達(dá)量最大,顯著高于6周齡組(P<0.05)(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示:隨著小鼠月齡不斷增加,棕褐色物質(zhì)表達(dá)亦增加,且呈時(shí)間依賴性;月齡最大組在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增加,見(jiàn)圖2。

圖2 不同年齡組小鼠腎臟 TGF-β1的表達(dá)(×400倍)

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞老化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 誘導(dǎo)HK2細(xì)胞老化實(shí)驗(yàn)的濃度和時(shí)間:適宜TGF-β1濃度(10～20 ng/ml)刺激HK2細(xì)胞48 h后,HK2細(xì)胞在450 nm處吸光值隨著TGF-β1濃度增加呈現(xiàn)輕度下降趨勢(shì),但當(dāng)TGF-β1濃度超過(guò)20 ng/ml時(shí),HK2細(xì)胞在450 nm處吸光值明顯下降(P<0.001)。 TGF-β1濃度超過(guò)10 ng/ml刺激HK2細(xì)胞72 h后,HK2細(xì)胞在450 nm處吸光值呈明顯下降趨勢(shì)(圖3)。因此,確定使用10～40 ng/ml濃度的TGF-β1刺激48 h,以誘導(dǎo)HK2細(xì)胞進(jìn)行老化實(shí)驗(yàn)。

圖3 HK2細(xì)胞經(jīng)不同濃度 TGF-β1刺激48、72 h后生存曲線

2.2.2 光鏡下細(xì)胞形態(tài)改變:(1)在10～20 ng/ml濃度的TGF-β1刺激HK2細(xì)胞48 h后,可見(jiàn)HK2細(xì)胞正常形態(tài)消失,變?yōu)榉蚀?、長(zhǎng)梭形樣的成纖維細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞上清中飄漂樣死亡細(xì)胞增多, TGF-β1濃度為40 ng/ml時(shí)HK2細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更為明顯(圖4)。

(2)HK2細(xì)胞經(jīng)在10～20 ng/ml TGF-β1刺激48 h,β-半乳糖苷酶染色后可見(jiàn),表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞數(shù)隨濃度增加而增多,且呈劑量依賴性(圖5);當(dāng) TGF-β1濃度為40 ng/ml時(shí),β-半乳糖苷酶因HK2細(xì)胞的減少而降低。

注:A、B示正常組HK2細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)良好,C、D、E、F示隨著 TGF-β1濃度增加,細(xì)胞凋亡逐漸增多,間隙增大,損傷程度遞增,細(xì)胞老化明顯;與HK2組比較,***P<0.001。圖4 HK2細(xì)胞經(jīng) TGF-β1刺激48 h培養(yǎng)后光鏡下形態(tài)(×100倍)

注:A、B示正常組HK2細(xì)胞,表達(dá)β-半乳糖苷酶的HK2細(xì)胞比率較少,C、D、E、示隨著 TGF-β1濃度增加,胞漿中黃綠色物質(zhì)明顯增多。F示胞漿中黃綠色物質(zhì)較E減少。圖5 HK2細(xì)胞經(jīng) TGF-β1刺激48 h培養(yǎng)后β-半乳糖苷酶染色(×100倍)

2.2.3 western blot檢測(cè)HK2細(xì)胞老化時(shí)p53、p16的蛋白水平變化:western-blot結(jié)果顯示,HK2對(duì)照組低表達(dá)p53、p16蛋白;經(jīng)不同濃度TGF-β1刺激48 h后,HK2細(xì)胞內(nèi)p53、p16蛋白表達(dá)較對(duì)照組均增加,尤以20 ng/ml組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(圖6);而40 ng/ml組中因HK2細(xì)胞凋亡較多,蛋白表達(dá)也隨之減少。

2.3 加入TGF-β1抑制劑后蛋白變化 western blot檢測(cè)HK2細(xì)胞老化時(shí)下游信號(hào)分子蛋白水平變化,結(jié)果顯示,HK2組低表達(dá)Smad2、Smad3及p53、p16蛋白,高表達(dá)Smad7蛋白;HK2+TGF-β1組(20 ng/ml)HK2細(xì)胞內(nèi)Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加,Smad7蛋白表達(dá)降低;而加入 TGF-β1抑制劑Decorin后,Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達(dá)量較HK2+TGF-β1組下降,Smad7蛋白表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05圖6 HK2細(xì)胞經(jīng) TGF-β1刺激48 h培養(yǎng)后P53、P16表達(dá)

注：與HK2+TGF-β1組比較,*P<0.05圖7 老化HK2細(xì)胞加入 TGF-β1抑制劑Decorin后下游信號(hào)分子蛋白水平變化

3 討論

老化是指生物發(fā)育成熟后,隨著年齡的增加,自身機(jī)能減退,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降,結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變,趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[2]。腎臟衰老近年得到了國(guó)內(nèi)外研究者的重視。在40歲以后,大多數(shù)人群的腎小球?yàn)V過(guò)率即以每年1ml/min的速度遞減[3]。

腎臟老化在組織形態(tài)學(xué)上,主要表現(xiàn)為局灶節(jié)段性腎小球硬化,伴毛細(xì)血管袢喪失、系膜基質(zhì)增多和基底膜增厚;腎小管間質(zhì)纖維化,管腔增大,單核細(xì)胞浸潤(rùn)等[4]。同時(shí),細(xì)胞老化現(xiàn)象也日益突出,主要表現(xiàn)為端粒縮短、多種衰老相關(guān)基因表達(dá)異常,如老化相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)增加,細(xì)胞周期阻滯,復(fù)制能力下降,老化相關(guān)異染色質(zhì)灶形成,p53、p21和p16 等細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子表達(dá)增多等[5]。可見(jiàn),腎臟老化是以腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化為主要特征,與各種原因?qū)е碌哪I臟慢性病變病理學(xué)特征相同。

TGF-β作為經(jīng)典的致纖維化因子,是一組可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的超家族。TGF-β1是TGF-β的一個(gè)亞型,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛,與腎臟疾病密切相關(guān)。本課題組及多項(xiàng)前期研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1表達(dá)增加可促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化;而抑制其與受體結(jié)合,可減緩實(shí)驗(yàn)性纖維化程度[6-7]。同時(shí), TGF-β1還有增加細(xì)胞外基質(zhì)含量、調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞增殖和分化及破壞腎小球?yàn)V過(guò)屏障等作用[8]。新近研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1其基因多態(tài)性可能與老化、長(zhǎng)壽及老年相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]。

Smads作為TGF-β1胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白家族, 是目前細(xì)胞內(nèi)唯一的TGF-β1受體直接作用底物,亦是介導(dǎo)配體與受體作用的信號(hào)，并由胞漿傳至胞核。Sato等[10]對(duì)Smad3基因敲除小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn) TGF-β1的致纖維化作用是由Smad3介導(dǎo)的。在缺乏Smad3的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞不能被 TGF-β1所趨化,進(jìn)而抑制小管上皮細(xì)胞肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和膠原的分泌,以及纖溶酶原激活抑制劑和金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá)。此外,Wang等[11]用超聲法將Smad 7 基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)Smad2和Smad3的活化被抑制,肌成纖維細(xì)胞的聚集減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原的生成也減少,這表明TGF-β1/Smad信號(hào)通路是導(dǎo)致進(jìn)展性腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵通路,且主要受Smad2和Smad3的正向調(diào)節(jié)和Smad7的負(fù)向調(diào)節(jié)。由上可知,Smad2、Smad3和Smad7是TGF-β1實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)腎臟功能的主要下游信號(hào)分子。因此,有效切斷TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是終止和減輕腎臟病變的關(guān)鍵[12]。而新近研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1的天然抑制劑Decorin主要通過(guò)Smad2、Smad3和Smad7途徑來(lái)抑制TGF-β1活性,是TGF-β1活性的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。進(jìn)而,我們猜測(cè),TGF-β1是通過(guò)上述途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟老化的調(diào)節(jié)。

因此本研究結(jié)合上述理論基礎(chǔ),分別從體內(nèi)外探討TGF-β1與腎臟老化的關(guān)系。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,小鼠腎臟內(nèi)TGF-β1的表達(dá)隨增齡而增加,幼齡組表達(dá)量很少或無(wú)表達(dá),證實(shí)了TGF-β1與腎臟老化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其可能主要以老化相關(guān)性纖維化調(diào)節(jié)腎臟老化進(jìn)程;進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中,TGF-β1可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞老化,其中β-半乳糖苷酶、p53、p16等老化相關(guān)蛋白表達(dá)量增加,且隨著TGF-β1濃度及時(shí)間的增加,老化現(xiàn)象越明顯;此外,在經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的老化腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)加入TGF-β1抑制劑Decorin后,Smad2,Smad3表達(dá)減少,Smad7表達(dá)增加,且p53、p16等老化相關(guān)蛋白表達(dá)量呈一定程度減少,初步證實(shí)了TGF-β1可能主要通過(guò)激活其下游信號(hào)分子Smad2、Smad3,抑制Smad7來(lái)誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用,繼而促進(jìn)了老化相關(guān)纖維化的發(fā)生。

另外,TGF-β1也可能從以下三個(gè)方面調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,進(jìn)而影響細(xì)胞老化。(1)作為TGF-β1調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑制因子的靶蛋白-CDK4，TGF-β1可通過(guò)抑制其翻譯來(lái)使表達(dá)下調(diào),從而調(diào)控細(xì)胞周期。(2)TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)CDK2-cyclinE活性,誘導(dǎo)靶細(xì)胞可逆地阻滯在G1期。(3)TGF-β1還可調(diào)節(jié)p15、p16和p27等抑制蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞周期[13]。由此可見(jiàn),TGF-β1通過(guò)多種機(jī)制參與腎臟的老化過(guò)程。

綜上,本研究結(jié)合TGF-β1與老化研究的新進(jìn)展,明確TGF-β1與腎臟老化之間的關(guān)系與聯(lián)系,并初步探討了TGF-β1促進(jìn)腎臟老化的作用機(jī)制,進(jìn)而為防治腎臟老化所引起的相關(guān)疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Mechanismsoftransforminggrowthfactor-β1inducedaginginHK2cells

SUNHan,ZHAOYa-ya,PEIXiao-hua,ZHAOWei-hong.

DivisionofNephrology,DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo investigate the relationship between transforming growth factor(TGF)-β1 and aging kidney, and to explore its possible mechanism.MethodsThe expression of TGF-β1 in kidney was examined by immunohistochemistry in different age groups of C57 mice. In vitro,by observing the changes of aging indicators, renal proximal tubular epithelial cell line (HK2)were stimulated with different concentrations of TGF-β1 for 48 hours or 72 hours,and intervened with TGF-β1 inhibitor.ResultsThe expression of TGF-β1 in the kidneys was increased with aging, but was little in young mice; The expression of β-galactosidase, p53, p16 and other aging-related protein were obviously increased in HK2 cells which were induced with 20 ng/ml TGF-β1. After the intervention of TGF-β1 inhibitor Decorin, the expression of Smad2 and Smad3 was decreased, Smad7 increased, while p53, p16 and other aging-related protein expression were reduced to some extent.ConclusionsTGF-β1 is significantly increased in aging kidney. It may activate the downstream signaling molecules Smad2, Smad3, inhibiting Smad7 to activate HK2 cells in myofibroblast transdifferentiation, and then promote the development of aging-related fibrosis.

transforming growth factor-β1; renal aging; renal tubular epithelial cells

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB530803);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H0511-81370843;H0511-81670677);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(JX10231801)

210029江蘇省南京市,南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年腎科

趙衛(wèi)紅,Email:zhaoweihongny@njmu.edu.cn

R 692

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.09.007

2017-04-05)